Способ повышения иммунной компетентности животных в стадах крупного рогатого скота

Изобретение относится к области зоотехнии и ветеринарии. Способ осуществляется следующим образом. Методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом фрагментов рестрикции (ПЦР/ПДРФ) устанавливают генотипы коров маточного поголовья и племенных быков по гену BoLA-DRB3. Затем животных распределяют по группам с генотипами, различающимися по отношению к инфекционным заболеваниям: Ч/Ч, У/У, Ч/У, Н/Н, Ч/Н, У/Н. Для воспроизводства потомства с максимальной частотой встречаемости гетерозиготных генотипов, включающих устойчивый (У) аллель, родительские пары подбирают следующим образом: одного родителя с генотипом У/У, а другого - Ч/Ч, одного родителя с генотипом У/У, а другого - Н/Н, одного родителя с генотипом Ч/У, а другого - Ч/Ч (Ч-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом Ч/У, а другого - У/У (У-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом У/Н, а другого - У/У (У-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом Ч/Н, а другого - У/У. Способ позволяет повысить иммунную компетентность в стадах крупного рогатого скота. 2 табл.

 

Изобретение относится к зоотехнии и ветеринарии и предназначено для использования при формировании стада крупного рогатого скота, обладающего высоким уровнем иммунной компетентности.

По данным информационно-аналитического центра Россельхознадзора [информационный ресурс: http://www.fsvps.ru] неблагополучное эпидемиологическое состояние популяции крупного рогатого скота на территории России в 2009 году отмечается по сибирской язве, туберкулезу, бруцеллезу, бешенству, лейкозу, лептоспирозу и др. заболеваниям. Следовательно, повышение иммунной компетентности животных - важная народно-хозяйственная задача.

Известно, что в настоящее время маркер BoLA-DRB3 используется в следующих направлениях:

- как высоко информативный маркер (секвенировано более 100 аллелей) для изучения генетического разнообразия пород, линий и стад крупного рогатого скота (5, 9, 10),

- как маркер уровня иммунного ответа организма на вирусные и бактериальные инфекции (5, 7, 11). Известно, что разные аллели гена ВоLА-DRB3 играют не одинаковую роль в формировании устойчивости крупного рогатого скота к различным инфекционным заболеваниям. Так, например, показано, что животные, несущие аллели BoLA-DRB3 *11, *23, *28 - устойчивые (У-группа), не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза, а животные, несущие в своем генотипе аллели BoLA-DRB3 *8, *16, *22, *24 - чувствительные (Ч-группа), напротив, чаще других оказываются в выборке гематологических больных. Нейтральные - остальные разновидности - или Н-аллели не ассоциируются ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу,

- как маркер выраженности хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота (2, 4, 8) (вероятно из-за близкой локализации BoLA-DRB3 к некоторым продуктивным локусам).

Уровень гетерозиготности по некоторым локусам, в частности, по гену BoLA-DRB3 следует рассматривать как неспецифический фактор устойчивости к инфекционным заболеваниям (1).

Наиболее близким по сущности к предлагаемому является селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота (RU 2316207 C2, 10.02.2008) (3), включающий ДНК-тестирование маточного поголовья и быков-производителей по гену BoLA-DRB3, затем распределение животных по группам с различной чувствительностью к персистентному лимфоцитозу: с генотипом, включающим два аллеля, обуславливающих чувствительность (Ч/Ч); с генотипом, включающим два аллеля, обуславливающих устойчивость (У/У); с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий чувствительность, а другой - устойчивость (Ч/У); с генотипом, включающим два нейтральных аллеля (Н/Н); с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий чувствительность, а другой - нейтральный (Ч/Н); с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий устойчивость, а другой - нейтральный (У/Н) и подборе для воспроизводства родительских пар так, чтобы обеспечить в потомстве максимальное насыщение популяции генотипами У/Ч.

Недостатками данного способа являются:

- ограничение применения породной принадлежностью животных (применим лишь в стадах голштинской, красной степной пород и их помесей);

- не учитывает аллельного разнообразия скрещиваемых (спариваемых) групп;

- ограничение применения маркера BoLA-DRB3 лишь в отношении персистентного лимфоцитоза.

Техническим результатом изобретения является повышение компетентности иммунной системы животных в стадах крупного рогатого скота.

Технический результат достигается тем, что в способе повышения иммунной компетентности животных в стадах крупного рогатого скота с использованием генетического маркера производится ДНК-тестирование маточного поголовья и быков-производителей по гену BoLA-DRB3, последующее распределение животных по группам с генотипами: Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, У/Н, Н/Н, У/У, подбор родительских пар для воспроизводства потомства с генотипами направленной селекции и отличающийся тем, что для воспроизводства потомства с максимальной частотой встречаемости гетерозиготных генотипов, включающих устойчивый (У) аллель, родительские пары подбирают следующим образом:

одного родителя с генотипом У/У, а другого - Ч/Ч, одного родителя с генотипом У/У, а другого - Н/Н, одного родителя с генотипом Ч/У, а другого - Ч/Ч (Ч-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом Ч/У, а другого - У/У (У-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом У/Н, а другого - У/У (У-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом Ч/Н, а другого - У/У.

При необходимости индивидуальное ДНК-тестирование всего материнского поголовья заменяется на тестирование репрезентативной выборки из стада; или, генетический профиль материнского поголовья определяется путем анализа генетического профиля предков.

При этом У-аллели обеспечивают первоначальный уровень защиты организма от бактериальных и вирусных инфекций, а сочетание У-аллей с Н- или Ч-аллелями обеспечивает дополнительную защиту, благодаря создаваемой высокой степени комбинаторной изменчивости генотипа. Два этих фактора в целом способствуют повышению компетентности иммунной системы.

Способ осуществляют следующим образом.

У племенных быков берутся образцы спермы на анализ ДНК. Амплифицируется экзон 2 гена BoLA-DRB 3, (размер ПЦР-продукта составляет 284 пн), а затем проводится анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз Rsa I, Нае III, BstYI, Bst2UI. Устанавливается генотип животного по гену BoLA-DRB 3. Создается картотека быков, в которой помимо основных зоотехнических характеристик учитывается генотип по гену BoLA DRB3.

У коров маточного поголовья берутся образцы крови на анализ ДНК. Амплифицируется экзон 2 гена BoLA DRB3 (размер ПНР - продукта составляет 284 пн), а затем проводится анализ рестрикционного полиморфизма этой области с помощью эндонуклеаз Rsa I, Нае III, BstYI, Bst2UI. Устанавливается генотип животного по гену BoLA DRB3.

Затем животные распределяются по группам: с генотипом, включающим два аллеля, обуславливающих чувствительность (Ч/Ч); с генотипом, включающим два аллеля, обуславливающих устойчивость (У/У); с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий чувствительность, а другой - устойчивость (Ч/У); с генотипом, включающим два нейтральных аллеля (Н/Н); с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий чувствительность, а другой - нейтральный (Ч/Н); с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий устойчивость, а другой - нейтральный (У/Н) и для воспроизводства родительские пары подбираются так, чтобы обеспечить в потомстве максимальное насыщение популяции гетерозиготными генотипами, включающими У-аллель (У/Ч, Н). Причем профиль отцовских аллей должен как можно сильней отличаться от профиля материнских, для исключения появления гомозиготных потомков. Другими словами, даже если при скрещивании в генотипах отцов и матерей встречаются аллели, относящиеся к одной группе (например, Ч-группе), необходимо чтобы это были различающиеся аллели (например, если в генотипе матерей встречаются в основном Ч-аллели BoLA-DRB3 *16 и BoLA-DRB3 *8, следует подбирать отцов с Ч-аллелями BoLA-DRB3 *22 и BoLA-DRB3 *24).

При генотипировании выборок быков - производителей голштинской (n=293) и айрширской (n=113) пород, принадлежащих различным российским племенным предприятиям, нами установлено, что в профиле айрширской породы преобладают Н/Н генотипы (65%), а голштинской - Ч/Н и Ч/Ч (33 и 35% соответственно) (таблица 1). Следует отметить, что безусловное лидерство в распространении среди голштинов принадлежит BoLA-DRB3 *24 (аллель встречен с частотой 22, 02%); у айрширов мономорфизм еще более выражен - частота встречаемости аллеля BoLA-DRB3 *7 составляет 26, 99%. Если говорить об абсолютных значениях, то 115 из 293 (или 39,25%) быков голштинской породы в тех или иных сочетаниях несут в своем генотипе аллель BoLA-DRB3 *24 и 49 из 113 (43,36%) быков айрширской породы - BoLA-DRB3 *7. Установлено, что из 293 быков голштинской породы 30 (или 10,23%) - гомозиготны (причем 46,67% из них несут генотип 24*24 и 20,00% генотип - 22*22); а у айрширов 17 (или 15,04%) из 113 быков гомозиготны (из 17 гомозиготных быков - 12 или 70, 59% несут генотип 7*7). Таким образом, в голштинской и айрширской породах очень высок уровень гомозиготности.

Аналогичные результаты получены в различных хозяйствах Краснодарского края (СЗАО «СКВО», ОАО «Племзавод «Кубань», ЗАОСС «Племзавод «Бейсуг», АПФ «Нива»), где проведено изучение разнообразия стад крупного рогатого скота голштинской, айрширской и красной степной пород по гену BoLA-DRB3. Нами установлено, что различные BoLA-DRB3 генотипы не равнозначны в плане продолжительности периода хозяйственного использования. Так, сочетание в генотипе голштинского скота Ч- и У-аллелей локуса BoLA-DRB3 увеличивает период их продуктивного использования. Отмечена на 7,9-9,2% сниженная частота встречаемости коров с генотипом Ч/У в выборке выбывших животных.

Таблица 1
Частота встречаемости генотипов BoLA-DRB3 в различных группах крупного рогатого скота
Группа животных	Частота встречаемости генотипов, %
Ч/Ч	Ч/У	Ч/Н	У/У	У/Н	Н/Н
коровы красной степной породы (n=60)	15	18	15	8	21	23
коровы голштинской породы (n=417)	42	20	25	2	6	5
быки-производители голштинской породы (n=293)	35	15	33	2	8	7
коровы айрширской породы (n=55)	-	-	15	-	12	73
быки-производители айрширской породы (n=113)	3	4	17		11	65

При анализе распределения BoLA-DRB3 генотипов в трех группах айрширских коров хозяйства ОАО «Племзавод им. Чапаева В.И»: в группе коров с проявлениями персистентного лимфоцитоза; в группе коров с высокой продуктивностью; в случайной выборке коров, установлено достоверное преобладание частоты встречаемости одного из BoLA-DRB3 генотипов - У/Н в группе здоровых высокопродуктивных коров айрширской породы (удой за лактацию свыше 7500 кг молока) по сравнению с группой коров, больных персистентным лимфоцитозом, в 4,6 раза.

Для максимального насыщения популяции гетерозиготными генотипами необходимо осуществить подбор родительских пар следующим образом (табл.2):

Таблица 2
Возможный подбор родительских пар и распределение генотипов в потомстве
Родители	Возможное распределение генотипов в потомстве
Ч/Ч	У/У	100% У/Ч
Ч(*24,*16)/У	Ч(*8)/Ч(*22)	50% Ч/У+50% Ч/Ч
или У/У	(50% Ч/У+50% У/У)
Ч/Н	У/У	50% Ч/У+50% У/Н
У/У	Ч/Ч (Н/Н)	100% У/Ч (100% У/Н)
У(*11,*28)/Н	У (*23)/У(*23)	50% У/Н+50% У/У
Н/Н	У/У	100% У/Н

Тогда во втором поколении можно получить максимально возможное количество животных с гетерозиготными генотипами.

Источники информации

1. Генжиева О., Рузина М., Сулимова Г. Анализ генетической устойчивости калмычкого скота к лейкозу // Молочное и мясное скотоводство. - 2008. - №8. - С.9-10.

2. Горковенко Л.Г., Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Взаимосвязь генотипа по локусу BoLA DRB3 главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота с молочной продуктивностью // Вестник РАСХН. - 2007. - №3. - С.73-74.

3. Горковенко Л.Г., Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Патент РФ на изобретение №2316207 «Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота», заявка №2005112494. Заявитель и патентообладатель Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства. Заявлено 25.04.2005 г., зарегистрировано в государственном реестре изобретений РФ 10.02.2008 г.

4. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Использование генетических маркеров для повышения молочной продуктивности коров // Зоотехния. - 2007. - №8. - С.2-4.

5. Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О, Захаров И.А. ДНК-полиморфизм гена Bola-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу // Генетика. - 1995. - №.9. - С.1294-1299.

6. Groenen M.A.M. et al. The nucleotide sequence of bovine MHC class II DQB and DRB genes // Immunogenetics. - 1990. - №31. - P.37.

7. Ripoli M.V., Villegas-Castagnasso E.E., Peral-Garcia P., Giovambattista G. New polymorphisms for the BoLA-DRB3 upstream regulatory region // Tissue Antigens. - 2005. - №66 (2). - P.136-137.

8. Rupp R. et al. Association of bovine leukocyte antigen (BoLA) DRB3.2 with immune response, mastitis, and production and type traits in Canadian Holsteins // J Dairy Sci. - 2007. - Feb. - 90(2). - P.1029-1038.

9. Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. Extensive polymorphism of the BoLA DRB3 gene distinguished PCR-RFLP // Anim. Genet. - 1992. - 23. - 483.

10. Xu A., Van Eijk V.J.Т., Park Ch. Polymorphism in BoLA-DRB3 Exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus // J. of Immunology. - 1993. - V.151. - №12. - P.6977-6985.

11. Zanotti M. et al. Association of BoLA class II haplotypes with subclinical progression of bovine leukaemia virus infection in Holstein - Friesian cattle // Anim. Genet. - 1996. - 27. - P.337-341.

Способ повышения иммунной компетентности животных в стадах крупного рогатого скота, включающий анализ генотипов маточного поголовья и быков-производителей по гену BoLA-DRB3, последующее распределение животных по группам с генотипами: Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, У/Н, Н/Н, У/У, подбор родительских пар для воспроизводства потомства с генотипами направленной селекции, отличающийся тем, что для воспроизводства потомства с максимальной частотой встречаемости гетерозиготных генотипов, включающих устойчивый (У) аллель, родительские пары подбирают следующим образом:
одного родителя с генотипом У/У, а другого - Ч/Ч, одного родителя с генотипом У/У, а другого - Н/Н, одного родителя с генотипом Ч/У, а другого - Ч/Ч (Ч-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом Ч/У, а другого - У/У (У-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом У/Н, а другого - У/У (У-аллели не должны совпадать у матери и отца), одного родителя с генотипом Ч/Н, а другого - У/У.