Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости



Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости
Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости

 


Владельцы патента RU 2434879:

Лебедев Василий Вячеславович (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к области химиотерапии. Предложено средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости, которое представляет собой гексапептид структурной формулы: лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. На основе данного вещества возможно создание лекарственных средств, обладающих повышенной эффективностью преодоления множественной лекарственной устойчивости, увеличенной специфичностью действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP), повышенной безвредностью и не вызывающих токсических реакций. Эти лекарственные средства могут применяться для профилактики и терапии больных с явлениями множественной лекарственной устойчивости. 3 з.п. ф-лы, 7 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для устранения множественной лекарственной устойчивости у онкологических и инфекционных больных, длительно получающих химиопрепараты.

Возникновение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток, грамм-отрицательных бактерий и простейших к цитостатическим и антимикробным препаратам возникает в результате активации естественных защитных механизмов клетки. Такие механизмы посредством АТФ-зависимых транспортных белков обеспечивают интенсивное откачивание из клетки любых токсических соединений, включая химиотерапевтические агенты. Усиление интенсивности работы транспортного насоса клеток в период химиотерапии вызывает резкое падение концентрации препаратов в клетке и, таким образом, снижает терапевтическое действие лекарственных препаратов у больных бактериальными, паразитарными, грибковыми инфекциями и онкологическими заболеваниями. Из перечисленного широкого спектра заболеваний, лечение которых осложняется, а порой становится невозможно из-за развития МЛУ, очевидна полезность создания эффективных лекарственных средств преодоления МЛУ.

В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны, в основном, два типа транспортных белков: белки множественной лекарственной резистентности - multidrug resistance (MRP) и Р-гликопротеин - Р-glycoprotein (P-gp). MRP и P-gp обнаружены в опухолях различного происхождения: лимфомах, саркомах, карциномах и нейробластомах.

Субстратами для обоих типов транспортных белков является широкий спектр противоопухолевых соединений: антрациклины, этопозид, винкристин, таксол и др. Однако, в отличие от P-gp, MRP транспортирует различные соединения из клеток в виде коньюгатов с глутатионом или глюкуроновой кислотой. В результате работы транспортных белков цитостатические препараты поступают во внеклеточное пространство и опухолевые клетки приобретают устойчивость одновременно ко множеству лекарственных препаратов.

Известно, что целый ряд соединений ингибируют активность транспортного белка P-gp и тормозят выведение химиопрепаратов из клеток. По физико-химическим свойствам все известные соединения ингибиторы МЛУ объединяют признаки низкой молекулярной массы, наличия гидрофобных физико-химических свойств и присутствия ароматического кольца в молекуле. К числу ингибиторов МЛУ относят препараты следующих групп: блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы кальмодулина, коронарные вазодилятаторы, алкалоиды индола, гормоны, циклоспорины, сурфактанты и антибиотики [(Krishna R., Mayer R.D., Eur. J. Pharmacol. Sci. 2000. Vol.11. №4. 265-283)].

Однако указанные препараты обладают низкой удельной активностью в отношении ингибирования МЛУ опухолевых клеток. Так, блокаторы кальциевых каналов, например верапамил, обладают ингибирующей активностью in vitro в дозе порядка 10 мкМ.

Другая известная группа препаратов - антагонисты кальмодулина: трифторперазин, хлорпромазин, прохлорперазин проявляют способность снижать резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам только при относительно высоких концентрациях порядка 5-50 мкМ. Однако клиническое применение известных препаратов для преодоления МЛУ оказывается невозможным. Введение известных препаратов в действующих концентрациях экспериментальным животным требует их назначения в таких высоких дозах, которые вызывают летальные исходы или тяжелые осложнения [Sandor V., Fojo,T., Bates S.E. Drug Res. Updates 1998. V.1, 190-200]. Тяжелые токсические реакции известных ингибиторов МЛУ не позволяют их использовать у больных для преодоления МЛУ. Поэтому до настоящего времени не существует препаратов, обеспечивающих возможность преодоления МЛУ у онкологических или инфекционных больных.

Развитие МЛУ опухолевых клеток определяется не только транспортерами P-gp, но и другими транспортными агентами, в том числе белками множественной лекарственной резистентности - MRP. Данный белок вызывает устойчивость к тем же химиопрепаратам, что и P-gp, но с несколько другим спектром перекрестной резистентности. Белки множественной лекарственной резистентности семейства MRP, в отличие от белков P-gp, обладают широким межвидовым представительством и контролируют появление МЛУ как опухолевых клеток, так и гельминтов, простейших и бактерий [Borst T., Kool M., Evers R. Sem. Cancer Biol. 1997. V.8, 205-213]. Поэтому препараты способные влиять на активность транспортных белков MRP имеют более широкий спектр действия по сравнению с препаратами, влияющими на активность транспортных белков P-gp. Первые могут влиять не только на формирование МЛУ опухолевых клеток, но и на проявление множественной лекарственной резистентности глистов, простейших, в том числе малярийного плазмодия, и бактерий.

Известно применение циклогексапептида структурной формулы цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин в качестве лекарственного средства для лечения иммунодефицитных состояний [Патент Российской Федерации RU 2157235 - Средство для лечения иммунодефицитных состояний]. Однако известная фармакологически активная субстанция не обладает способностью преодолевать МЛУ и отличается по химической формуле от предложенного гексапептида линейной структуры - лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. Брутто формула C28H44O6N12. Молекулярная масса 644,7 Д. Поэтому рассмотрение касается совершенно разных химических соединений, обладающих разным действием: одно цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин влияет на иммунную систему, другое - лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин на множественную лекарственную устойчивость.

Одним из наиболее активных ингибиторов МЛУ, принимаемый за ближайший аналог настоящего изобретения, является известный лекарственный препарат, содержащий в качестве действующего вещества пептид - Циклоспорин А [Регистр лекарственных средств России, т.16, с.983-984, 2008]. Препарат нашел применение клинике в качестве иммунодепрессанта при трансплантации органов и тканей. Для преодоления МЛУ известный препарат применяют только в экспериментальных целях в культуре клеток. Циклоспорин А представляет собой гидрофобный циклический пептид структурной формулы:

Известный пептид Циклоспорин А подавляет МЛУ преимущественно путем конкурентного ингибирования АТФ-зависимых транспортных белков семейства P-gp. Действия на белки множественной лекарственной резистентности (MRP) Циклоспорин А практически не оказывает [Legrand О., Simonin G., Perrot J.Y. Blood. 1998. V.91. №12. 4480-4488]. Циклоспорин А в опытах in vitro ингибирует активность транспортных белков при концентрациях 0.5-2 мкМ. Циклоспорин А ингибирует МЛУ в опытах на животных и повышает эффективность действия доксорубицина на рост опухолей мышей. Однако его клиническое применение для преодоления МЛУ у больных оказывается невозможным, поскольку в эффективных дозах препарат оказывает мощное токсическое действие.

Предложенное изобретение направлено на создание лекарственного средства, обеспечивающего повышение эффективности преодоления множественной лекарственной устойчивости, увеличение специфичности действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP), повышение безвредности, устранение токсических реакций и создание приемлемых лекарственных форм для профилактики и терапии больных с явлениями множественной лекарственной устойчивости.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в качестве средства для преодоления МЛУ к различным химиотерапевтическим препаратам используют гидрофильный гексапептид структурной формулы: лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. Брутто-формула: С28Н46О7N12.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показано накопление кальцеина в клетках Р388 ВР в контроле (1) и после добавления 12 нМ гексапептида (2) в присутствии в среде ионов Со для тушение внеклеточного кальцеина.

На Фигуре 2 показана скорость выход кальцеина из предварительно нагруженных им клеток Р388 ВР в контроле (1) и после добавления 120 нМ гексапептида (2).

На Фигуре 3 показана кинетика выхода R123 из клеток Нер-2 в контроле (1) после добавления циклоспорина А 1 мкг/мл (2) и дигитонина 0.02% (3).

На Фигуре 4 показана кинетика выхода R123 из клеток Нер-2 в контроле (1) и после добавления циклоспорина А 1 мкг/мл (2).

На Фигуре 5 показана зависимость ингибирования скорости выхода R 123 (R) из клеток Нер-2 гексапептидом и циклоспорином А (Цс. А) от их концентраций.

На Фигуре 6 показана выживаемость клеток Нер-2 после воздействия 50 мкМ арсената с 1(2) и 100(3) мг/мл гексапептида.

На Фигуре 7 показано действие гексапептида на рост клеток Нер-2.

Предложенное средство содержит в качестве действующего вещества синтетический гексапептид молекулярной массой 662,7 Д.

Действующее вещество представляет собой белый порошок без запаха, легко растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Вещество не растворимо в спирте и хлороформе.

Предложенное средство для преодоления МЛУ содержит гексапептид в дозе 1-0,001% (10-0,01 мг). Лекарственные формы выпуска предложенного средства содержат стерильный раствор гексапептида для подкожных или внутримышечных инъекций в ампулах. В качестве стабилизатора средство содержит 1,0-0,5% раствор (10-0,5 мг) аминоуксусной кислоты. Лекарственная форма для подкожных или внутримышечных инъекций наиболее предпочтительна для применения в виде 0,005% стерильного раствора гексапептида в ампулах по 1,0 мл и 0,5% стабилизатора аминоуксусной кислоты. Срок хранения 2 года при 4-8 С°.

Лекарственная форма в виде спрея для дозированного интраназального применения наиболее предпочтительна во флаконах объемом 10,0-20,0 мл по 10-20 доз заявленного средства. Каждая доза содержит по 0,05-0,1 мг гексапептида и в качестве стабилизатора аминоуксусную кислоту в количестве 5-10 мг. В качестве консерванта раствор для дозированного интраназального применения содержит бензалкония хлорида от 0,0040 до 0,00012 г/мл. Наиболее предпочтительная лекарственная форма содержит разовую дозу 100 мкг гексапептида, 0,5% стабилизатора аминоуксусной кислоты и бензалкония хлорида 0,00010 г/мл. Срок хранения 2 года при 4-8 С°.

Лекарственная форма в виде ректальных или вагинальных суппозиториев содержит действующее вещество - гексапептид в разовой дозе 5-0,05 мг, в качестве стабилизатора аминоуксусную кислоту 20-0,5 мг (ВФС 42-599-92, НД 42-11253-00) или другого зарегистрированного в России аналогичного качества, твин 80 (Полисорбат 80) (ФС 42-2540-88) 120-150 мг, воды для инъекций (ФС 42-2620-97) и твердого жира (ФС 42-346-97, НД 42-8991-98) до получения суппозитория массой 1,2-2,5 г. Срок хранения 2 года при 4-8 С°.

Заявленное лекарственное средство обладает следующими новыми свойствами, которые не являются очевидными для специалиста в данной области техники:

- преодоление множественной лекарственной устойчивости клеток;

- специфичности действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP);

- повышение безвредности;

- устранение токсических реакций организма;

- создание приемлемых лекарственных форм для профилактики и терапии больных с явлениями множественной лекарственной устойчивости.

Результаты доклинического и клинического изучения предложенного средства демонстрируют, что оно не вызывает выраженной токсической реакции или развитие побочных эффектов.

Экспериментальные и клинические данные показывают, что:

1. Гексапептид обеспечивает преодоление множественной лекарственной устойчивости в 3.000 раз эффективнее по сравнению с веществом по прототипу (пример 3, фиг.5) и обладает достаточной безопасностью в отношении опухолевого роста (пример 4, фиг.7).

2. Заявленное средство обладает специфичностью действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP). Вещество по прототипу - циклоспорин А не обладает подобным действием (пример 3). Гексапептид в концентрации 1,2 нМ увеличивает в 3 раза чувствительность клеток рака гортани человека Нер-2 к специфическому ингибитору белка множественной лекарственной резистентности цитостатическому веществу - арсенату (фиг.4).

3. Гексапептид обладает исключительно низкой токсичностью и обеспечивает широкий резерв терапевтической безопасности. Разовая доза, в тысячу раз превышающая среднюю терапевтическую (1,5 мг/кг), не вызывает гибели экспериментальных животных.

4. В тесте изучения хронической токсичности предложенного лекарственного средства выявлена его безвредность. Колебания гематологических и биохимических показателей при назначении животным лекарственного средства ежедневно, в течение одного месяца, в терапевтической (1,5 мкг/кг) или 10-кратно превышающей терапевтическую (15 мкг/кг) дозе после отмены лекарственного средства возвращаются к исходному уровню.

5. Введение лекарственного средства не вызывает местно раздражающего действия, не обладает аллергенностью и мутагенной активностью.

Лекарственное средство показало хорошие клинические результаты в комплексной химиолучевой терапии рака шейки матки, рака пищевода и других злокачественных опухолей человека. Предложенное средство назначают курсами до начала химиолучевой терапии и в период ее проведения.

Эффективность терапии оценивают по клинико-лабораторным показателям, в том числе по степени патоморфоза опухоли, развитию токсических и лучевых реакций, непрерывности химиотерапии, состоянию окислительно-антиокислительной и иммунной систем организма. Лекарственное средство предпочтительно назначают курсами введения в разовой дозе 1-1,5 мкг/кг массы тела ежедневно перед началом химиолучевой терапии в течение 5-10 дней и непосредственно в период проведения курсов химиотерапии. При необходимости для купирования токсических реакций лекарственное средство назначают после окончания химиолучевой терапии в течение 2-3 недель.

Ниже представлены конкретные примеры получения заявленного вещества, а также примеры, подтверждающие его биологические и лечебные свойства.

Пример 1

Получение действующего вещества

Гексапептид синтезируют по методу твердофазного синтеза на автоматизированном синтезаторе "Beckman-990".

Аминометилполимеразу (1.8 г, 1 ммоль) дают набухнуть в хлороформе в течение 30 минут, затем присоединяют трет-бутоксикарбонил-Gly-ОСН2С6H4СН2СООН (0,65 г, 2 ммоль) с помощью N,N-дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК) (0,4 г, 2 ммоль в 15 мл хлороформа в течение 2 часов). После промывки диметилформамидом полимер обрабатывают 20 мл смеси диизопропилэтиламин-уксусный ангидрид, 2:1 в течение 30 минут. После промывки диметилформамидом и хлороформом полимер обрабатывают 30 мл смеси трифторуксуная кислота-хлороформ 1:1 20 минут, промывают хлороформом и нейтрализуют 7% раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде в течение 10 минут, затем аминоацилполимер промывают диметилформамидом. Присоединения трет-бутоксикарбонил-аминокислоты (Вос-аминокислоты) проводят с помощью симметричного ангидрида Вос-аминокислоты: 4 ммоль Вос-аминокислоты растворяют в 5 мл хлороформа, охлаждают до 0°С, добавляют раствор 2 ммоль ДЦГК в 5 мл хлороформа. После перемешивания в течение 10 минут при 0°С смесь добавляют к пептидилполимеру, приливают 10 мл диметилформамида и перемешивают с пептидилполимером 30 минут при 28°С.

После присоединения очередной аминокислоты пептидилполимер промывают диметилформамидом, хлороформом, затем удаляют защитную Вос-группу.

Удаление динитрофенильной группы: 2 г пептидилполимера перемешивают в течение 1,5 часов при комнатной температуре в 40 мл 20% раствора тиофенола в диметилформамиде. Затем пептидилполимер промывают диметилфорамидом, хлороформом и сушат в вакууме.

Снятие пептида со смолы: 2 г пептидилполимера помещают в реакционный сосуд прибора для работы с фтористым водородом, добавляют 1 г n-крезола, охлаждают жидким азотом и после вакуумирования сосуда перегоняют в него 10 мл жидкого безводного фтористого водорода. Доводят температуру реакционного сосуда до -20°С и перемешивают полимер в течение 30 минут, поддерживая температуру смеси ССl4-твердый СO2, затем помещают реакционный сосуд в ледяную баню и выдерживают при перемешивании еще 30 минут. После этого втористый водород упаривают на водоструйном насосе, полимер промывают на фильтре диэтиловым эфиром. Затем пептид экстрагируют 20% уксусной кислотой и лиофилизируют.

Удаление трифторацетильной группы. Снятый со смолы пептид обрабатывают 60 мл одномолярного водного раствора пиперидина при 0°С в течение 2 часов. Затем реакционную смесь лиофилизируют и обессоливают гельфильтрацией на колонке Sephadex G-25 в 5% уксусной кислоте.

Пример 2. Специфичность действия предложенного вещества по сравнению с прототипом

Исследование влияния гексапептида (заявленного вещества) и циклоспорина А (вещества по прототипу) на специфичность действия в отношении транспортных белков, ответственных за МЛУ.

Клетки рака гортани человека Нер-2 в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma) и 40 мкг/мл гентамицина (Sigma) рассевали в 96-луночный планшет по 0.1 мл при концентрации 50000/мл, добавляли исследуемые агенты и инкубировали трое суток при 37°С в атмосфере с 5% CO2. По окончании инкубации клетки окрашивали 0.02% фиолетовым кристаллическим (Sigma) в 20% этаноле 10 минут, затем раствор красителя удаляли, промывали ячейки водой и добавляли 0.1% раствор SDS для экстракции красителя из клеток. Оптическую плотность определяли при 570 нм на спектрофотометре Multiscan Plus. Эффект воздействия определяли по формуле: No/Nk=(Do-D)/(Dk-D)100%, где Do, Dk, D - оптические плотности в опыте, контроле и фоновая, соответственно, a No/Nk - выживаемость клеток: количество живых клеток в опыте относительно контроля.

Клетки Р388 выращивали в брюшной полости мышей DBA2. Резистентные к винкристину клетки Р388 получали путем их выращивания в мышах-самцах DBA2 при воздействии 1 мкг/г винкристина (Гедеон, Рихтер, Венгрия). Винкристин вводили внутрибрюшинно через сутки после прививки опухоли (106 клеток на мышь). После нарастания клеток их перевивали и снова вводили 1 мкг/г винкристина. Процедуру повторяли шесть раз. Полученный штамм клеток обозначили Р388ВР (винкристин-резистентный).

Все измерения флуоресценции проводили на спектрофотометре Perkin-Elmer MF44 при постоянном перемешивании и температуре 37°С. Длины волн возбуждения и эмиссии для кальцеина 493 и 515 нм. Клетки Нер-2 (1-1.5 млн) помещали в кювету прикрепленными к прозрачной пластиковой пластинке, а клетки Р388 (500 тыс) были в суспензии. При определении образования кальцеина кальцеин AM добавляли в кювету, прописывали скорость образования кальцеина в контроле, затем вводили в кювету исследуемые агенты и продолжали регистрировать увеличение флуоресценции. Эффект воздействия оценивали коэффициентом увеличения скорости после добавления агента. При исследовании скорости выхода из клеток кальцеина клетки предварительно нагружали этим же флуорохромом в присутствии 1 мкг\мл циклоспорина А для подавления их откачки из клеток, затем отмывали и хранили до измерения на льду. При определении выхода кальцеина из клеток в суспензии (Р388ВР) в кювету перед клетками добавляли 2 мкМ Со2+ для тушения флуоресценции внеклеточного кальцеина, и таким образом регистрировался кальцеин только в клетках. Вначале определялась скорость выхода флуорохрома в контроле, затем в кювету добавляли исследуемый агент и продолжали запись уменьшения кальцеина в клетках. Эффект воздействия оценивали отношением скоростей выхода в контроле и после введения агента. Все эффекты пептида сравнивали с действием циклоспорина А.

Скорость образования в кювете кальцеина при добавлении в среду кальцеина AM без ионов Со, позволяет определять активность транспортных белков, откачивающих из клеток кальцеин AM, но не белков, способных транспортировать из клеток кальцеин (MRP), поскольку в этом случае регистрируется весь кальцеин: в клетках и вне клеток.

Циклоспорин А, как преимущественный ингибитор P-gp, эффективно увеличивает скорость образования кальцеина в кювете с клетками Р388ВР, в которых МЛУ обусловлено в основном сверхэкспрессией P-gp. Коэффициент увеличения скорости образования кальцеина в клетках Р388 ВР циклоспорином А достигает 7±0.4 при его концентрации 0.8 и более мкМ. Гексапептид не действует на скорость образования кальцеина в кювете с клетками Р388ВР вплоть до 1.2 мкМ. Однако в присутствии Со (тушение внеклеточного кальцеина) гексапептид уже при концентрации 12 нМ увеличивает скорость образования кальцеина в этих клетках в два раза (фиг.1). Результаты показывают, что гексапептид не действует на активность P-gp (откачка кальцеина AM в клетках Р388ВР), но ингибирует MRP, который транспортирует из клеток кальцеин. Действительно, при исследовании скорости выхода кальцеина из предварительно им нагруженных клеток Р388ВР оказалось, что гексапептид эффективно подавляет MRP: скорость выхода кальцеина снижается в 1.5 раза уже при концентрации пептида 1.2 нМ, а при концентрации 120 нМ коэффициент ингибирования скорости равен 2.6 (фиг.2).

Напротив, циклоспорин А проявляет крайне низкую эффективность в ингибировании MRP: коэффициент равен 1.3±0.1 при концентрации 0.8 мкМ.

Полученные данные демонстрируют, что гексапептид (заявленное вещество) не действует на активность P-gp (откачка кальцеина AM в клетках Р388ВР), но ингибирует MRP, который в небольшом количестве также присутствует в клетках Р388ВР и транспортирует из клетки кальцеин. Аналогичные выводы следуют из результатов, полученных на другой модели - клетках Нер-2. Белки MRP в клетках Нер-2, в отличии от клеток Р388ВР, несут доминирующий вклад в появление МЛУ. Поэтому гексапептид в клетках Нер-2 ингибирует МЛУ гораздо более эффективно, чем в клетках Р388ВР. Так гексапептид уже в концентрации 1.2 нМ в два раза увеличивает скорость образования кальцеина в клетках (в присутствии ионов Со), а при возрастании концентрации пептида до 120 нМ коэффициент увеличения скорости образования кальцеина достигает 3.7 (фиг.2). Таким образом, гексапептид (заявленное вещество), в отличии от циклоспорина А, обладает выраженным специфическим действием в отношении ингибирования транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP).

Пример 3

Исследование влияния гексапептида и вещества по прототипу (Циклоспорина А) на преодоление множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток Нер-2.

Активность в клетках транспортных белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость, определяли по скорости выхода из клеток родамина 123 (R123) ("ICN", США). Известно, что отношение скоростей выхода R 123 из клеток в норме и при полном подавлении активного транспорта минус единицу: (R-1)max равно отношению активного и пассивного транспорта и, следовательно, характеризует активность в клетках белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость. Клетки Нер-2 высевали в количестве 1-1.5 млн в среде DMEM+10% эмбриональной телячьей сыворотки с гентамицином на пластинки (50×9×2 мм), помещенные в чашки диаметром 6 см, объем среды 8 мл. Инкубировали в СО2 инкубаторе. Через сутки инкубации в CO2 инкубаторе при 37°С клетки отмывали в среде RPMI1640 и нагружали их R123, 0.5 мкг/мл в присутствии ингибитора транспортных белков циклоспорина А, 3 мкг/мл в среде RPMI1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки, в течение 60 мин при 37°С. После инкубации клетки трижды (по 10 мин) отмывали от красителя холодным (2°С) физиологическим раствором с 1% эмбриональной сывороткой. После отмывания и до момента измерения пластинки с клетками хранили в растворе Хэнкса с 0.5% сыворотки на льду. Отмытую пластинку с клетками ставили в кювету спектрофотометра MF44 Perkin-Elmer с раствором Хэнкса и 0.5% эмбриональной сывороткой, объем 3 мл, 37°С и определяли увеличение количества R123 в среде при постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и эмиссии 488 и 520 нм соответственно. В конце эксперимента для определения максимального количества R123 в клетках клетки разрушали добавлением в кювету 0,02% дигитонина ("Sigma", США).

При исследовании действия ингибиторов на выход R123 в кювету через несколько минут нормального выхода красителя добавляли ингибитор в необходимой концентрации. Определение контрольной и ингибированной констант скоростей выхода родамина на одной пластинке уменьшает ошибку определения их отношения, необходимого для получения значения R. На фиг.3 приведена кинетика увеличения R 123 в среде в контроле (1), после добавления циклоспорина А (2) и дигитонина (3). Общее количество родамина в клетках определяли по разнице уровней флуоресценции после добавления дигитонина и перед добавлением в кювету клеток. Относительное количество R123 в клетках (W) определяли по формуле: N=1-{It-I0/Imax-I0}, где It, I0, Imax - флуоресценция R123 в среде в моменты времени t, 0 и максимальная, после добавления дигитонина, соответственно. Как видно на фиг.4, количество R123 в клетках в контроле и после добавления ингибитора уменьшается по экспоненте, поскольку в полулогарифмическом масштабе эти кинетики описываются прямыми линиями. В данном примере Циклоспорин А, 1 мкг/мл в 3.8 раза в данном опыте снижал константу скорости выхода родамина 123: R=2.8.

Описанным выше методом определяли влияние заявленного гексапептида и для сравнения известного ингибитора МЛУ - циклоспорина А на выход R123 из клетки Нер-2. Влияние каждой концентрации агентов на выход R123 определяли в нескольких опытах. На фиг.5 приведены средние значения R с квадратичными отклонениями, для концентраций, где было больше 3 повторностей.

Как видно из фиг.5, гексапептид (ГП) максимально ингибирует выход R123 при оптимуме концентрации 1нг/мл. Величина R для гексапептида равняется 3.2. Аналогичное значение R для циклоспорина А достигается при концентрации, более чем в три тысячи раз большей, чем для заявленного гексапептида.

Таким образом, заявленное вещество - гексапептид обеспечивает преодоление множественной лекарственной устойчивости более чем в три тысячи раз эффективнее по сравнению с веществом по прототипу - циклоспорином А.

Пример 4

Онкологическая безопасность и безвредность заявляемого гексапептида.

Клетки рака гортани человека Нер-2 в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина рассевали в пенициллиновые флаконы по 200 тыс на флакон в объеме 2 мл. Гексапептид в дозе 1 мкг/мл добавляли через 3 час после посева клеток (когда они уже прикреплялись к стеклу) и оставляли в среде на весь оставшийся период инкубации. Через 3 суток после посева клетки открепляли от стекла трипсином и подсчитывали количество живых клеток, не окрашенных 0.04% раствором трипанового синего.

Таким образом, гексапептид не вызывает стимуляцию роста опухолевых клеток. Напротив, гексапептид повышает чувствительность клеток опухоли к цитостатическому препарату арсенату и тормозит выживаемость клеток Нер-2 (фиг.6). На фиг.7 приведены данные по действию гексапептида на рост клеток Нер-2.

Видно, что гексапептид в концентрации 1 мкг/мл практически не влияет на рост опухолевых клеток Нер-2 (фиг.7).

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что гексапептид (заявленное вещество) является безопасным в отношении стимуляции опухолевого роста.

Пример 5

Больная Р., 37 лет. Клинический диагноз: рак шейки матки III стадии (Т3NX-1М0). Обследование больной включало клиническую и лабораторную оценку при поступлении и в период лечения. Общее состояние больной средней тяжести. На фоне практически нормальных значений показателей окислительно-антиокислительной системы у больной отмечена резкая иммуносупрессия по показателю процентного содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов. Процентное содержание CD3, CD4, CD8, СD16-позитивных клеток снижено относительно среднестатистических нормальных значений в два раза. Больная до начала противоопухолевого лечения получила курс из 5-кратного введения гексапептида по 1 мл 0.005% раствора подкожно ежедневно в течение 5 дней. Химиолучевое лечение проводили по схеме: 500 мг 5-фторурацила (суммарная доза 2500 мг). В течение всего курса химиолучевой терапии больная получала по 1 мл 0.005% раствора гексапептида (биопоэтина) 5 раз ежедневно. Через 2 дня после окончания 5-фторурацила больной проводили дистанционное облучение в разовой дозе 4 Гр на фоне внутривенного введения 30 мг циспластина в течение 3 дней (суммарная доза циспластина 90 мг). Далее продолжали лучевое лечение в режиме ежедневного мультифракционирования дозы. Облучение проводили до очаговой дозы 20 Гр на область первичного очага и зон регионарного метастазирования. Затем присоединяли внутриполостную гамма-терапию (10 фракций по 5 Гр), а дистанционное облучение продолжали на зоны параметрального метастазирования до суммарной дозы 44 Гр. Выраженных побочных и постлучевых реакций у больной не отмечено, что позволило обеспечить непрерывность курсов химиолучевой терапии. Явлений развития МЛУ не отмечено. В тоже время среднестатистические показатели химиолучевой терапии больных раком шейки матки III стадии демонстрируют появление специфических реакций, требующих длительного перерыва в терапии у 33-34%, развитие эпителиита в 78-87%, у 55-58% островчатый эпителиит и у 15-20% пленчатый эпителиит, требующий 4-5 месячного лечения. Существенным является и тот факт, что показатели иммунитета и общая формула крови после химиолучевой терапии у больной практически не изменились, в то время как в контрольной группе, не получавшей раствор гексапептида, после химиотерапии отмечается их дальнейшее снижение. В результате проведенного лечения у больной достигнута полная резорбция опухоли.

Таким образом, заявленное средство сокращает явления токсикоза, развитие побочных эффектов и лучевых реакций химиолучевой терапии.

Пример 6

Больной Н., 52 года.

Клинический диагноз: рак пищевода III стадии (T3-4N0-2MOP3). При поступлении общее состояние больного средней тяжести. Лабораторные показатели общей формулы крови без выраженных изменений. Отмечен значительный дисбаланс показателей окислительно-антиокислительной системы на фоне умеренной иммуносупрессии.

Состояние окислительно-антиокислительной системы у больных оценивали по интенсивности перекисного окисления липидов путем измерения в сыворотке крови концентрации малонового диальдегида (МДА, мкмоль/л) и эндогенных антиоксидантов: лактоферрина (ЛФ, мг/л), церулоплазмина (ЦП, усл. ед.) и антиокислительного фермента каталазы (Кат, усл. ед). Анализ процентного содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов проводили к поверхностным рецепторам CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы/индукторы), CD8 Т (супрессоры/цитотоксические лимфоциты), CD16 естественные киллеры), CD25 (активированные лимфоциты, экспрессирующие рецептор к интерлейкину-2), CD72 (В-лимфоциты). При поступлении больного в отделение химиотерапии отмечен значительный дисбаланс окислительно-антиокислительной системы: МДА - 3,5 (норма 3,0±0,1), КАТ - 450 (норма 576±48), ЦП - 0,59 (норма 0,53±0,04), ЛФ - 3,8 (норма 1,0±04). В тоже время показатели лимфоцитарного звена находились практически в пределах нормальных значений. Поскольку ЦП и ЛФ являются белками острой фазы воспаления, повышение их уровня в сыворотке крови отражает наличие воспалительного процесса, сопутствующего развитию рака пищевода. Перед проведением химиолучевого лечения больному назначали 5-кратное введение гексапептида внутримышечно ежедневно по 1 мл 0,1% раствора 5 раз в день в течение 5 дней. Комплексную химиолучевую терапию проводили по следующей схеме: 750 мг 5-фторурацила (5-ФУ) вводили внутривенно в течение 5 дней (суммарная доза 3750 мг); через 2 дня после окончания введения 5-ФУ больного облучали по схеме динамического фракционирования дозы в разовой дозе 4 Гр на фоне внутривенного введения циспластина в дозе 30 мг в течение 3 дней (суммарная доза циспластина 90 мг, СОД 12 Гр). В течение всего указанного периода химиолучевой терапии больной получал гексапептид в разовой дозе 100 мкг дважды в день (утром и вечером). С 11 дня продолжали лучевую терапию в режиме классического фракционирования дозы с разовой очаговой дозой 2 Гр (СОД 40 Гр). Выраженных побочных и постлучевых реакций у больного не отмечено, что позволило обеспечить непрерывность курсов химиолучевой терапии. В течение всего курса химиолучевой терапии показатели активности естественного клеточного и Т-лимфоцитарного звена иммунитета, продукция белков острой фазы воспаления существенно не менялись. Отмечено улучшение показателей окислительно-антиокислительной системы организма и снижение концентрации малонового диальдегида до 3,2 мкмоль/л. Симптомов МЛУ не отмечено. В результате проведенного лечения у больной раком пищевода III стадии достигнуто значительное улучшение общего состояния, сокращение явлений токсикоза, устранение побочных эффектов и лучевых реакций химиолучевой терапии полная резорбция опухоли.

Таким образом, заявленное средство сокращает явления токсикоза, развитие побочных эффектов и лучевых реакций химиолучевой терапии. В результате проведенного лечения у больного достигнута полная резорбция опухоли.

Наблюдение в течение 12 месяцев за больным, прошедшим курс лечения с применением заявленного средства, не выявили рецидива заболевания.

Пример 7

Больная П., 54 года.

Заболевание проявилось болями за грудиной, слабостью, похуданием. При обследовании на основании эндоскопии, рентгеноконтрастного исследования выявлен рак средне- и нижнегрудинных отделов пищевода, протяженностью около 10 см с метастатическим поражением региональных лимфатических узлов. Гистологическое исследование биоптата опухоли - плоскоклеточный рак. Перед проведением химиолучевого лечения больной назначали 5-кратное введение гексапептида в виде ректальных суппозиторий ежедневно по 5 мг 5 раз в день в течение 5 дней.

На первом этапе комбинированного лечения проведено два курса полихимиотерапии.

В течение всего периода химиолучевой терапии больная получала лечение заявленным средством в виде ректальных суппозиторий по 50 мкг дважды в день (утром и вечером).

В период проведения полихимиотерапии сильно выраженных явлений токсикоза не наблюдалось: отмечена умеренная нейтропения, снижение показателей Т-клеточного иммунитета, эпизодически диарея, тошнота, головокружение.

При контрольных исследованиях опухоль пищевода не определялась, значительно уменьшились размеры региональных лимфоузлов. Исследования гистологического и биоптического материала наличие опухолевых клеток не подтвердили. Гистологическое исследование биологического материала субтотальной резекции пищевода позволило выявить полный лечебный патоморфоз опухоли. В лимфатических узлах метастазов не выявлено.

Пример 8

Больная П., 1938 г.р., поступила с диагнозом: РМЖ T4cN2Mo с изъязвлением кожи молочной железы.

Из анамнеза: больная около 2-х лет, когда впервые заметила опухолевое образование в левой молочной железе, которое постепенно увеличивалось.

При поступлении: жалобы на наличие опухоли в левой груди с кровоточащим изъязвлением, общую слабость, головную боль, тошноту, боли в левой молочной железе.

Результаты обследования:

В левой молочной железе визуально на границе верхних квадрантов бугристое опухолевое образование в виде карбункула с изъязвлением в центре, с кровянистыми выделениями и неприятным запахом. На маммограммах: в левой молочной железе опухолевый узел более 10 см в диаметре с инфильтрацией кожи и деструкцией в центре (язвой). Маммосцинтиграфия: очаги гиперфиксации 99 Тс диаметром около 10 см в левой молочной железе и около 6 см в левой подмышечной области. По результатам ультразвукового исследования определяется округлое шаровидное образование с гипоэхогенными контурами диаметром 92 мм на границе верхних квадрантов левой молочной железы. Гистологически: опухолевые клетки низкодифференцированной аденокарциномы.

Заключение: рак молочной железы с распадом опухоли, метастаз в подмышечные лимфатические узлы слева.

На область левой молочной железы с двух тангенциальных встречных полей и фигурным полем на зоны регионарного лимфооттока слева начата лучевая терапия на линейном ускорителе (ЛУ-20-SL с энергией тормозного излучения 6 МЭВ) в режиме среднего фракционирования дозы; по 3 Гр в день 5 раз в неделю на область опухоли до суммарной дозы (СОД) 45 Гр, эквивалентной режиму обычного фракционирования по 2 Гр в день - СОД 60 Гр, и на зоны регионарного лимфооттока слева (надподключично-подмышечную и парастернальную зоны) по 3 Гр до СОД 33-36 Гр, эквивалентной 44-48 Гр обычного фракционирования.

Состояние больной после курса облучения удовлетворительное, опухолевое изъязвление в стадии рубцевания, выделений практически нет. Спустя 2 недели начата полихимиотерапия по схеме CMF, которая проводилась в течение 4-х недель 1 раз в неделю. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. Схема CMF включала в себя внутривенное капельное введение 1 г 5-фторурацила и 40 мг метотрексата и внутримышечное - 1 г циклофосфана. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде инраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. Химиолучевое лечение больная переносила удовлетворительно: лейкоциты - 4,5×109, тромбоциты - 200×103/л. Больная выписана из клиники в удовлетворительном состоянии.

Повторный курс CMF. Больной было ведено внутривенно 40 мг метотрексата и 1 г 5-фторурацила и внутримышечно 1 г циклофосфана. Состояние после полихимиотерапии удовлетворительное. На месте изъязвления молочной железы сформировался рубец. Регионарные лимфатические узлы не определялись, молочная железа мягкая, свежих инфильтратов нет. На маммограммах опухолевый узел по сравнению с данными маммографии уменьшился в диаметре до 5 см. В дальнейшем начат курс полихимиотерапии по той же схеме и в тех же дозах. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг.

Больная была выписана из клиники под наблюдение онколога, а затем вновь госпитализирована для проведения 4-го курса полихимиотерапии. Состояние ее удовлетворительное, на месте язвы гладкий рубец, инфильтративных явлений нет, подмышечные и подключичные лимфатические узлы не определялись, правая молочная железа не изменена. На маммограммах опухолевый узел в виде фиброзной ткани уменьшился по сравнению с последними данными маммографии до 3.8 см. Клинический анализ крови в норме.

Начат 2-недельный курс химиотерапии по схеме CMF. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. Полихимиотерапию больная переносила удовлетворительно: лейкоциты - 4,0×109, тромбоциты - 200×103/л.

При клинико-рентгенологическом обследовании (осмотр, маммография, УЗИ молочных желез и органов брюшной полости, рентгенография и томография легких и средостения, остеосцинтиграфия, клиническое и биохимическое исследование крови и мочи) данных за наличие рецидива опухоли в молочной железе и метастазов не получено.

Проведен 5 курс 2-недельный курс полихимиотерапии по схеме CMF, который больная перенесла хорошо. Развитие МЛУ не отмечено. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 50 мкг. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 50 мкг

Состояние больной удовлетворительное. При клинико-рентгенологическом обследовании данных за продолженный рост опухоли не получено. Проведен снова 2-недельный курс полихимиотерапии по CMF, который больная по-прежнему перенесла удовлетворительно. Выписана под наблюдение районного онколога. На контрольном осмотре (через 15 месяцев от начала лечения) - без признаков рецидива заболевания.

1. Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости, содержащее пептид и целевую добавку, отличающееся тем, что в качестве пептида оно содержит гексапептид структурной формулы: лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме раствора для подкожных и внутримышечных инъекций, а в качестве целевой добавки содержит аминоуксусную кислоту,

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме спрея для дозированного применения, а в качестве целевой добавки содержит аминоуксусную кислоту и бензалкония хлорид.

4. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме суппозитория, а в качестве целевой добавки содержит аминоуксусную кислоту, твин 80 (Полисорбат 80), воду для инъекций и твердый жир.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к пептидам, индуцирующим цитотоксические Т-клетки, общей формулы (1), где Х представляет собой тирозиновый остаток или метиониновый остаток; каждый из Y и Z представляют собой простую связь; R1 представляет собой атом водорода; R2 представляет собой гидроксил; R3 представляет собой водород, амино, C1-6 алкилкарбониламино, замещенный 1-2 заместителями, выбранными из группы, состоящей из карбокси и амино; R4 представляет собой карбокси или группу формулы (2), где W представляет собой аминокислотный остаток; m равен 1 и n равен целому числу 0-1, при условии, что когда n равен 0, R3 представляет собой водород; их фармацевтически приемлемым солям, и их применению в иммунотерапии рака.

Изобретение относится к ингибированию или снижению уровня высвобождения медиаторов воспаления из воспалительных клеток путем подавления механизма, ассоциированного с высвобождением медиаторов воспаления из гранул воспалительных клеток путем использования вариантов пептида MANS.

Изобретение относится к применению биологически активного пептида, который представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID No.1, для получения лекарственного средства для модуляции, по меньшей мере, одного из следующих состояний: усталости, уровня запаса гликогена в печени и уровня молочной кислоты в крови.

Изобретение относится к способам и реагентам мечения вектора, такого как пептид, включающим взаимодействие соединения формулы (I) с соединением формулы (II) в присутствии Cu(I) катализатора.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к химическим молекулам пептидной природы для стимуляции роста и/или проявления устойчивости к заболеваниям у аквакультуры или другой животной продукции.

Изобретение относится к области фармакологии и медицины. .

Изобретение относится к соединениям формулы ,гдеХ представляет собой S;R1 и R2, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют 5-членный карбоцикл, замещенный заместителями, вплоть до двух, выбранными из алкила и CF3;R3 выбран из группы, состоящей из атома водорода и C1-8-алкила; R3a представляет собой атом водорода; R4 представляет собой атом водорода; R4a представляет собой атом водорода; R5 представляет собой атом водорода; R5a представляет собой атом водорода; R6 представляет собой атом водорода; R6a представляет собой атом водорода; R7 представляет собой атом водорода; или к их фармацевтически приемлемым солям.

Изобретение относится к С-Фенил-1-тиоглюцитолам формулы (I),[Формула I] ,где Х представляет собой атом водорода или C1-6алкильную группу, Y представляет собой C 1-6алкиленовую группу или -O-(СН2)n - (где n равен целому числу от 1 до 5), и Z представляет собой -CONHRA или -NHCONHRB (при условии, что когда Z представляет собой -NHCONHRB, n не равен 1), где RA представляет собой C1-6алкильную группу, замещенную 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидроксильной группы и -CONH2, и RB представляет собой атом водорода или C1-6алкильную группу, замещенную 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из гидроксильной группы и -CONH2, или к их фармацевтически приемлемым солям или к их гидратам.

Изобретение относится к новым конформационно устойчивым соединениям общей формулы (I), которые имитируют вторичную структуру областей биологически активных пептидов и белков, имеющих обратную конфигурацию, являются миметиками с обратной конфигурацией.

Изобретение относится к области ветеринарии. .
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для изучения этиологии и патогенеза пародонтита, а также для определения тактики лечения пародонтита в случае, когда явные признаки обострения пародонтита отсутствуют.

Изобретение относится к способу селективного получения 6R,7R транс-стереоизомера 6-амино-7-гидрокси-4,5,6,7-тетрагидроимидазо[4,5,1-jk][1]бензазепин-2[1Н]-она и 6R,7R транс-стереоизомера зилпатерола или их солей для приготовления лекарственных средств.

Изобретение относится к соединению формулы I, его изомеру формулы IA, смеси его изомеров IA/C, способам их получения, а также к способам получения соединения формулы IVA из соединения формулы IA, включающим восстановление и удаление защиты с соединения формулы IA путем гидрогенолиза, используя Н2 и каталитическое количество Pd/C, в присутствии трифторуксусной кислоты с получением соединения формулы VA; дальнейшее взаимодействие этого соединения с Cbz-t-leu-OH, EDC и HOBt с получением соединения формулы VIA; взаимодействие соединения VIA с Н2 и каталитическим количеством Pd/C в присутствии лимонной кислоты с получением амина и взаимодействие данного амина и 4-амино-3-хлорбензойной кислоты в присутствии CDMT и NMM с получением соединения формулы IVA.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, может быть использовано для профилактики послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости. .
Наверх