Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови
Владельцы патента RU 2431836:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" ГОУ ВПО "ЧелГМА Росздрава" (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и иммунологии, может быть использовано как подготовительный этап изучения функциональной активности нейтрофилов периферической крови. Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови заключается в том, что 2 мл цельной гепаринизированной венозной крови соединяют со стерильным физиологическим раствором хлорида натрия в пропорции 2/3 и наслаивают на двойной градиент плотности растворов фиколл-верографина, при этом объем каждого градиента составляет 2 мл, затем проводят центрифугирование 40 минут при 1500 об/мин до появления на границе градиентов кольца нейтрофильных гранулоцитов с чистотой 98-100%. Использование заявленного способа позволяет выделить чистую фракцию нейтрофилов из меньшего объема периферической крови, сократить время выделения, а также получить больший процент жизнеспособных клеток по сравнению с существующими методами выделения нейтрофилов. 3 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и иммунологии, и предназначено для выделения чистой фракции нейтрофилов из периферической крови.
Существующие методики выделения нейтрофилов из периферической крови требуют предварительного получения лейкоцитарной взвеси, которая наряду с нейтрофилами содержит лимфоциты и моноциты [1]. Для этого необходимо 15 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивают в стерильной пробирке при температуре +37°С в течение 40-60 минут. Иногда для ускорения седиментации эритроцитов добавляется стерильный раствор желатина из расчета 1-2 капли на 10 мл крови. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут.
Предлагаемый нами способ позволяет выделять нейтрофилы из цельной крови. Для этого 2 мл цельной гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) крови смешивается для снижения вязкости крови с 3 мл стерильного физиологического раствора и наслаивается на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 2 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, эритроциты при этом осаждаются на дно пробирки. Кольцо нейтрофильных гранулоцитов также аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.
Целью заявляемого способа является уменьшение объема необходимой крови и ускорение процесса выделения нейтрофилов, позволяя повысить уровень жизнеспособных клеток, что является важным условием для изучения функциональной активности нейтрофилов.
Сущность предлагаемого способа заключается в использовании для выделения нейтрофилов малого количества цельной гепаринизированной венозной крови (2 мл) и сокращении времени методики за счет отсутствия этапа получения лейковзвеси.
Предлагаемый способ соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов выделения нейтрофилов обладает следующими существенными отличительными признаками:
1. методика позволяет выделить нейтрофилы из малого объема крови (2 мл);
2. выделение нейтрофилов осуществляется из цельной крови, минуя стадию получения лейковзвеси, то есть сокращается время постановки методики;
3. увеличивается количество жизнеспособных клеток в связи с тем, что сокращается время выделения нейтрофилов и отсутствует активирующее воздействие желатина и температурного режима на этапе получения лейковзвеси.
Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:
1) 2 мл цельной гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) крови смешивается для снижения вязкости крови с 3 мл стерильного физиологического раствора.
2) Смесь наслаивается на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 2 мл.
3) Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, эритроциты при этом осаждаются на дно пробирки.
4) Кольцо нейтрофильных гранулоцитов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.
5) Полученная клеточная взвесь состоит на 98-100% из нейтрофильных гранулоцитов и используется в исследованиях функциональной активности нейтрофилов.
При сравнении предлагаемого способа с прототипом (Долгушин И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009. С.122) имеются существенные отличия (табл.3).
Предлагаемым способом были выделены нейтрофильные гранулоциты из периферической крови 50 здоровых доноров, у которых была проведена оценка жизнеспособности при окраске трипановым синим. Полученные данные сравнили с жизнеспособностью нейтрофилов, выделенных из лейкоцитарной взвеси (табл. 1, 2).
| Таблица 1 | ||
| Сравнительный анализ жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов, выделенных различными способами (n=50, М±m) | ||
| Показатель | Нейтрофилы, выделенные из лейковзвеси | Нейтрофилы, выделенные из цельной крови |
| Трипанонегативные клетки, % | 57,12±3,25 | 69,58±4,27* |
| Трипанопозитивные клетки, % | 43,12±3,29 | 30,68±3,41* |
| Примечание: * - достоверность отличий сравниваемых групп, р<0,05. |
| Таблица 2 | ||
| Сравнительный анализ абсолютного количества нейтрофильных гранулоцитов, выделенных различными способами (п=10, М±m) | ||
| Показатель | Нейтрофилы, выделенные из лейковзвеси, 106 | Нейтрофилы, выделенные из цельной крови, 106 |
| Абсолютное количество нейтрофилов в 1 мл | 1,91±0,12 | 1,83±0,15 |
| Таблица 3 | |||
| Отличия предлагаемого способа от прототипа | |||
| Признак | Предлагаемый способ | Известный способ (близкий аналог) * | |
| 1. | Количество крови | 2 мл | 15 мл |
| 2. | Время седиментации эритроцитов | 0 мин | 30 мин |
| 3. | Выделение чистой фракции нейтрофилов | из гепаринизированной крови | из лейкоцитарной взвеси |
| 4. | Общее время выделения нейтрофильных гранулоцитов | 60 мин | 90 мин |
| 5. | Абсолютное количество нейтрофилов в 1 мл | 1,83±0,15×106 | 1,91±0,12×106 |
| 6. | Трипанонегативные клетки (жизнеспособные), % | 69,58±4,27* | 57,12±3,25 |
| Примечание: * - Долгушин И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. - М.: Изд-во РАМН. 2009. С.122) |
Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала - Уоллиса и Манна - Уитни. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [2].
Приводим примеры использования предлагаемого способа выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови
Пример 1.
Из цельной периферической крови 20-летней здоровой женщины предложенным способом были выделены нейтрофилы. Процент трипанонегативных нейтрофилов составил 68%. Полученная чистая фракция нейтрофилов была использована для изучения их функциональной активности.
Пример 2.
Из цельной периферической крови здорового мужчины 22 лет предложенным способом из 2 мл цельной крови было выделено 2,0×106 нейтрофилов, а из лейкоцитарной взвеси, полученной из 2 мл гепаринизированной крови, 1,6×106 клеток. Процент трипанонегативных нейтрофилов составил 71%. Полученная чистая фракция нейтрофилов была использована для изучения их функциональной активности.
Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет сократить объем забираемой крови у донора и время выделения чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов, увеличивая процент жизнеспособных нейтрофилов.
Литература
1. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. / И.И.Долгушин. - Екатеринбург, 2001. - 279 с.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С.Гланц. - М.: Практика, 1999. - 450 с.
Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови, характеризующийся тем, что 2 мл цельной гепаринизированной венозной крови соединяется со стерильным физиологическим раствором хлорида натрия в пропорции 2/3 и наслаивается на двойной градиент плотности растворов фиколл-верографина, при этом объем каждого градиента по 2 мл, затем проводится центрифугирование 40 мин при 1500 об/мин до появления на границе градиентов кольца нейтрофильных гранулоцитов с чистотой 98-100%.
