Способ производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов bac. subtilis и bac. licheniformis
Владельцы патента RU 2432392:
Общество с ограниченной ответственностью "Национальная биотехнологическая компания" (RU)
Способ производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis включает их культивирование, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное обезвоживание. При этом в способе используют штамм Вас. subtilis ВКПМ В-10172 и штамм Вас. licheniformis ВКПМ В-10135. Биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1. В качестве протектора микробных клеток используют желатиносахарозную защитную среду в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 2×1012 КОЕ/г. Способ позволяет получить препарат с высокой эффективностью пробиотической составляющей, что обеспечивает повышенную усвояемость кормов и увеличение привесов с/х животных и птицы. 3 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам производства пробиотических препаратов на основе штаммов бактерий Bac.subtilis и Bac.licheniformis. Подобные препараты могут использоваться как кормовая добавка для составления кормовых рационов, предназначенная для повышения усвояемости кормов сельскохозяйственных животных и птицы.
Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммов энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus falcium ВГНКИ-27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную охлаждают до температуры 15-20°C и концентрируют в 10-15 раз, полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°C. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах, или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием в полупериодическом режиме работы (см. патент РФ №2065305, опубл. 08.20.1996).
Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, необходимость использования гидролизата казеина значительно удорожает препарат. Во-вторых, использование в качестве метода концентрирования ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрации на плоских мембранах делает данный метод дорогостоящим и требующим больших капиталовложений и высокой подготовки персонала. Также использование криогенной техники обезвоживания значительно усложняет технологический процесс. Кроме того, использование в качестве смешанной пробиотической культуры только двух видов бактерий делает эту смешанную популяцию неустойчивой, что снижает эффективность ее применения.
Известен способ получения сухого пробиотического препарата, который включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus acidophilus и Rhuminococcus albus до заданного достижения титра каждого микроорганизма, смешивание полученной маточной культуры с подсолнечниковым шротом в заданном соотношении, причем в качестве микроорганизмов дополнительно используют Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, из Lactobacillus acidophilus используют Lactobacillus acidophilus Suav. ВКПМ B-4625, из Rhuminococcus albus - Rhuminococcus albus KR, при этом выращенные маточные культуры смешивают в соотношении 1:1, засеивают ею автоклавированный подсолнечниковый шрот при следующем соотношении компонентов, масс.%:
| автоклавированный подсолнечниковый шрот | 45-55 |
маточная культура Lactobacillus
| acidophilus Suav. |
ВКПМ 4625,
| Rhuminococcus albus Kr | 20-30 |
| маточная культура Bacillus subtilis ВКПМ B-8130 | 20-30 |
инкубируют полученную смесь при 30-45°C в течение 4-8 дней с получением в полувлажном препарате не менее 1×108 клеток/г препарата, причем смешивают полученный препарат с подсолнечниковым шротом в соотношении 1:10-1:12 с получением препарата с остаточной влажностью 8-10%.
Наиболее близким способом производства пробиотической добавки является смешивание биомассы бактерий Bacillus subtilis В-2250 и/или Bacillus licheniformis В-2252 и вспомогательных веществ носителя-сорбента и влагоемкого наполнителя. В качестве носителя-сорбента она содержит аэросил гидрофильной марки A и гидрофобной марки AM, влагоемкого наполнителя - смолы-катиониты ионообменные марок КБ-4П-2 и КУ-2-8чс в заданном соотношении компонентов по массе сухого вещества. Сухую микрокапсулированную форму пробиотической добавки получают методом капиллярно-сорбционного высушивания смеси компонентов до содержания влаги в готовом продукте 8-25%. В результате получают микрокапсулированную форму пробиотической добавки, содержащую пробиотик, удобную в применении и употреблении, способную обеспечивать стабильностью свойств на всех этапах приготовления (RU 2252956 С2, 2005).
Однако полученный вышеуказанным способом пробиотический препарат хотя и обладает стабильными физико-химическими свойствами, недостаточно эффективен в связи с невысоким содержанием пробиотических микроорганизмов. Кроме того, его производство энергозатратно и сложно.
По этой причине сохраняется потребность в высокоэффективных пробиотических препаратах, используемых в качестве кормовых добавок для повышения привесов с/х животных и птицы.
Техническим результатом данного изобретения является повышение эффективности пробиотической составляющей получаемого продукта, что обеспечивает повышенную усвояемость кормов и увеличение привесов животных.
Этот результат может быть реализован при использовании описываемого способа производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, предназначенного для использования в качестве кормовой добавки к рационам с/х животных и птицы, направленной для повышения усвояемости кормов, включающий культивирование штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное обезвоживание, причем используют штамм Bac. subtilis ВКПМ В-10172 и штамм Bac. licheniformis ВКПМ В-10135, биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1, в качестве протектора микробных клеток используют желатиносахарозную защитную среду в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 2×1012 КОЕ/г.
В способе производства используются новые штаммы бактерий Bac. subtilis и Bac. licheniformis. Штаммы депонированы к коллекции ГНИИГенетика под регистрационными номерами: Bac. subtilis ВКПМ В-10172 и Bac. licheniformis ВКПМ В-10135. Штаммы выделены из природного сообщества в Кировской области. Далее приведены свойства каждого штамма.
Bac. subtilis ВКПМ В-10172
Культурально-морфологические признаки
Клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Граму - грамположительны. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также на этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвете с неровными краями. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть.
Физиолого-биохимические признаки
Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.
Культуру поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: пептон 5 г/л, дрожжевой экстракт 3 г/л, NaCl 5 г/л, вода водопроводная - до 1 л.
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: K2HPO4×3H2O - 18,3 г/л; KH2PO4 - 6,0 г/л; (NH4)2SO4 - 2,0 г/л; NA3C6H5O7×5,5H2O - 1,2 г/л.
Bac. licheniformis ВКПМ В-10135
Культурально-морфологические признаки
Клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют анаэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетки центрально. Окраска по Граму - грамположительны. Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также на этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвета с неровными краями. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть.
Физиолого-биохимические признаки
Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитазной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.
Культуру поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: пептон 5 г/л, дрожжевой экстракт 3 г/л, NaCl 5 г/л, вода водопроводная - до 1 л.
Оптимальная температура роста - 37°C, pH - 7,0. Состав среды: K2HPO4×3H2O - 18,3 г/л; KH2PO4 - 6,0 г/л; (NH4)2SO4 - 2,0 г/л; NA3C6H5O7×5,5H2O - 1,2 г/л.
Способ осуществляют следующим образом. Биомассу B.subtilis и B.licheniformis получают выращиванием в стерильных условиях, отделяют биомассу на центрифуге, пасту смешивают с защитной средой (желатинно-сахарозной), разливают и сушат в лиофильной сушилке. Биомассу B.subtilis и B.licheniformis получают путем культивирования в качалочных колбах объемом 750 мл или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м3 на среде с глюкозой, пептоном, кукурузным экстрактом. Полученную в процессе ферментации культуральную жидкость центрифугируют. Биомассу бактерий и спор (в виде концентрированной суспензии) смешивают с защитной средой, содержащей сахарозу и желатин, разливают в пенициллиновые флаконы по 3 мл и сушат в лиофильной сушилке.
Пример
Получение инокулята Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis.
Культуру бактерий B.subtilis и B.licheniformis хранят на скошенной плотной среде МПА или ГРМ №1 в пробирках, закрытых ватными пробками. Оптимальная температура хранения 4-6°C. Для поддержания культуры в жизнеспособном состоянии один раз в 3 месяца производят пересев на свежую питательную среду МПА или ГРМ и выращивают при t=37°C до спорообразования 16-24 час.
Для получения посевного материала для засева 100 колб с ферментационной питательной средой готовят от 1 до 5 колб инокулята. Для получения инокулята используют 2 варианта:
- в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносят кусочек размером 1×1 см2 исходной культуры со скошенного плотного агара МПА;
- в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносят 0,5-1 мл споровой взвеси, смытой с двух биологических пробирок с исходной культурой 20 мл физиологического раствора.
Выращивание проводят в термостатируемой качалке при N=180-200 об/мин или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м3, при t=37°C в течение 16-24 часов для культуры Bacillus subtilis и в течение 40-48 часов для Bacillus licheniformis. Чистоту культуры проверяют путем высева на чашки Петри с агаризованной средой МПА с последующим термостатированием при t=37°C. Отсутствие роста посторонней микрофлоры определяют визуально по виду колоний. Кроме этого, чистоту культуры определяют микроскопически. При отсутствии посторонней микрофлоры инокулят используют для засева колб с ферментационной средой.
Приготовление сред.
Приготовление жидкой питательной среды для инокулята.
Состав питательной среды:
Пептон - 10 г/л
Глюкоза - 20 г/л
NaCl - 1 г/л
CaCl2 - 0,05 г/л
MgSO4 - 0,25 г/л
MnSO4 - 0,3 г/л
FeSO4 - 0,01 г/л
Кукурузный экстракт - 30 г/л
pH среды 7,5±0,1 доводят 20% раствором NaOH.
Разливают в качалочные колбы с отбойниками по 100-150 мл.
Стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°C в течение 25 мин.
ТП-2-2 Приготовление жидкой питательной среды для ферментации.
Состав питательной среды:
Пептон - 10 г/л
Глюкоза - 20 г/л
NaCl - 1 г/л
CaCl2 - 0,05 г/л
MgSO4 - 0,25 г/л
MnSO4 - 0,3 г/л
FeSO4 - 0,01 г/л
Кукурузный экстракт - 30 г/л
pH среды 7,5±0,1 доводят 20% раствором NaOH.
Разливают в качалочные колбы с отбойниками по 100-150 мл.
Стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°C в течение 25 мин.
Приготовление желатино-сахарозной защитной среды для лиофилизации продукта.
Состав питательной среды:
Желатин - 10 г/л
Сахар - 100 г/л
Среду тщательно перемешивают, разливают во флаконы по 100-150 мл и стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°C в течение 25 мин.
Культивирование Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis.
В качалочные колбы с отбойниками объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100-150 мл засевают инокулят в количестве 0,5-1 мл. Выращивание проводят в термостатируемой качалке N=200-220 об/мин или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м3 при N=250-270 об/мин с расходом воздуха 1:1, при t=37°C в течение 16-24 часов для культуры Bacillus subtilis и в течение 40-48 часов для Bacillus licheniformis.
Окончание культивирования определяют по достижению pH 7,2-7,6 для Bacillus subtilis и pH 8,0-8,5 для Bacillus licheniformis по полному потреблению глюкозы и обильному спорообразованию. Количество бактерий определяют методом десятикратных разведений с высевом на чашки Петри. В 1 см3 культуральной жидкости должно быть не менее 1010 клеток.
Обработка полученной культуральной суспензии.
Полученные культуральные жидкости B.subtilis и B.licheniformis смешивают по титру в соотношении 1:1. С целью концентрирования культуральной жидкости проводят центрифугирование. Центрифугирование проводят на центрифуге при N=6000-8000 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость собирают в реактор-нейтрализатор, обеззараживают при температуре 100°C в течение двух часов, после чего сливают в канализацию. Центрифугу после сбора пасты обрабатывают 4% раствором хлорамина, затем промывают водой.
Полученную биомассу клеток B.subtilis и B.licheniformis с влажностью 60-80% (паста бактерий) (≈2 г со 100 мл культуральной жидкости) выгружают в эмалированные или пластиковые емкости, смешивают с протектором (желатино-сахарозной смесью) таким образом, чтобы титр сухого продукта после сушки составил КОЕ/г 2×1012. Перемешивание до полной гомогенизации проводят на мешалке при N=1000 об/мин, в течение 20-25 мин. Перед розливом суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли и разливают по 3 мл во флакон.
Сушка
Флаконы устанавливают на полки сублимационной сушилки.
Режим сушки состоит из трех сегментов.
1 сегмент: замораживание от комнатной температуры до t=-40°C со скоростью 0,3, выдержка в течение 4-5 часов при этой температуре.
2 сегмент: сушка под вакуумом при температуре от t=-40°C до t=-20°C. Выдержка при t=-20°C в течение 4-5 часов.
3 сегмент: сушка под вакуумом при температуре от t=-20°C до t=+30°C. Выдержка при t=+30°C в течение 0,5 часа.
После окончания 3 сегмента сбрасывают вакуум, достают флаконы и передают в бокс для укупорки.
Остаточная влажность таблетки препарата не более 4%.
Упаковка готового продукта.
Флаконы с лиофильно высушенным продуктом укупоривают резиновыми пробками и фиксируют алюминиевыми колпачками. На флаконы с препаратом наклеивают этикетки, укладывают в картонные коробки. Картонные коробки укладывают в ящики из гофрированного картона. Этикетку с названием препарата и датой изготовления вкладывают в коробку.
Сухая биомасса B.subtilis и B.licheniformis применяется для приготовления кормовой добавки, которая используется для повышения усвояемости кормов вследствие улучшения пищеварения сельскохозяйственных животных, птиц и рыб в условиях их промышленного воспроизводства.
Примеры.
- выпаивание (0,5×1012 КОЕ/фл)
- добавка в премикс (3,3×1011 КОЕ/г)
- добавка в комбикорм (3,3×109 КОЕ/г)
| Возраст | Норма здоровой птице | Восстановление после антибиотиков | Снятие стресса при вакцинации | Оздоровление при инфекции |
| до 5 дней | 1 флакон в день на 2500 голов, выпаивание 3 -5 дней | 1 флакон в день на 1250 голов, выпаивание 3-5 дней | 1 флакон в день на 1000 голов, выпаивание 3-5 дней | 1 флакон в день на 825 голов, выпаивание 3-5 дней с 10%-ным раствором глюкозы |
| 5-10 дней | 300 г на 1 тонну премикса | 500 г на 1 тонну премикса | 500 г на 1 тонну премикса | |
| 750 г на 1 тонну корма | 1000 г на 1 тонну корма А | 1000 г на 1 тонну корма | ||
| 10-20 дней | 175 г на 1 тонну премикса | 225 г на 1 тонну премикса | 200 г на 1 тонну премикса | 500 г на 1 тонну премикса |
| 350 г на 1 тонну корма | 450 г на 1 тонну корма | 400 г на 1 тонну корма | ||
| 20-30 дней | 100 г на 1 тонну премикса | 200 г на 1 тонну премикса | 175 г на 1 тонну премикса | 1000 г на 1 тонну корма 3-5 дней |
| 200 г на 1 тонну корма | 400 г на 1 тонну корма | 350 г на 1 тонну корма |
| Нормы ввода (г/т) (3,3×109 КОЕ/г) в корм и (3,3×1011 КОЕ/г) в премикс | ||
| Вид | Комбикорм | Премикс |
| Цыплята | 500 г/тонна | 250 г/тонна |
| Бройлеры | 1000 г/тонна | 500 г/тонна |
| Пушные звери | 300 г/тонна | 150 г/тонна |
| Поросята сосуны | 400 г/тонна | 200 г/тонна |
| Поросята на откорме | 300 г/тонна | 150 г/тонна |
| Свиноматки | 500 г/тонна | 250 г/тонна |
| Индейки | 400 г/тонна | 200 г/тонна |
| Телята, жеребята | 500 г/тонна | 250 г/тонна |
| Норма суточного выпаивания 1 флакона (0,5×1012 КОЕ) | |
| Вид молодняка | Норма |
| Цыплята суточные | 2500 голов |
| Поросята сосуны | 10 голов |
| Кролики | 10 голов |
| Щенки пушных зверей | 15 голов |
| Козлята, барашки | 10 кг массы |
| Телята | 40 кг массы |
Споры пробиотика вместе с кормом попадают в пищевод, затем преодолевают жизнеспособными кислую среду желудка и, попадая в щелочную среду тонкого кишечника, прорастают в вегетативные клетки, выделяя при этом большое количество пищеварительных ферментов, чем способствуют более полному расщеплению и перевариванию корма.
Одновременно проросшие споры вступают в конкуренцию за питательные субстраты с патогенной микрофлорой и вытесняют ее из кишечника, повышая тем самым иммунный статус животного и его защитный барьер от инфекций. В прямой кишке не завершившие метаболизм вегетативные клетки спорулируют и выходят с калом с последующим санирующим эффектом навоза.
Эффективность пробиотика усиливается тем, что в составе добавки присутствуют аэробная В.subtilis и анаэробная В.licheniformis бактерии, при этом на поверхности корма или слизистой в присутствии кислорода работает аэробная бактерия, по объему корма и внутри слизистой без доступа кислорода - анаэробная. Однако, в отличие от похожих по составу добавок, эти бактерии находятся в составе препарата в реальном соотношении 1:1, что как раз и гарантирует заявленый мощный синергический эффект.
Шесть качеств спорогенного пробиотика, делающих его пробиотическим стимулятором роста:
- Продуцент пищеварительных ферментов (амилаз, липаз, протеаз).
- Антагонист патогенов (конкуренция за питательные субстраты).
- Сапротроф (антитоксическое действие, лизис продуктов гниения).
- Иммуномодулятор (активация макрофагов, индукция эндогенного интерферона).
- Толерантность (дополняет и/или заменяет кормовые антибиотики, нейтрален в кормовых смесях и премиксах).
- Стабильность (выдерживает высокие температуры и давления гранулирования на комбикормовых заводах, неприхотлив в хранении.
Способ производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, предназначенного для использования в качестве кормовой добавки к рационам с/х животных и птицы, направленной для повышения усвояемости кормов, включающий культивирование штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток, отличающийся тем, что используют штамм Вас. subtilis ВКПМ В-10172 и штамм Вас. licheniformis ВКПМ В-10135, биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1, в качестве протектора микробных клеток используют желатиносахарозную защитную среду в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 2×1012 КОЕ/г, затем проводят стерильное обезвоживание.
