Биологически активное раневое покрытие

Изобретение относится к медицине, а именно к раневым покрытиям с использованием клеточного материала человека. Сущностью изобретения является комплексное использование для заживления ран разной площади и объема гидратированной микробной целлюлозы с наслоенным на нее коллагеновым гелем, причем в слоях или на их границе присутствует, по крайней мере, один источник ростовых факторов. В качестве источников ростовых факторов применяют клетки мезодермального и/или эктодермального типа и/или тромбоциты крови. Подобраны комбинации и оптимальные количественные соотношения клеточного материала, дающие высокий лечебный эффект заявляемого лекарственного раневого покрытия. По изобретению были приготовлены биологически активные раневые покрытия, содержащие фибробласты, тромбоциты крови, мезенхимальные стволовые клетки, постнатальные кератиноциты человека. Раневое покрытие совмещает в себе функцию биологически активной матрицы для регенерации тканей и функцию защиты и гидратации раневой поверхности. 36 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к раневым покрытиям с использованием клеток человека.

Долгое время основная функция раневого покрытия рассматривалась только как защита от инфекции из окружающей среды. В 60-е гг. было показано, что повреждения кожи лучше заживают под перевязочным материалом во влажной среде, чем при открытой ране (Nature. 193: 293-4:1962). Это легло в основу новой концепции раневых покрытий. В современной медицине роль раневого покрытия сводится не только к защите от внешней среды и механических воздействий, его назначение - активное воздействие на раневой процесс за счет создания благоприятного микроклимата и включения в состав покрытий биологически активных веществ.

Современным требованиям концепции заживления ран во влажной среде полностью соответствуют гидратирующие раневые покрытия: они могут длительное время поддерживать необходимые параметры раневой среды и находиться на раневой поверхности длительное время без смены.

В случае обширных и хронических ран только создания влажной камеры недостаточно для эффективного заживления, необходимы меры по направленной стимуляции процессов пролиферации, миграции клеток в рану, синтеза элементов матрикса и восстановления поврежденной ткани. Основными факторами, ответственными за эти процессы, являются ростовые факторы (Physiol. Rev. 83:835-870, 2003). Источником естественных ростовых факторов в составе повязки могут быть как клетки-продуценты, так и тромбоциты крови. Основными клетками, которые используют в продуктах для восстановления кожных покровов и мягких тканей, являются клетки мезодермального происхождения (фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки) и клетки эктодермального происхождения (клетки эпидермиса - кератиноциты). Гидратирующие раневые покрытия в виде гелей могут выступать в качестве носителей для клеток. Наибольшее распространение получили гели на основе коллагена - основного белка соединительных тканей (J. Invest. Dermatol. 81:2s-10s, 1983). Идея совмещения гелей на основе биополимеров с клетками кожи привела к созданию целого ряда так называемых тканевых эквивалентов, где в качестве основы использовали коллаген или фибрин. Однако данное решение имеет ряд недостатков: под действием сил натяжения, создаваемых клетками, гель быстро сокращается, высвобождая жидкость, и быстро деградирует на ране, при этом как жидкость, так и клетки могут впитываться в перевязочные средства, поэтому покрытия на основе коллагенового/фибринового геля нуждаются в дополнительном антиадгезивном покрытии и увлажнении. К тому же, гели не обладают достаточной механической прочностью и поэтому неудобны в обращении.

Известен патент (US Patent №2,135,191) «Композиционный эквивалент живой кожи, способ его получения, тест-набор». По патенту, в качестве лечебного состава для раны используют пористую сшитую коллагеновую губку, содержащую культивированные фибробласты, со слоем беспористого коллагена I типа и/или III типа с наслоенными на него эпидермальными клетками. Коллаген в этом изобретении используют и как материал для роста ткани, и как покрытие для раны. Пористость губки с проросшими в ней клетками препятствует сокращению геля, обеспечивает регенерацию ткани, но не изолирует рану от внешней среды и не обеспечивает ее гидратацию.

Известно временное раневое покрытие на основе гидрофильного полимера и кератиноцитов (WO 9532743). В качестве полимера в данном изделии используются различные производные метакрилата. В данном раневом покрытии полимер в виде геля создает гидратирующий слой и служит основой для роста кератиноцитов. Кератиноциты высевают на предварительно сформированный гель и после образования эпителиального слоя покрытие переносят на рану и прикладывают несущей клетки поверхностью. Кератиноциты мигрируют на раневое ложе и через некоторое время гидрогель удаляется. Такое раневое покрытие может использоваться для поверхностных неглубоких кожных повреждений, но не для восстановления мягких тканей.

Еще одним решением является создание геля на основе целлюлозы микробного происхождения (US Patent №5,558,861). Микробная целлюлоза благодаря своим свойствам биосовместимости, высокой абсорбционной способности и низкой степени биодеградации является подходящим материалом для раневых покрытий. В известном патенте поверхность целлюлозного покрытия модифицируют с помощью белков животного происхождения, после чего оно становится подходящим субстратом для роста эпидермальных клеток. Для модификации поверхности используют коллаген, фибронектин, ламинин и желатин. Так же как в покрытии на основе метакрилата данное изделие может использоваться только для поверхностных кожных повреждений, так как не содержит биосовместимого биодеградируемого слоя, который мог бы быть матрицей для восстановления тканей.

В другом изобретении при создании клеточного продукта используются 2 слоя: адгезивный, содержащий клетки, и неадгезивный (US Patent №6,800,282). В описываемом раневом покрытии адгезивный биодеградируемый слой служит основой для роста клеток кожи (кератиноцитов и фибробластов), после переноса на рану адгезивный слой деградирует, высвобождая клетки в раневое пространство. Неадгезивный слой создает микроокружение, в котором раневая поверхность становится единственным сайтом прикрепления освобожденных клеток. В качестве материалов для адгезивного слоя используют синтетические полимеры (PolyHEMA, PVA, polyacrylamide, polyurethane, polypropylen). Неадгезивный слой формируют из производных целлюлозы. Недостатком перечисленных решений является необходимость использовать дополнительные факторы для прикрепления и роста клеток, так как используемые синтетические полимерные матриксы не поддерживают адгезию и рост клеток кожи. В качестве адгезивных компонентов используют широкий круг натуральных и синтетических полианионов, в числе которых - белки эмбриональной бычьей сыворотки, перлекан, синдекан, бетагликан, гепарин сульфат, декстран, поливинил сульфат или RGD и YIGST пептиды. Данные компоненты пришивают к адгезивному слою химически или связывают с ним физически. Синтетические матриксы в силу своей природы не участвуют в раневом процессе и также не могут быть матрицей для формирующейся ткани. Они выполняют только функцию носителя для клеток.

Технической задачей изобретения является создание раневого покрытия, которое одновременно совмещало бы в себе функцию биологически активной матрицы для регенерации тканей и функцию защиты и гидратации раневой поверхности.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в создании двухслойного биологически активного раневого покрытия, один слой которого представляет собой биосовместимый биодеградируемый гидрогель, содержащий продуценты ростовых факторов и цитокинов, который является матрицей для вновь формирующейся ткани, другой слой представляет собой недеградируемое покрытие, обеспечивающее длительную гидратацию и защиту раневой поверхности. При этом оба слоя являются адгезивными для клеток и совместно обеспечивают 2- и 3-мерное культивирование клеток мезодермального и эктодермального происхождения. Расположение клеточных элементов в гидрогеле соответствует гистотипическому расположению клеток в норме.

Заявляемое раневое покрытие дает хорошие результаты при лечении различных поражений благодаря комбинированному использованию в нем гидратированной бактериальной целлюлозы и коллагенового геля, создающих необходимые условия для регенерации тканей. Ранее совместно такую комбинацию не применяли.

При этом биологически активное раневое покрытие характеризуется тем, что биосовместимый биодеградируемый гидрогель является коллагеновым. Его pH 7,2-7,4. Гель получен путем нейтрализации 0,15-0,3% раствора коллагена I и/или III типа в 0,1% уксусной кислоте с помощью раствора щелочи (0,34 М раствор NaOH, в количестве 0,5-2% от объема геля). В результате образовавшийся гель содержит 0,34 М раствор ацетата натрия в количестве 0,5-2% от объема геля. Исходно коллаген получают мягкой кислой экстракцией из источников животного происхождения (сухожилия и шкуры телят или сухожилия хвостов крыс).

Распределение в покрытии слоев таково, что на 1 см² целлюлозы наслоено 0,1-0,5 мл коллагенового геля.

Гель содержит десятикратный концентрат ростовой среды M199 в количестве 3-5% от общего объема, антибиотики широкого спектра действия (например, смесь антибиотиков пенициллин от 50 до 100 единиц/мл и стрептомицин от 0,05 до 0,1 мг/мл), ростовую среду DMEM - остальное.

Биологически активное раневое покрытие характеризуется тем, что дополнительно содержит как минимум один вид продуцентов биологически активных веществ: ростовых факторов и цитокинов. При этом в качестве продуцентов активных веществ выступают клетки мезодермального и эктодермального происхождения. В качестве клеток мезодермального происхождения используются нормальные постнатальные фибробласты человека или мезенхимальные стволовые клетки (МСК). В качестве клеток эктодермального происхождения используются нормальные постнатальные кератиноциты человека. При этом клетки могут быть аллогенные или аутологичные, свежевыделенные или криоконсервированные.

Также биологически активное раневое покрытие характеризуется тем, что в качестве продуцентов ростовых факторов выступают тромбоциты крови человека. Тромбоциты получают из крови пациентов в виде концентрата тромбоцитов (КТ) путем последовательного центрифугирования цельной крови. КТ добавляется в коллагеновый гель, где составляет в нем по объему 5%-30%, предпочтительно, 10%-20%.

Более того, биологически активное раневое покрытие характеризуется тем, что содержит слой нерезорбируемого биополимера. В качестве нерезорбируемого биополимера используется целлюлоза микробного происхождения. При этом биополимер максимально насыщается водными растворами. В качестве водных растворов могут быть использованы: физиологический раствор, фосфатно-буферный раствор, ростовая среда, кондиционированная среда, - т.е. в изобретении используют гидратированную бактериальную целлюлозу. Слой целлюлозы в покрытии имеет толщину от 0,1 до 0,7 см. Площадь покрытия задается в зависимости от размера раны, и при получении покрытия целлюлозу микробного происхождения перед гидратированием нарезают площадью от 7 до 154 см².

Дополнительно водные растворы содержат антибиотики широкого спектра действия в концентрациях, не токсичных для клеток, как выше, т.е. в коллагеновом геле.

Дополнительно водные растворы могут содержать КТ в концентрации 5-30%, предпочтительно 10-20%,тогда тромбоциты, присутствующие в слое микробной целлюлозы, служат дополнительным источником ростовых факторов.

Также биологически активное раневое покрытие характеризуется тем, что нерезорбируемый полимер дополнительно содержит клетки мезодермального происхождения. В качестве клеток мезодермального происхождения используются нормальные постнатальные фибробласты человека или МСК. При этом клетки высеваются в виде монослоя на поверхность, граничащую с гидрогелем.

Бактериальная целлюлоза отличается от целлюлозы растительного происхождения своими уникальными свойствами: благодаря сети микрофибрилл создается трехмерное пространство с размером пор от нескольких нанометров до микрометров, позволяющее абсорбировать и удерживать большое количество жидкости, придавая микробной целлюлозе гелеобразные свойства (Biomacromolecules, 8 (1), pp 1-12, 2007).

Исходно для приготовления биологически активного раневого покрытия может использоваться обводненная, частично или полностью дегидратированная микробная целлюлоза. В случае дегидратированной целлюлозы, последняя в течение 24 ч насыщается физиологическими растворами. В случае использования обводненной целлюлозы, последняя вымачивается в физиологических растворах в течение 48 ч с несколькими сменами растворов для замещения имеющегося раствора на предпочтительный. Так как поверхность микробной целлюлозы имеет пористость микроскопических размеров, она может служить субстратом для роста адгезивных клеток, не нуждающихся в дополнительных факторах для прикрепления и культивирования. Фибробласты или МСК высевают на целлюлозу в концентрации 10-50 тыс./см².

Фибробласты, растущие в монослое, в отличие от клеток при 3-мерном культивировании в геле, активно пролиферируют, являясь тем самым в раневом покрытии основным источником клеток-продуцентов ростовых факторов.

После формирования клеточного слоя на поверхности микробной целлюлозы формируется слой гидрогеля, содержащий клетки мезодермального происхождения, которые уже находятся в условиях трехмерного пространства. После установления в геле физиологических значений pH (7,2-7,4) в него вносят клетки мезодермального происхождения и/или концентрат тромбоцитов. Гранулы тромбоцитов содержат различные ростовые факторы, цитокины, молекулы адгезии, участвующие в регуляции различных процессов раневого заживления (J Oral Maxillofac Surg. 2004 Apr; 62(4):489-96). Дегрануляция тромбоцитов и выход активных компонентов происходит в результате активации кровяных пластинок тромбином или при контакте с некоторыми элементами внеклеточного матрикса, в том числе с коллагеном. Толщину геля можно варьировать в зависимости от глубины раны. Эпидермальные клетки высевают на поверхность сформированного гидрогеля. Подобное расположение клеточных элементов в гидрогеле соответствует гистотипическому расположению клеток в норме. Биологически активное покрытие готово к применению через 2-4 суток культивирования, после формирования кератиноцитами растущих колоний.

Раневое покрытие прикладывается к раневой поверхности стороной, несущей эпидермальные клетки, при этом гидрогелевый коллагеновый слой раневого покрытия не рассматривается как кожный эквивалент. Образующие его компоненты не замещают поврежденные ткани кожи, а служат лишь источником биологически активных элементов. Целью формирования in vitro структуры кожи является создание условий культивирования клеток, при которых максимально реализуются тканеспецифичные программы функционирования клеток. Таким образом, заявляемый продукт имеет три неизменных компонента: гидратированная целлюлоза, коллагеновый гель, источник ростовых факторов. В качестве источника ростовых факторов используют мезодермальные клетки, и/или эктодермальные клетки, и/или тромбоциты. Поэтому покрытие содержит как минимум один источник ростовых факторов.

В изобретении использованы клетки нескольких типов: мезодермального происхождения (фибробласты или МСК) и эктодермального типа (кератиноциты), причем клетки могут быть аутологичные или аллогенные, свежевыделенные или криоконсервированные.

При совместном культивировании кератиноцитов и фибробластов синтезируются различные ростовые факторы и цитокины, принимающие участие в регуляции различных процессов раневого заживления, от миграции клеток в рану до формирования рубцовой ткани. Коллагеновый матрикс служит основой для адгезии и миграции в место повреждения клеток из окружающих тканей и способствует формированию грануляционной ткани. Слой микробной целлюлозы обеспечивает постоянную гидратацию и защиту раневой поверхности, а также служит дополнительным резервуаром для биологически активных компонентов (антибиотиков и ростовых факторов). Целлюлоза может находиться на ране до полной или частичной эпителизации раны, после чего ее легко удаляют без травмирования новообразованного эпителия.

Пример 1. Приготовление биологически активной повязки, содержащей в качестве источника ростовых факторов концентрат тромбоцитов.

Целлюлозу укладывают на дно чаши Петри и заливают физиологическим раствором на 24 часа до полной ее гидратации.

Предварительно готовят концентрат тромбоцитов (КТ) из аутологичной крови.

КТ получают из стабилизированной антикоагулянтом крови в 2 этапа: сначала кровь подвергают низкоскоростному центрифугированию (при 680 g в течение 13 мин, температура комнатная) для отделения эритроцитов, затем супернатант дополнительно «откручивают» в более жестком режиме (при 2400 g в течение 20 мин, температура комнатная); большую часть надосадка отсасывают и осадок тромбоцитов ресуспендируют в минимальном объеме плазмы, получая, таким образом, КТ.

Коллагеновый гель готовят путем смешивания основных компонентов в следующих соотношениях:

- раствора коллагена I и/или III типа в 0,1% уксусной кислоте - 30-50%;

- десятикратный концентрат среды M199 - 3%;

- 0,34 М NaOH - 0,5-2%;

- смесь пенициллин/стрептомицин - 1%;

- концентрат тромбоцитов - 10%;

- ростовая среда DMEM - остальное.

Конечная концентрация коллагена в геле - 1,5-3 мг/мл.

Готовый гель наслаивают на подготовленную целлюлозу из расчета 0,1-0,5 мл на см² и помещают в термостат на 37°С на сутки. При контакте с коллагеном происходит активация и дегрануляция тромбоцитов и выход ростовых факторов в гель.

Продукт готов к применению через сутки, полный цикл приготовления данного варианта биологически активной повязки составляет 2 суток.

Пример 2. Приготовление биологически активной повязки, содержащей в качестве источника ростовых факторов МСК.

Для использования в качестве клеток - продуцентов биологически активных веществ используются МСК на ранних (4-6) пассажах. Клетки культивируют на ростовой среде а-МЕМ с содержанием 20% эмбриональной бычьей сыворотки и FGF. Перед пересевом клеток кондиционированную среду собирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм для дальнейшего использования. Частично дегидратированную целлюлозу микробного происхождения нарезают на образцы площадью от 7 см² до 150 см². Целлюлозу укладывают на дно чаши Петри и заливают кондиционированной средой на 24 ч до полной ее гидратации. МСК высевают на поверхность подготовленной целлюлозы в кондиционированной среде в концентрации 10-50 тыс./см², затем помещают в CO₂ инкубатор на 1,5-2 часа для прикрепления и распластывания. По окончании этого процесса готовят слой коллагенового геля.

Коллагеновый гель готовят путем смешивания основных компонентов в следующих соотношениях:

- раствора коллагена I и/или III типа в 0,1% уксусной кислоте - 30%;

- десятикратный концентрат среды M199 - 3%;

- 0,34М NaOH - 0,5-2%;

- смесь пенициллин/стрептомицин - 1%;

- ростовая среда а-МЕМ - остальное.

Конечная концентрация коллагена в геле - 1,5-3 мг/мл.

Процедуру смешивания проводят на льду во избежание преждевременной полимеризации геля. После приготовления геля в него вводят суспензию МСК из расчета 100-150 тыс. кл/мл геля, причем клетки являются аутологичными.

Готовый гель наслаивают на подготовленную целлюлозу из расчета 0,1-0,5 мл на см² и помещают в CO₂ инкубатор на сутки. За это время происходит полимеризация геля и распластывание в нем клеток.

Продукт готов к применению через сутки, полный цикл приготовления данного варианта биологически активной повязки составляет 2-3 суток.

Пример 3. Приготовление биологически активной повязки, содержащей в качестве источника ростовых факторов фибробласты.

А) Аналогично примеру 2 приготовлено биологически активное раневое покрытие, отличающееся тем, что для получения ростовых факторов используют нормальные фибробласты человека, причем клетки являются аутологичными. Полный цикл приготовления такой повязки составляет 2-3 суток. Характеристика ее равноценна примеру 2.

Б) Аналогично примеру 2 приготовлено биологически активное раневое покрытие, отличающееся тем, что для получения ростовых факторов используют фибробласты человека, причем клетки являются аллогенными. Полный цикл приготовления такой повязки составляет 2-3 суток. Характеристика ее равноценна примеру 2.

Пример 4. Приготовление биологически активной повязки, содержащей в качестве источника ростовых факторов клетки кожи.

Для использования в качестве клеток - продуцентов биологически активных веществ используются нормальные фибробласты кожи человека на ранних (4-6) пассажах. Клетки культивируют на ростовой среде DMEM с содержанием 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Перед пересевом клеток кондиционированную среду собирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм для дальнейшего использования. Частично дегидратированную целлюлозу микробного происхождения нарезают на образцы площадью от 7 см² до 150 см². Целлюлозу укладывают на дно чаши Петри и заливают кондиционированной средой на 24 ч до полной ее гидратации. Фибробласты высевают на поверхность подготовленной целлюлозы в кондиционированной среде в концентрации 10-50 тыс./см², затем помещают в CO₂ инкубатор на 1,5-2 часа для прикрепления и распластывания. По окончании этого процесса готовят слой коллагенового геля.

Коллагеновый гель готовят путем смешивания основных компонентов в следующих соотношениях:

- раствора коллагена I и/или III типа в 0,1% уксусной кислоте - 30-50%;

- десятикратный концентрат среды M 199 - 3%;

- 0,34 М NaOH - 0,5-2%;

- смесь пенициллин/стрептомицин - 1%;

- ростовая среда DMEM - остальное.

Конечная концентрация коллагена в геле - 1,5-3 мг/мл.

Процедуру смешивания проводят на льду во избежание преждевременной полимеризации геля. После приготовления геля в него вводят суспензию фибробластов из расчета 100-150 тыс. кл/мл геля.

Готовый гель наслаивают на подготовленную целлюлозу из расчета 0,1-0,5 мл на см² и помещают в CO₂ инкубатор на сутки. За это время происходит полимеризация геля и распластывание в нем фибробластов.

Суспензию эпидермальных клеток наносят на поверхность готового геля в концентрации 50-200 тыс./см² и культивируют 2-4 дня в атмосфере 5% CO₂ при 37°C до формирования растущих колоний. Эпидермальные клетки могут быть как свежевыделенные, так и криоконсервированные.

Полный цикл приготовления биологически активной повязки занимает 4-6 суток.

Пример 5. Приготовление биологически активной повязки, содержащей в качестве источника ростовых факторов фибробласты и тромбоциты крови.

Для использования в качестве клеток - продуцентов биологически активных веществ используются нормальные фибробласты кожи человека и тромбоциты крови. Фибробласты культивируют на ростовой среде DMEM с содержанием 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Перед пересевом клеток кондиционированную среду собирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм для дальнейшего использования. Частично дегидратированную целлюлозу микробного происхождения нарезают на образцы площадью от 7 см² до 150 см². Целлюлозу укладывают на дно чаши Петри и заливают кондиционированной средой на 24 часа до полной ее гидратации. Фибробласты высевают на поверхность подготовленной целлюлозы в кондиционированной среде в концентрации 10-50 тыс./см², затем помещают в CO₂ инкубатор на 1,5-2 часа для прикрепления и распластывания. По окончании этого процесса готовят слой коллагенового геля. Предварительно готовят КТ из аутологичной крови.

КТ получают из стабилизированной антикоагулянтом крови в 2 этапа: сначала кровь подвергают низкоскоростному центрифугированию (при 680 g в течение 13 мин, температура комнатная) для отделения эритроцитов, затем супернатант дополнительно «откручивают» в более жестком режиме (при 2400 g в течение 20 мин, температура комнатная); большую часть надосадка отсасывают и осадок тромбоцитов ресуспендируют в минимальном объеме плазмы, получая, таким образом, КТ.

Коллагеновый гель готовят путем смешивания основных компонентов в следующих соотношениях:

- раствора коллагена I и/или III типа в 0,1% уксусной кислоте - 30-50%;

- десятикратный концентрат среды M199-3%;

- 0,34 М NaOH - 0,5-2%;

- смесь пенициллин/стрептомицин - 1%;

- концентрат тромбоцитов - 10%;

- ростовая среда DMEM - остальное.

После приготовления геля в него вводят суспензию фибробластов из расчета 100-150 тыс. кл/мл геля.

Готовый гель наслаивают на подготовленную целлюлозу из расчета 0,1-0,5 мл на см² и помещают в CO₂ инкубатор. Продукт готов к применению через сутки, полный цикл приготовления данного варианта биологически активной повязки составляет 2-3 суток.

Пример 6. Приготовление биологически активной повязки, содержащей в качестве источника ростовых факторов клетки кожи и тромбоциты крови.

Для использования в качестве клеток - продуцентов биологически активных веществ используются нормальные клетки кожи человека и тромбоциты крови. Фибробласты культивируют на ростовой среде DMEM с содержанием 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Перед пересевом клеток кондиционированную среду собирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм для дальнейшего использования. Частично дегидратированную целлюлозу микробного происхождения нарезают на образцы площадью от 7 см² до 150 см². Целлюлозу укладывают на дно чаши Петри и заливают кондиционированной средой на 24 часа до полной ее гидратации. Фибробласты высевают на поверхность подготовленной целлюлозы в кондиционированной среде в концентрации 10-50 тыс./см², затем помещают в CO₂ инкубатор на 1,5-2 часа для прикрепления и распластывания. По окончании этого процесса готовят слой коллагенового геля. Предварительно готовят КТ из аутологичной крови.

КТ получают из стабилизированной антикоагулянтом крови в 2 этапа: сначала кровь подвергают низкоскоростному центрифугированию (при 680 g в течение 13 мин, температура комнатная) для отделения эритроцитов, затем супернатант дополнительно «откручивают» в более жестком режиме (при 2400 g в течение 20 мин, температура комнатная); большую часть надосадка отсасывают и осадок тромбоцитов ресуспендируют в минимальном объеме плазмы, получая, таким образом, КТ.

Коллагеновый гель готовят путем смешивания основных компонентов в следующих соотношениях:

- раствора коллагена I и/или III типа в 0,1% уксусной кислоте - 30-50%;

- десятикратный концентрат среды M199 - 3%;

- 0,34 М NaOH - 0,5-2%;

- смесь пенициллин/стрептомицин - 1%;

- концентрат тромбоцитов - 10%;

- ростовая среда DMEM - остальное.

После приготовления геля в него вводят суспензию фибробластов из расчета 100-150 тыс. кл/мл геля.

Готовый гель наслаивают на подготовленную целлюлозу из расчета 0,1-0,5 мл на см² и помещают в CO₂ инкубатор для полимеризации.

Суспензию эпидермальных клеток (кератиноциты) наносят на поверхность готового геля в концентрации 50-200 тыс/см² и культивируют 2-4 дня в атмосфере 5% CO₂ при 37°C до формирования растущих колоний. Эпидермальные клетки могут быть как свежевыделенные, так и криоконсервированные.

Полный цикл приготовления биологически активной повязки занимает 4-6 суток.

Все приготовленные по изобретению биологически активные покрытия показали высокий лечебный эффект.

1. Биологически активное раневое покрытие, состоящее из микробной целлюлозы и коллагенового геля, содержащее источник ростовых факторов, отличающееся тем, что целлюлоза является гидратированной и имеет наслоенный на нее из расчета 0,1-0,5 мл на 1 см² коллагеновый гель с pH 7,2-7,4, причем источник ростовых факторов содержится в целлюлозе, и/или в коллагеновом слое, и/или на их границе.

2. Биологически активное раневое покрытие по п.1, отличающееся тем, что слой целлюлозы имеет толщину от 0,1 до 0,7 см.

3. Биологически активное раневое покрытие по п.2, отличающееся тем, что слой целлюлозы имеет площадь от 7 до 154 см².

4. Биологически активное раневое покрытие по п.1 или 3, отличающееся тем, что содержание коллагена в геле составляет 1,5-3 мг/мл, а гелевый слой имеет следующее соотношение компонентов, об.%:

водный раствор коллагена	30-50
десятикратный концентрат среды М 199	3-5
0,34 М ацетат натрия	0,5-2%
среда с источником ростовых факторов	остальное

5. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются тромбоциты крови.

6. Биологически активное раневое покрытие по п.5, отличающееся тем, что содержание концентрата тромбоцитов в геле составляет от 5 до 30%.

7. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального и эктодермального типа и тромбоциты крови, причем клетки мезодермалыюго и эктодермального происхождения являются аутологичными.

8. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального и эктодермального типа и тромбоциты крови, причем клетки мезодермального и эктодермального происхождения являются аллогенными.

9. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального и эктодермального типа и тромбоциты крови, причем клетки мезодермального и эктодермального происхождения являются свежеприготовленными.

10. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального и эктодермального типа и тромбоциты крови, причем клетки мезодермального и эктодермального происхождения являются криоконсервированными.

11. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального типа.

12. Биологически активное раневое покрытие по п.11, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются аутологичными.

13. Биологически активное раневое покрытие по п.11, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются аллогенными.

14. Биологически активное раневое покрытие по п.11, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются свежеприготовленными.

15. Биологически активное раневое покрытие по п.11, отличающееся тем что клетки мезодермального типа являются криоконсервированными.

16. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального типа и тромбоциты крови.

17. Биологически активное раневое покрытие по п.16, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются аутологичными.

18. Биологически активное раневое покрытие по п.16, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются аллогенными.

19. Биологически активное раневое покрытие по п.16, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются свежеприготовленными.

20. Биологически активное раневое покрытие по п.16, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа являются криоконсервированными.

21. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки мезодермального и эктодермального типа.

22. Биологически активное раневое покрытие по п.21, отличающееся тем, что клетки мезодермального и эктодермального типа являются аутологичными.

23. Биологически активное раневое покрытие по п.21, отличающееся тем, что клетки мезодермального и эктодермального типа являются аллогенными.

24. Биологически активное раневое покрытие по п.21, отличающееся тем, что клетки мезодермального и эктодермального типа являются свежеприготовленными.

25. Биологически активное раневое покрытие по п.21, отличающееся тем, что клетки мезодермального и эктодермального типа являются криоконсервированными.

26. Биологически активное раневое покрытие по пп.7-25, отличающееся тем, что клетками мезодермального типа являются фибробласты.

27. Биологически активное раневое покрытие по пп.7-25, отличающееся тем, что клетками мезодермального типа являются мезенхимальные стволовые клетки.

28. Биологически активное раневое покрытие по пп.7-27, отличающееся тем, что клетки мезодермального типа на границе коллагенового геля и целлюлозы засеяны с концентрацией 10-50 тыс/см², а внутри геля - с концентрацией 100-150 тыс/мл.

29. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что источником ростовых факторов являются клетки эктодермального типа и тромбоциты крови.

30. Биологически активное раневое покрытие по п.29, отличающееся тем, что клетки эктодермального типа являются аутологичными.

31. Биологически активное раневое покрытие по п.29, отличающееся тем, что клетки эктодермального типа являются аллогенными.

32. Биологически активное раневое покрытие по п.29, отличающееся тем, что клетки эктодермального типа являются свежеприготовленными.

33. Биологически активное раневое покрытие по п.29, отличающееся тем, что клетки эктодермального типа являются криоконсервированными.

34. Биологически активное раневое покрытие по пп.7-10, 21-25, 29-33, отличающееся тем, что клетками эктодермального типа являются кератиноциты.

35. Биологически активное раневое покрытие по п.4, отличающееся тем, что поверхность коллагенового слоя засеяна кератиноцитами в концентрации 50-200 тыс./см².

36. Биологически активное раневое покрытие по п.п.4-35, отличающееся тем, что коллагеновый слой дополнительно содержит смесь антибиотиков широкого спектра действия.

37. Биологически активное раневое покрытие по п.36, отличающееся тем, что антибиотики представляют собой смесь: пенициллин - от 50 до 199 ед/мл и стрептомицин - от 0,05 до 0,1 мг/мл.