Способ получения каллусной ткани лотоса орехоносного


 


Владельцы патента RU 2429290:

Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Предприятие "АстГретта" (ООО НПП "АстГретта") (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Культивируют листовые экспланты на жидкой питательной среде, представляющей собой модифицированную питательную среду Мурасиге и Скугу. Модификация представляет собой изменение концентрации NH4NO3 до 3300 мг/л, FeSO4·7H2O до 27,8 мг/л, тиамина-HCl до 0,1 мг/л, замену метаборной к-ты на ортоборную в концентрации 6,2 мг/л, добавление Nа2ЭДТА·2 H2O в концентрации 37,3 мг/л, мезоинозита - 100 мг/л, сахарозы - 3000 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 10 мг/л, индолилуксусной кислоты - 0,8 мг/л, кинетина - 0,5 мг/л, цефотаксима - 100-300 мг/л. При этом плотность посева составляет 104-105 протопластов в 1 мл среды, а сахарозу исключают после регенерации клеточной стенки. Изобретение обеспечивает получение фитомассы лотоса орехоносного in vitro в необходимых для промышленного использования объемах. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к способам получения биомассы растений для получения сырья и создания новых фармакологических препаратов, а также может быть использовано в пищевой или косметической промышленности.

Наиболее близким по технической сущности является способ культивирования тканей женьшеня - продуцента биологически активных веществ, включающем посадку инокулюма на питательную среду, культивирование, съем биомассы и сохранение части ее для дальнейшего культивирования, в питательную среду дополнительно вносят крахмал при следующем соотношении компонентов, мг/л: KNO3 1500-2300, NH4NO3 350-450, CaCl2·2H2O 400-480, MgSO4·7H2O 350-400, KH2PO4 150-190, Н3ВО3 4,2-8,0, MnSO4·4Н2O 15,6-26,7, СоСl2·2Н2O 0,02-0,03, CuSO4·5Н2O 0,02-0,03, ZnSO4·7H2O 6,0-10,3, Na2MoO4·2H2O 0,2-0,3, KI 0,53-0,9, FeSO4·7H2O 25,3-30,6, Na2 ЕДТА·2H2O 33,6-41,0, тиамина гидрохлорид 0,15-0,25, пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6, никотиновая кислота 0,4-0,6, мезоинозит 80-120, казеина гидролизат 80-120, 4-хлорфеноксиуксусная кислота (4СРА) 0,35-0,45, сахароза 15500-20000, агар 2000-4000, крахмал 20000-30000, дистиллированная вода до 1 л (Альшевская Е.К., Булгаков В.П. и др. Заявка РФ 4953399/13 на изобретение «СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ЖЕНЬШЕНЯ». Решение о выдаче патента РФ от 20.05.1991). Однако из-за видовых различий этот способ не может быть применим для культивирования тканей лотоса орехоносного.

В Астраханской области ведется разработка косметических средств на основе Лотоса орехоносного. Ткани лотоса идут на получение косметических средств и медицинских препаратов. Для промышленного внедрения и выхода на рынок необходима сырьевая база тканей лотоса орехоносного. Промышленное производство косметики на основе экстрактов лотоса требует большого объема сырья.

Использование природного материала недопустимо по ряду причин:

- ограниченное произрастание лотоса орехоносного;

- лотос орехоносный является уникальным, реликтовым растением;

- растение находится под охраной и его промышленный сбор запрещен;

- в изготовлении косметических средств и медицинских препаратов нежелательно использование дикорастущих форм из-за адсорбирующих свойств растений.

Одним из путей получения экстрактов тканей лотоса орехоносного это культивирование фитомассы, что является более технологичным и экологически безопасным процессом. Известно, что изолированная растительная клетка сохраняет генетическую информацию родительского растения (тотипотентность). При определенных условиях, например при благоприятном температурном и световом режиме, при подборе необходимых фитогормонов делящаяся клетка in vitro дает аморфное образование - клеточную культуру, или каллус, состоящую, в основном, из недифференцированных клеток.

Способы получения и культивирования каллусной ткани лотоса орехоносного в доступных патентных и литературных источниках не обнаружены.

Получение эксплантов.

Семена растений лотоса орехоносного обрабатывают гибберелловой кислотой, скарифицируют и помещают в стеклянную емкость с температурой воды 28-29°С, воду ежедневно меняют или используют искусственную аэрацию. Емкость должна находиться на хорошо освещаемом месте. Если это невозможно применяют искусственное освещение. Длина светового дня должна соответствовать 10-12 часам. После появление первого и второго листьев необходимо регулировать объем воды в емкости, так что бы было полное покрытие листьев водой. В противном случае листья засохнут. Это связано с тем, что при культивировании растения in vitro в условиях Астраханской области воздух в помещениях слишком сухой. При достижении листьями длины 20-30 см их изолируют от растения и стерилизуют в течение 30 с в 70° спирте, а затем в течение 10 мин в 3% растворе гипохлорида натрия. После промывания листьев стерильной водой у них удаляют нижний эпидермис и разрезают на мелкие части. Нарезанные фрагменты листьев помещают в чашки Петри в смесь ферментов пектиназы и целлюлазы (0,5% пектиназы +2% целлюлазы +13% сорбитола, рН=5,4). Инкубируют фрагменты листьев в ферментной смеси в темноте или при рассеянном свете до 15-18 часов при t=27°С. После этого следует очистка протопластов от эпидермиса и листовых жилок посредством фильтрации через капроновую ткань. Отмывание протопластов от ферментов производится при последующем трехкратном центрифугировании при 170 g в течение 2 мин. Отмытые протопласты ресуспендируют в культуральной среде, содержащей 13% маннитола, до концентрации 104-105 протопластов в 1 мл. Суспензию протопластов переносят в колбы с адаптированной жидкой питательной средой с добавлением антибиотика цефотаксима, в концентрации 100-300 мг/л. Культивирование проводят при t=26-28°С в темноте или при рассеянном свете.

Образовавшиеся клеточные колонии помещают в чашки Петри с модифицированной питательной средой по Мурасиге и Скугу с добавлением антибиотика цефотаксима, с ауксинами и осмотиками (приведена в таблице 1). В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, индолилуксусную кислоту и кинетин в концентрации 0,5-10 мг/л. До того как протопласты синтезируют клеточную стенку, необходимо обеспечить в среде соответствующий уровень осмотического давления для поддержания стабильности протопластов. Для этого в питательную среду добавляют сахарозу в концентрации 3000 мг/л. После регенерации клеточной стенки и развития клеточных колоний осмотики из среды исключают. Другой важный фактор успешного культивирования протопластов лотоса орехоносного - плотность их посева, которая должна составлять 104-105 протопластов в 1 мл среды.

Таблица 1.
Состав питательной среды для выращивания клеточных колоний лотоса орехоносного
Компоненты среды Мурасиге и Скуга Содержание компонентов, мг/л
NH4NO3 3300
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
Н3ВО3 6,2
MnSO4·4H2O 22,3
СоСl2·6H2O 0,025
ZnSO4·7H2O 8,6
Na2MoO4·2H2O 0,25
KI 0,83
CuSO4·5H2O 0,025
FeSO4·7H2O 27,8
2ЭДТА·2H2O 37,3
Тиамин-HCl 0,1
Пиридоксин-HCl 0,5
Никотиновая кислота 0,5
Мезоинозит 100
Глицин 2
Сахароза 3000
pH 5,4
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 10
Индолилуксусная кислота 0,8
Кинетин 0,5
Цефотаксим 100-300

Заявляемые пределы концентрации цефотаксима определяются следующим образом. Использование концентрации ниже 120 мг/л не стимулирует процесс регенерации, а при использовании концентрации выше 250 мг/л подавляется регенерационная способность клеточных колоний.

Изобретение обеспечивает получение фитомассы лотоса орехоносного in vitro в необходимых для промышленного использования объемах. Обеспечивает регулируемость и контролируемость процесса регенерации, а также достигает стабильности в воспроизводимости результатов при улучшении его технологичности.

Использование вместо интактных растений лотоса орехоносного их клеточных культур имеет ряд преимуществ, среди которых - радикальное решение проблемы дефицита исходного сырья, возможность получения фитомассы, полностью свободной от поллютантов (гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и т.п.), открытие новых веществ, не синтезируемых обычно в растениях, индустриализация и удешевление производства, возможность управления процессом биосинтеза целевых продуктов. Помимо этого выращивание клеточной культуры растений не требует сложного оборудования и не зависит от сезонности сельскохозяйственных работ, а масштабы культивирования гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и использования в косметической и фармакологической промышленности.

Культивирование фитомассы лотоса орехоносного позволит в лабораторных условиях получать экспланты без необходимости выращивания растений в целом в искусственно созданных парниковых условиях. При этом нет необходимости выращивать целое растение, можно культивировать только те ткани, которые необходимы в производстве. Использование растительных гормонов или их аналогов позволяет изменять нормальную "программу" развития организма и добиваться необходимых изменений исходного фенотипа растения.

Таким образом, целью изобретения является разработка технологии культивирования тканей лотоса орехоносного с использованием адаптированной питательной среды.

Способ получения каллусной ткани лотоса орехоносного, включающий культивирование листовых эксплантов на жидкой питательной среде, представляющей собой модифицированную питательную среду Мурасиге и Скугу, где модификации представляют собой изменение концентрации NH4NO3 до 3300 мг/л, FeSO4·7H2O до 27,8 мг/л, тиамина-HCl до 0,1 мг/л, замену метаборной кислоты на ортоборную в концентрации 6,2 мг/л, добавление Na2ЭДТА·2 H2O в концентрации 37,3 мг/л, мезоинозита - 100 мг/л, сахарозы - 3000 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 10 мг/л, индолилуксусной кислоты - 0,8 мг/л, кинетина - 0,5 мг/л, цефотаксима - 100-300 мг/л, при этом плотность посева составляет 104-105 протопластов в 1 мл среды, а сахарозу исключают после регенерации клеточной стенки.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологической промышленности при получении тритерпеновых сапонинов и флавоноидов из клеточной культуры растения in vitro.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для накопления фармакологически ценных алкалоидов аймалина и йохимбина. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. .

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для мультипликации культур, трудно размножаемых вегетативным способом
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму продуценту стефарина
Изобретение относится к лесному хозяйству, а именно к созданию сортового плантационного лесовыращивания на основе современных инновационных биотехнологий

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной технологии, медицине и трансплантологии
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака N. tabacum L., содержащей ген uidA, включающий получение эксплантов, индукцию каллусогенеза и последующее субкультивирование. Изобретение позволяет отобрать перспективные линии, характеризующиеся максимальной скоростью роста и максимальным уровнем экспрессии гена uidA. 1 ил., 5 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP). Частицы сходны с частицами вируса гриппа. Способ включает экспрессию химерного НА вируса гриппа в растении или в части растения. Данное изобретение относится также к VLP, включающей химерный белок НА вируса гриппа и липиды растений. Изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, кодирующей химерный НА вируса гриппа, и вектору. VLP могут быть использованы для приготовления вакцин против гриппа или для улучшения существующих вакцин. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 18 н. и 19 з.п. ф-лы, 60 ил., 5 табл., 5 пр.
Наверх