Интерферон, конъюгированный с полиэтиленгликолем

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Представлен интерферон, коньюгированный с полиэтиленгликолем, где ПЭГ присоединен к интерферону посредством азогруппы. Изобретение позволяет увеличить время циркуляции интерферона в крови с сохранением значительной доли его биологической активности. 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и касается биологически активного конъюгата интерферона с полиэтиленгликолем с увеличенным временем циркуляции в крови.

Биологически активные белки (БАБ) играют важную роль в поддержании жизнедеятельности организма в целом и его клеток в частности. Примерами таких белков могут быть, в частности, ферменты, гормоны, цитокины и т.д. Наиболее распространенными лекарственными средствами БАБ являются препараты на основе интерферонов, применяемые для лечения различных инфекционных и онкологических заболеваний.

Однако в практической деятельности у препаратов на основе интерферонов было выявлено много недостатков: быстрое разрушение в организме, что вынуждает значительно увеличивать дозу и частоту введения; плохое прохождение в ткани; побочные, в том числе аллергические, реакции и пр. Это диктует необходимость поиска новых лекарственных форм применения интерферонов для достижения лучшего биологического эффекта.

Одним из результатов такого поиска было создание соединений интерферонов с полиэтиленгликолем (Harris JM, Martin NE, Modi M. Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Clin Pharmacokinet 2001; 40(7):539-51). Этот процесс получил название "ПЭГилирование".

ПЭГ - химическое вещество, обладающее свойствами, которые позволяют использовать его в качестве носителя для биоорганических молекул или соединений. Например, ПЭГ агломерирует молекулы, что позволяет создавать депо лекарственного вещества. Кроме того, вследствие локальной повышенной концентрации действующего вещества усиливается его проведение внутрь тканей (Kozlowski, A. Development of Pegylated Interferons for the Treatment of Chronic Hepatitis С /А.Kozlowski, S.A.Charles, J.M.Harris // BioDrugs - 2001. - №15(7). P 419-429., Wong S.S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC press, 1993).

ПЭГилирование позволяет пролонгировать действие белков: получить длительный терапевтический эффект при однократном применении лекарственного средства; избежать колебаний концентрации лекарственных веществ в крови, вызывающих нежелательные побочные явления; снижать токсичность лекарственного вещества (О.Н.Минушкин, Л.В.Масловский. Этиотропная терапия хронических вирусных гепатитов. // Кремлевская медицина, 2000, №1, с.34-40).

В ковалентных конъюгатах ПЭГ защищает протеин от ферментативной деградации в организме, снижает его иммуногенность, улучшает переносимость, а также увеличивает общий размер молекулы и, как следствие, время ее циркуляции в организме, препятствуя выведению через почки. Отмеченное допускает более редкое введение препарата и более ровное поддерживание терапевтических концентраций в крови [Никитин И.Г., Сторожаков Г.И. «Вирусные гепатиты, достижения, перспективы», 2001, №3(13), с.3-8].

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является препарат «ПэгИнтрон» по патенту WO 1995/013090, представляющий собой ковалентный конъюгат интерферона с ПЭГ с периодом полусуществования в сыворотке крови 40 ч. В данном конъюгате линейный ПЭГ массой 12 кДа присоединен к аминогруппе интерферона α-2b (далее - INF α-2b) посредством карбаматной связи. Недостаток данного прототипа заключается в том, что карбаматная связь гидролитически неустойчива и это ведет к быстрому распаду «ПэгИнтрона» в крови и, соответственно, быстрому выведению из организма. Кроме того, известно, что препарат переносится пациентами неудовлетворительно (Rustgi VK, Esposito S, Hamzeh FM, Shiffman ML. Peginterferon alfa-2a/ribavirin in hepatitis С virus patients nontolerant or nonresponsive to peginterferon alfa-2b/ribavirin. // Aliment. Pharmacol. Ther., 2008, Mar 1; 27(5):433-40).

Предлагаемое изобретение, помимо расширения арсенала эффективных биологически активных средств для лечения инфекционных заболеваний, обеспечивает более длительное время циркуляции конъюгата в крови по сравнению с прототипом при сохранении противовирусных свойств немодифицированного интерферона.

Данная задача решается за счет нового биологически активного конъюгата интерферона с ПЭГ, отличающегося тем, что ПЭГ присоединен к интерферону посредством ароматической азогруппы.

Следующая структура иллюстрирует заявленное изобретение.

где INF - интерферон;

n - целое число в интервале от 450 до 1140.

Из уровня техники не было выявлено решений, раскрывающих возможность использования азогруппы для присоединения ПЭГ к молекуле INF. Из известного уровня техники не следует, что такое присоединение не приведет, в частности, к потере уровня активности белка. Таким образом, заявленное техническое решение не только является новым, но и не следует из существующего уровня техники.

Молекулярная масса ПЭГ в предлагаемом конъюгате находится в интервале от 20 до 50 кДа. Особенность указанного конъюгата заключается в том, что ПЭГ с интерфероном связан посредством азогруппы, образующей хромофор, поглощающий в видимой и ближней УФ-области электронного спектра (20000-34000 см^-1) и придающий окраску целевому конъюгату (фиг.1).

Интерферон, используемый в заявленном изобретении, может быть как рекомбинантным, так и природным, типа альфа, бета и гамма.

Пример 1. Фармакокинетика ПЭГ-INF α-2b.

Самцам мышей линии СВА внутрибрюшинно вводили по 200 нг конъюгата ПЭГ-INF α-2b, после чего собирали кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля использовали препарат «ПегИнтрон», который вводили по той же схеме. Взятые пробы крови инкубировали в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяли тромб и повторно инкубировали при 4°С, полученную сыворотку центрифугировали и сохраняли при - 65°С до проведения тестов. Содержание интерферона в сыворотках крови определяли с помощью иммуно-ферментного анализа. Данные по фармакокинетике препаратов представлены на фиг.2, из которой видно, что ПЭГ-INF α-2b циркулирует в крови в течение 6 суток, тогда как препарат «ПегИнтрон» практически отсутствует уже на 4-е сутки (см. фиг.2).

Пример 2. Антивирусная активность ПЭГ-INF α-2b.

Антивирусную активность немодифицированного интерферона α-2b и его ковалентного конъюгата с полиэтиленгликолем определяли in vitro на культуре бычьих почечных клеток линии Madin-Darby, зараженных вирусом везикулярного стоматита. Показатели антивирусных активностей приведены в табл.1.

Таблица 1
Сравнение антивирусной активности немодифицированного и ПЭГилированного INF α-2b
Препарат	Удельная активность, МЕ/мг	% активности
INF α-2b*	1,9·108	100
ПЭГ(20 кДа)-INF α-2b	0,36·108	19
ПЭГ(30 кДа)-INF α-2b	0,17·108	9
ПЭГ(50 кДа)-INF α-2b	0,09·108	5
* - международный стандарт

Таким образом, полученные данные показали, что предложенный конъюгат ПЭГ-INF α-2b сохраняет значительную часть антивирусной активности немодифицированного INF α-2b.

Пример 3. Токсичность ПЭГ-INF α-2b.

Токсичность ПЭГ-INF α-2b оценивали на самцах мышей линии СВА, которым вводили конъюгат ПЭГ-INF α-2b в интервале от 40 до 400 мкг/кг. При введении животным предлагаемого конъюгата не регистрировались летальные эффекты, не установлено значимых изменений во внутренних органах, гематологических и биохимических показателей крови. На основании полученных данных, исходя из того, что разовая доза конъюгата для человека составляет не более 4 мкг/кг, был сделан вывод о том, что предлагаемый конъюгат ПЭГ-INF α-2b является нетоксичным соединением.

1. Интерферон, конъюгированный с полиэтиленгликолем (ПЭГ), отличающийся тем, что ПЭГ присоединен к интерферону посредством азогруппы и имеет следующую структуру:

где INF - интерферон;
n - целое число в интервале от 450 до 1140.

2. Интерферон, конъюгированный с ПЭГ, по п.1, отличающийся тем, что интерферон является природным или рекомбинантным интерфероном типа альфа, бета или гамма.

3. Интерферон, конъюгированный с ПЭГ, по п.2, отличающийся тем, что интерферон является интерфероном α-2b.

4. Интерферон, конъюгированный с ПЭГ, по п.1, отличающийся тем, что молекулярная масса полиэтиленгликолевого фрагмента находится в интервале от 20 до 50 кДа.