Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение



Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение
Рекомбинантная плазмида pag85a-cbd, штамм escherichia coli [prep4, pag85a-cbd], химерный белок ag85a-cbd и их применение

 

C12N15 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2429292:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии. Получают синтетический ген Ag85A Mycobacterium tuberculosis, оптимизированный для гетерологичной экспрессии в непатогенных лабораторных штаммах. На его основе получают рекомбинантную плазмиду pAg85A-CBD, состоящую из искусственного бактериального оперона химерного белка, включающего промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, ген химерного белка и терминатор транскрипции; бактериального оперона бета-лактамазы и бактериального участка инициации репликации типа ColE1. Изобретение также включает штамм Escherichia coli - продуцент химерного белка Ag85A-CBD, а также способ иммобилизации, концентрирования и очистки полученного белка на целлюлозе. Изобретение относится к самому рекомбинантному белку Ag85A-CBD и иммуногенной композиции, содержащей его, направленной на индукцию иммунитета против туберкулезной инфекции. Изобретение позволяет получать штамм-продуцент, обеспечивающий высокий уровень продукции устойчивых иммуногенных белков, которые могут быть получены, иммобилизованы и очищены в одну стадию, а также получать эффективные иммуногенные композиции против туберкулеза. 7 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии.

В настоящее время единственной применяемой в мире вакциной против туберкулеза является БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin, 1921 г.), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога и достаточно эффективно защищает детей как от заражения туберкулезом, так и от милиарного туберкулеза и туберкулезного менингита. Однако BCG не защищает взрослых от легочного туберкулеза, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Отсюда следует высокая актуальность разработки новых вакцин против туберкулеза.

Существует несколько направлений разработки новых противотуберкулезных вакцин, альтернативных БЦЖ: субъединичные вакцины, ДНК-вакцины и живые вакцины с улучшенными свойствами. Наиболее полно в экспериментальных моделях на животных охарактеризованы субъединичные вакцины, в том числе препараты, состоящие из нескольких секретируемых белков/пептидов Mycobacterium tuberculosis (Doherty Т.М., Olsen A.W., Weischenfeldt 1 J. et al. Comparative Analysis of Different Vaccine Constructs Expressing Defined Antigens from Mycobacterium tuberculosis. The Journal of Infectious Diseases, 2004, Vol.190, pp.2146-2153). Идентифицировано много антигенов М.tuberculosis, потенциально важных в качестве компонентов новых вакцин. К ним относятся, в частности, иммунодоминантные секретируемые антигены, присутствующие в культуральном фильтрате М.tuberculosis. Среди секретируемых антигенов М. tuberculosis лучше всего изучены антигены ESAT-6 (Early Secret Antigen Target-6), CFP-10 (culture-filtrate protein-10) и белки комплекса 85 (Ag85A, В, С).

Близкородственные белки Ag85A, В, С кодируются тремя отдельными генами, присутствующими во многих штаммах микобактерий, в том числе в вакцинном штамме BCG (Wiker H.G., Harboe M. The Antigen 85 Complex: a Major Secretion Product of Mycobacterium tuberculosis. Microbiol. Reviews., 1992, Vol.56, No.4, pp.648-661). Антигены 85 также участвует в формировании Т-клеточного ответа у лиц, инфицированных М.tuberculosis (Launois P, DeLeys R, Niang MN, et al. Т cell epitope mapping of the major secreted mycobacterial antigen Ag85A in tuberculosis and leprosy. Infect. Immun., 1994, Vol.62, pp.3679-3687).

Задачей изобретения является разработка вакцинных препаратов на основе отдельных белковых компонентов с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих белков в бактериальной системе, с высокой степенью очистки и стабильности компонентов.

Для решения этой задачи используется конструирование химерных белков за счет соединения в одной рамке трансляции двух генов - гена для вакцинирующего белка и гена для белка-носителя, что приводит к синтезу в бактериальной системе химерного белка. Были созданы рекомбинантные белки, состоящие из двух компонентов: антигена М. tuberculosis и целлюлозо-связывающего домена CelD из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum (CBD). Рекомбинантные белки, имеющие в своем составе CBD, можно в одну стадию иммобилизовать на целлюлозном носителе. В результате происходит их одновременная очистка, концентрирование и стабилизация, а также обеспечивается защита от протеаз бактерий-продуцентов. При этом исходные антигенные свойства функционально активного белкового домена не нарушаются.

Кроме того, был получен синтетический ген Ag85A. Для обеспечения высокого уровня экспрессии данного гена в гетерологичной системе проводили оптимизацию кодонов. В результате был спланирован синтетический ген Ag85A, который отличался от нативного микобактериального гена по нуклеотидному составу при сохраненной аминокислотной последовательности кодируемого им белка Ag85A. Этот прием позволил получить высокоэффективный штамм-продуцент, синтезирующий до около 15-20% рекомбинантного антигена Ag85A от суммарного белка клетки.

При использовании этих подходов был получен двухкомпонентный рекомбинантный белок. Последовательность гена М. tuberculosis Ag85A кодирует полноразмерный белок, который формирует первый белковый домен, определяющий функциональные иммунологические свойства комплексной молекулы. Далее следует соединяющая (спейсерная) аминокислотная последовательность из нескольких чередующихся остатков глицина и серина (Gly-Ser). Второй белковый домен кодируется последовательностью гена эндоглюканазы CelD A.thermophilum; он определяет способность продукта взаимодействовать с целлюлозным сорбентом. Белковые продукты нарабатываются в непатогенных лабораторных штаммах Е.coli. Иммобилизированные на целлюлозе антигены представляют собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белками. Целлюлозный носитель выступает в роли адъюванта при иммунизации, обеспечивающего укрупнение, полимеризацию антигена, без которого развивается более слабый иммунный ответ на белковые моно-антигены. Антигены в свободном состоянии представляют собой растворы с определенной ионной силой, свободные от примесей липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента.

Очистка конечных продуктов от высокотоксичных для организма липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов является важной проблемой.

Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет получить оптимальный для гетерологичной экспрессии синтетический ген Ag85A, создавать штамм Е. coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка, содержащего белок М. tuberculosis Ag85A; получить простую и эффективную схему очистки рекомбинантного белка, специфически и эффективно индуцирующего иммунный ответ на антигены микобактерий, в том числе синтез ИФН-гамма, необходимый для противотуберкулезной защиты; создавать иммуногенные композиции на основе рекомбинантного белка на целлюлозном носителе (адъювант).

Указанный результат достигается за счет синтеза рекомбинатного белка Ag85A-CBD в клетках рекомбинантного штамма Е. coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD], несущего рекомбинантную плазмиду pAg85A-CBD. Также за счет создания комплексного препарата Ag85A-CBD-целлюлоза, в котором рекомбинантный белок Ag85A-CBD (концентрация 5,21 мг/мл) иммобилизован на целлюлозе (по массе 2,8% в препарате) и ресуспендирован в 1× PBS буфере pH 7,2-7,4.

Сущность изобретения состоит в том, что плазмида содержит следующие существенные для ее функционирования структурные элементы:

а) синтетический ген, кодирующий последовательность белка Ag85A М. tuberculosis (912 п.н.);

б) искусственный бактериальный оперон химерного белка, состоящий из:

- промоторной области раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающей эффективную транскрипцию мРНК;

- рекомбинантного гена, кодирующего химерный белок «последовательность белка Ag85A М. tuberculosis - спейсер - целлюлозо-связывающий домен А. thermophilum» - Ag85A-CBD (117-1628 п.н.);

- нетранслируемой области терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающей эффективное окончание транскрипции pAg85A-CBD (1659-1665 п.н.);

в) бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, селективный маркер для трансформации штамма Е. coli pAg85A-CBD (3826-4686 п.н.) комплементарной цепи;

г) бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штамме Е. coli: pAg85A-CBD (3063-3074 п.н.).

Таким образом, создана рекомбинантная плазмида pAg85A-CBD (4891 п.н.), кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок Ag85A-CBD, обладающий способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентом. Плазмида содержит следующие структурные элементы: искусственный бактериальный оперон химерного белка, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (80 п.н.), ген химерного белка Ag85A-CBD (1511 п.н.) и терминатор транскрипции (94 п.н.); бактериальный оперон бета-лактамазы (860 п.н.) и бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (11 п.н.). Штамм-продуцент рекомбинантного белка Ag85A-CBD получают трансформацией клеток Е. coli штамма M15 [pREP4] плазмидой pAg85A-CBD. Штамм обеспечивает продукцию рекомбинантного белка Ag85A-CBD после проведения процедуры индукции (изопропил-β-D-тио-галактопиранозидом) (ИПТГ) до 12-15% от тотального белка клетки.

Штамм Е.coli M15 [pREP4], несущий плазмиду pAg85A-CBD, - продуцент бифункционального рекомбинантного белка Ag85A-CBD характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 2,0% агаризованной средой LB рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-агар, МПА, МПБ).

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от +4°С до +42°С, при оптимуме pH 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагает сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данного штамма является его чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляет устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pAg85A-CBD, и к канамицину (до 50 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.

По созданию комплексного препарата рекомбинантного белка и аморфной целлюлозы технический результат достигается за счет создания двухкомпонентного рекомбинатного белка Ag85A-CBD, состоящего из белка Ag85A M.tuberculosis и гена эндоглюконазы CelD A.thermophilum. А также за счет получения комплексного препарата (иммунологической композиции), в котором рекомбинатный белок (Ag-CBD) иммоблизован на аморфной целлюлозе (Ag-CBD-целлюлоза).

Рекомбинантный белок Ag85A-CBD имеет в своем составе домен, определяющий его способность связываться с целлюлозой, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на целлюлозе. Иммобилизация на целлюлозе обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке целлюло-зосвязывающего домена эндоглюконазы CelD из термофильного микроорганизма A. thermophilum, который обладает высоким сродством к кристаллической и аморфной целлюлозам и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений pH 4-11, температуры: от 0 до +75°С и концентраций NaCl: от 0 до 5 М.

Поскольку в Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с целлюлозой, то синтезируемый в клетках Е. coli, трансформированных плазмидой pAg85A-CBD, рекомбинантный белок Ag85A-CBD является единственным белком штамма-продуцента, прочно связывающимся с целлюлозой. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата белка, иммобилизованного на сорбенте.

Была исследована иммуногенность комплексного препарата Ag85A-CBD-целлюлоза на мышах двумя методами. Во-первых, мышей иммунизировали в подушечки задних лап и через 18 дней сравнивали пролиферативный ответ Т-клеток с ответом мышей, которых иммунизировали только CBD-целлюлоза. Был выявлен выраженный специфический иммунный ответ на антиген, с индексами пролиферации опыт : контроль = 5-7. В другой схеме мышей иммунизировали под кожу спины 2-кратно с 2-недельным интервалом иммуногенным и контрольным препаратом. Через 5 недель был исследован пролиферативный ответ Т-клеток и количество Т-клеток, продуцирующих ИФН-гамма. Был выявлен 2-3-кратный прирост ИФН-гамма-положительных Т-клеток и 4-кратное усиление пролиферации в присутствии антигена в культуре клеток по сравнению с контрольными животными.

Для проверки протективной активности исследуемых препаратов иммунные к антигену Ag85A (иммунизация препаратом Ag85A-CBD-целлюлоза), а также контрольные животные (иммунизация CBD-целлюлоза и физиологический раствор) были заражены внутривенно вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv в дозе 5×106 КОЕ/мышь. Через 3 недели после заражения по 4 мыши из каждой группы были забиты и гомогенаты органов были посеяны на чашки Петри с агаром Дюбо. В легких и селезенках мышей, иммунных к Ag85A, наблюдалось 5-кратное уменьшение бактериальной нагрузки по сравнению с контрольными животными.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является получение штамма-продуцента, обеспечивающего высокий уровень продукции устойчивого иммуногенного белка, который может быть получен, иммобилизован и очищен в одну стадию. Получена эффективная иммуногенная композиция против туберкулеза.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, приведенными ниже. Генно-инженерные и микробиологические манипуляции, амплификацию и секвенирование ДНК проводили по стандартным методикам (T.Parish, N.G.Stoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., М.: Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, Vol.239, No.4839, pp.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNAsequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase/nucleotide sequences/bacteriophage 4Х174). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, Vol.74, No.12, pp.5463-5467).

Пример 1. Получение плазмиды.

а) Получение фрагмента гена белка М. tuberculosis.

Синтетический ген белка Ag85A был спланирован на основе последовательности белка таким образом, что нуклеотидный состав кодонов был оптимизирован для гетерологичной экспрессии в непатогенном лабораторном штамме Е. coli, a аминокислотный состав синтезируемого рекомбинатного белка не изменялся. Для клонирования фрагмента ДНК последовательность гена была фланкирована сайтами эндонуклеаз рестрикции BamHI, BspMII (Kpn2I) (данные не представлены).

Фрагмент гена белка Ag85A был синтезирован твердофазным амидофосфитным методом (ЗАО «Евроген», РФ) на синтезаторе Applied Biosystems ABI 3900 с последующим клонированием ДНК дуплекса в pAL-TA вектор. Первичную структуру полученной конструкции подтверждали секвенированием. Для последующего переклонирования фрагмента гена ag85A в экспрессионный вектор в его последовательности были введены сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI, BspMII (Kpn2I), BglII, PvuI, а также кодоны инициации и терминации трансляции.

б) Получение плазмиды, содержащей последовательность гена микобактериального белка, Gly-Ser спейсера и целлюлозо-связывающего домена CBD.

Для получения конструкции, кодирующей последовательность гена белка М.tuberculosis Ag85A, Gly-Ser спейсера, и целлюлозо-связывающего домена CBD, плазмиду pALTA-Ag85A гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BglII и PvuI при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ хлорида магния, 100 мМ хлорида натрия и 0,1 мг/мл BSA, в течение 1 часа. Плазмиду pspCBD (ptt10), кодирующую последовательность Gly-Ser и целлюлозо-связывающего домена, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI и BglI при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (pH 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1 часа. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенные из агарозного геля фрагменты рестрикции плазмидных ДНК pALTA-Ag85A (1630 п.н.) и pspCBD (3261 п.н.) лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Методом электропорации полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli M15 [pREP4]. После трансформации клоны отбирали на агаризованнной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин и канамицин. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BamHI, BglI, BgLII, NcoI, PvuI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pAg85A-CBD (4891 п.н.), содержащей в своем составе последовательность туберкулезного белка, Gly-Ser спейсера, и целлюлозо-связывающего домена CBD. Первичную структуру полученной конструкции подтверждали секвенированием. На фиг.1 приведена схема плазмиды pAg85A-CBD.

Пример 2. Конструирование штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного антигена М. tuberculosis, соединенного с целлюлозосвязывающим доменом.

Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка Ag85A-CBD, клетки штамма Е. coli M15 [pREP4] трансформировали плазмидой pAg85A-CBD. Трансформированные клетки выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм (около 2,5 ч). В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ, IPTG) и выращивали в течение 3 ч. Для контроля продукции рекомбинантного белка в штамме Е. coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD] применяли метод электрофореза по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, pH 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, pH 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте.

При сравнении спектра белков в штаммах Е. coli M15 [pREP4], Е. coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой составила 54,1 кДа, что соответствовало расчетной для белка Ag85A-CBD. Уровень синтеза белков в Е.coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка-стандарта Unstained Protein Molecular Weight Marker («Fermentas», Литва).

Для проверки растворимости синтезируемого белка биомассу выращенного штамма Е. coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD] подвергали разрушению в 1% TES буфере (25 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 5 мг/мл лизоцим) в соотношение биомасса-буфер 1:2 и гомогенизировали до однородной массы. После центрифугирования пробы разделяли на 2 фракции: растворимых клеточных белков (надосадочная жидкость) и нерастворимых (осадок). Обе фракции подвергали разрушению в лизирующем буфере (0,05 М Трис-HCl, pH 6.8, 0,5% Triton X-100, 0,5 М NaCl, 0,25 М MgCl2, 5 мг/мл лизоцим, 10 мг/мл PMSF, 20 мг/мл ДНКаза) в соотношении 1:1; гомогенизировали до однородной массы; прогревали при +95°С 15 мин. Результаты контролировали с помощью электрофореза по Лэммли. Было показано, что рекомбинантный белок Ag85A-CBD синтезируется в клетках Е. coli как в растворимой фракции, так и виде телец-включений.

Пример 3. Получение рекомбинантного белка Ag85A-CBD в свободном состоянии и иммобилизованного на целлюлозе.

Для получения рекомбинантного белка культуру штамма Е. coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 100 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 об/мин в течение 15 мин.

Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,15 мМ PMSF, 0,1% Тритон-Х100, 0,5 мг/мл лизоцима, 20 мг/мл ДНКазы; из расчета 1 г биомассы на 4 мл буфера. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 20 сек. После центрифугирования при 16000 об/мин в течение 30 мин фракция нерастворимых клеточных белков оставалась в осадке, растворимых - в надосадочной жидкости.

Осадок (нерастворимая фракция) суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 10 мМ ЭДТА, 0,002 объема β-меркаптанола) и добавляли равный (по массе) объем мочевины. После перемешивания выдерживали на водяной бане при +37°С до полного растворения мочевины. Центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин и отбирали надосадочную жидкость. Для очистки рекомбинантных белков надосадочную жидкость переносили на колонку с микрокристаллической целлюлозой (Perloza MT-200, «Iontosorb», Czech Republic). Элюцию белков с целлюлозы проводили раствором 8 - 2 М мочевины и 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0). Для удаления мочевины образцы диализовали против PBS буфера при 25°С в течение ночи.

Растворимую фракцию белков использовали для иммобилизации на инъекционной (аморфной) целлюлозе. К надосадочной жидкости добавляли 1/3 объема 30% суспензии целлюлозы и буфер, содержащий 0,5% Тритона Х-100, 0,5 М NaCl; инкубировали при 25°С 1 ч. Центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в том же буфере; отмывку целлюлозы повторили 2 раза. Осадок ресуспендировали в PBS буфере. В иммобилизованном на сорбенте состоянии белки представляют собой суспензию.

Концентрацию белков в свободной и иммобилизованной формах определяли по Бредфорду при длине волны 595 нм. Для определения % содержания целлюлозы в пробах, где белки были иммобилизованы на сорбенте, образцы подвергали лиофилизации в течение двух дней с последующим пересчетом полученных масс. Таким образом, были получены следующие комплексные препараты (иммуногенные композиции) (Ag-CBD, Ag-CBD-целлюлоза), степень чистоты которых составила не менее 95%:

№ п/п Название образца Концентрация белка в образце, мг/мл % целлюлозы в образце
1 Ag85A-CBD 5,18 нет
2 CBD 1,36 нет
3 Ag85A-CBD-целлюлоза 5,21 2.8
5 CBD-целлюлоза 5,6 2,8
6 целлюлоза нет 2,8

Пример 4. Способ проверки иммуногенности комплексных препаратов Ag-CBD-целлюлоза на мышах.

Самкам мышей инбредной линии мышей I/St, генетически чувствительных к туберкулезу (Nikonenko BV, Averbakh MM, Lavebratt С, Schurr E, Apt AS. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tubercle Lung Dis, 2000, 80:15-25), вводили подкожно с двухнедельным интервалом следующие препараты: 1) Ag85A-CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию Ag85A); 2) CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию CBD) - отрицательный контроль; 3) однократно вакцина BCG (106 КОЕ на мышь) - положительный контроль. Через 5 недель оценивали содержание в селезенках Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-гамма в присутствии соответствующих антигенов в культуральной жидкости методом ELISPOT, с подсчетом клеток, реагирующих с антителами анти-ИФН-гамма, через 60 часов после начала культивирования. Результаты приведены в таблице:

Вакцинация Количество продуцентов ИФН-гамма на 1 млн клеток селезенки
Без антигена в культуре 10 мкг/мл антигена в культуре*
Ag85A-CBD-целлюлоза 10±3 45±14
BCG 31±3 70±7
CBD-целлюлоза 4±2 17±3
*В контрольных группах (вакцинация BCG и CBD-целлюлозой) в качестве антигена использовался ультразвуковой дезинтеграт микобактерий, т.е. смесь многих антигенов, поскольку стимуляция BCG поликлональна.

Результаты показывают, что вакцинация моноантигенами, связанными с целлюлозой через CBD-домен, приводит к специфической активации продуцентов ИФН-гамма. Вакцинация теми же антигенами, в тех же количествах, но без адсорбции на целлюлозе, не вызывает иммунного ответа (данные не приводятся).

Пример 5. Способ проверки защитного эффекта против туберкулеза комплексных препаратов Ag-CBD-целлюлоза на мышах.

Мышей инбредной линии C57BL/6 вакцинировали препаратами Ag85A-CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию Ag85A); 2) ЕSАТ-6-СВО-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); 3) CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию CBD - отрицательный контроль 1); 4) физиологическим раствором (отрицательный контроль 2) дважды, подкожно, с интервалом 2 недели. Через 5 недель после второй вакцинации мышей заражали внутривенно в дозе 5×106 КОЕ вирулентного штамма М.tuberculosis H37Rv. Через 4 недели после заражения из каждой группы забивали по 4 мыши и проводили оценку размножения микобактерий в легких и селезенке методом посева гомогенатов органов на агар Дюбо с последующим подсчетом колоний. Оставшиеся мыши (8 в каждой группе) наблюдались для определения кривых выживания. Результаты приведены на Фиг.2. Установлено, что вакцинация специфическими антигенами на целлюлозном сорбенте достоверно снижает число микобактерий в органах (Фиг.2А, Р<0,01, непарный тест Стьюдента) и продлевает срок жизни зараженных животных (Фиг.2Б, Р<0,01, критерий Гоханадля кривых выживания). Оценка параметров иммунного ответа у мышей:

- Пролиферативная активность Т-лимфоцитов CD4+ в тестах in vitro;

- Увеличение в результате иммунизации количества клеток иммунной системы, продуцирующих ИФН-гамма;

- Снижение количества вирулентных микобактерий в легких и селезенке зараженных мышей;

- Увеличение сроков выживания мышей после заражения.

1. Синтетический ген Ag85A M.tuberculosis (912 п.н.), кодирующий белок Ag85A M.tuberculosis, с нуклеотидной последовательностью №1, с кодонами, оптимизированными для гетерологичной экспрессии в штамме Е. coli.

2. Рекомбинантная плазмида pAg85A-CBD с нуклеотидной последовательностью №2, обеспечивающей экспрессию рекомбинантного белка Ag85A-CBD, состоящего из рекомбинатного белка Ag85A M.tuberculosis, Gly-Ser спейсера, целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из A.thermophilum, размером 4891 п.н., состоящая из следующих структурных элементов:
- искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка Ag85A- CBD, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), синтетический ген рекомбинантного белка Ag85A-CBD (117-1628 п.н.), нетранслируемую область терминации транскрипции (1665-1759 п.н.);
- бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампицилину (3826-4686 п.н.);
- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (3063-3074 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е. coli.

3. Рекомбинантный штамм Е.coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD], полученный трансформацией плазмидой по п.1, продуцент белка Ag85A-CBD, депонированный в ВКПМ под номером ВКПМ 10534.

4. Способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка Ag85A-CBD на целлюлозе, включающий:
- выращивание клеток штаммов Е.coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD] по п.2;
- иммобилизацию белка Ag85A-CBD в составе клеточных экстрактов штамма Е.coli M15 [pREP4, pAg85A-CBD] на целлюлозном сорбенте за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков, при этом происхоит концентрирование целевого продукта и его очистка;
- выделение целевого продукта.

5. Рекомбинантный белок Ag85A-CBD с молекулярной массой 54,1 кДа (pI 5,88), включающий полноразмерный белок Ag85A с последовательностью №3, Gly-Ser спейсер с последовательностью №4, целлюлозосвязывающий домен гена эндоглюканазы CelD из A.thermophilum с последовательностью №5.

6. Иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантный белок по п.5 Ag85A-CBD, иммобилизованный на целлюлозе в эффективном количестве, специфически активирующая Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий.

7. Способ проверки протективных свойств иммуногенной композиции по п.5 в отношении туберкулезной инфекции в модели туберкулеза у мышей, включающий:
а) вакцинацию мышей инбредной линии C57BL/6 дважды, подкожно, с интервалом 2 недели препаратами: иммуногенная композиция по п.5 из расчета 10 мкг на мышь по содержанию действующего вещества; CBD-целлюлоза из расчета 10 мкг на мышь по содержанию CBD - отрицательный контроль 1; физиологическим раствором - отрицательный контроль 2;
б) заражение через 5 недель после второй вакцинации мышей внутривенно в дозе 5×106 КОЕ вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv;
в) умервщление через 4 недели после заражения из каждой группы по 4 мыши и проведение оценки размножения микобактерий в легких и селезенке методом посева гомогенатов органов на агар Дюбо с последующим подсчетом колоний;
г) проведение наблюдений за оставшимися мышами (8 в каждой группе) для построения кривых выживания;
д) при этом о протективных свойствах иммуногенной композиции по п.5 судят по результатам стадий в) и г), проводя их сравнение между опытом и контролем внутри каждой группы, при этом уменьшение числа микобактерий в органах и продление срока жизни зараженных животных свидетельствует о наличии у композиции протективных свойств.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантной продукции белков внутри подобных белковым тельцам (ОРБПБТ) отложений рекомбинантного белка в эукариотических хозяйских клетках.

Изобретение относится к области медицины и касается гуманизированного антитела против остеопонтина человека. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается ферментативного способа получения 1-бутанола с использованием бактериальной клетки

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается ферментативного способа получения 1-бутанола с использованием бактериальной клетки

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных биомаркеров полипептидной природы, и может быть использовано в диагностике рассеянного склероза
Наверх