Олигорибонуклеотиды и способы их применения для лечения острой почечной недостаточности и других заболеваний

Данное изобретение относится к соединению в виде двухцепочечной РНК, которое вызывает отрицательную регуляцию экспрессии гена р53 человека. Соединение имеет структуру: 5'ugaagggugaaauauucuc-Z3' 3'Z'-acuucccacuuuauaagag5', где составляющие его рибонуклеотиды могут быть как 2'-O-Ме-модифицированными по сахарному остатку, так и немодифицированными. A Z и Z', если присутствует, означает dTdT, который ковалентно присоединен на 3'-конце цепи. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей это соединение и фармацевтически приемлемый носитель. Полученное соединение или фармацевтическая композиция могут использоваться для лечения пациента, страдающего от острой почечной недостаточности или ишемического-реперфузионного повреждения, вызванных хирургическим вмешательством, или для лечения пациента, страдающего от индуцированной цисплатином глухоты. Также введение данного соединения способствует улучшению выживаемости трансплантированной ткани после трансплантации у пациента. 10 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 табл.

 

На протяжении этой заявки цитируются различные патентные и научные публикации. Раскрытия этих публикаций в их полном виде включены тем самым в качестве ссылки в эту заявку для более полного описания состояния области, к которой относится это изобретение.

Уровень техники

siPHK и интерференция РНК

Интерференция РНК (PHKi) является феноменом, включающим в себя зависимый от двухцепочечной (дц) РНК геноспецифический посттранскрипционный сайленсинг генов. Первоначально попытки исследования этого феномена и манипуляции клетками млекопитающих экспериментально были тщетными вследствие активного неспецифического антивирусного защитного механизма, который активировался длинными молекулами дцРНК; см. Gil et al. 2000, Apoptosis, 5:107-114. Позднее было обнаружено, что синтетические дуплексы, состоящие из 21 нуклеотида РНК, могли опосредовать геноспецифическую PHKi в клетках млекопитающих без стимуляции общих антивирусных защитных механизмов (см. Elbashir et al. Nature 2001, 411:494-498 и Caplen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98:9742-9747). В результате малые интерферирующие РНК (siPHK), которые являются короткими двухцепочечными РНК, стали мощными инструментами в попытке понимания функции генов.

Таким образом, интерференцией РНК (PHKi) называют процесс последовательность-специфического посттранскрипционного сайленсинга генов у млекопитающих, опосредованный малыми интерферирующими РНК (siPHK) (Fire et al., 1998, Nature 391, 806) или микроРНК (miRNA) (Ambros V. Nature 431:7006, 350-355 (2004); и Bartel DP. Cell. 2004 Jan 23; 116(2):281-97 MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function). Соответствующий процесс у растений называют обычно специфическим посттранскрипционным сайленсингом генов или РНК-сайленсингом, а у грибов называют также подавлением. siPHK является двухцепочечной молекулой РНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию или производит сайленсинг (предотвращает экспрессию) гена/мРНК ее эндогенной (клеточной) копии. Интерференция РНК основана на способности молекул дцРНК вступать в специфический белковый комплекс, который затем нацеливается на комплементарную клеточную РНК и подвергает ее специфической деградации. Таким образом, реакция интерференции РНК имеет в своей основе эндонуклеазный комплекс, содержащий siPHK, обычно называемый РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, имеющей последовательность, комплементарную антисмысловой цепи этого siPHK-дуплекса. Расщепление РНК-мишени может иметь место в середине района, комплементарного антисмысловой цепи siPHK-дуплекса (Elbashir et al. 2001, Genes Dev., 15, 188). Более подробно, более длинные дцРНК расщепляются на короткие (17-29 п.н.) дцРНК-фрагменты (также называемые короткими ингибирующими РНК - “siPHK”) РНКазами типа III (DICER, DROSHA, etc., Bernstein et al., Nature, 2001, v.409, p.363-6; Lee et al., Nature, 2003, 425, p.415-9). Белковый комплекс RISC узнает эти фрагменты и комплементарную мРНК. Весь процесс достигает кульминации при расщеплении мРНК-мишени под действием эндонуклеазы (McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, v.3, p.737-47; Paddison & Hannon, Curr. Opin. Mol. Ther. 2003 Jun; 5(3):217-24). В отношении информации об этих терминах и предлагаемых механизмах см. Bernstein E., Denli AM. Hannon GJ: 2001 The rest is silence. RNA. I; 7(11): 1509-21; Nishikura K.: 2001 A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. I 16; 107(4): 415-8 и РСТ публикацию WO 01/36646 (Glover et al.).

Отбор и синтез siPHK, соответствующих известным генам, описаны в обширной литературе; см., например, Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. 2004 Improved and automated prediction of effective siRNA Biochem. Biophys, Res. Commun. Jun 18; 319(1): 264-74; Sioud M, Leirdal M., 2004, Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods Mol. Biol.; 252:457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. 2004, Gene specific siRNA selector Bioinformatics. I 12; 20(3): 430-2 и Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Guidelines for the selection of higly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res. 2004 I 9; 32(3):936-48. См. также Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 I 24; 43(7):192-7. См. также РСТ публикации WO 2004/015107 (Atugen) и WO 02/44321 (Tuschl et al.), а также Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis, RNA 2003 Sep; 9(9):1034-48 и I патент №5898031 и 6107094 (Crooke) в отношении получения модифицированных/более стабильных siPHK.

Несколько групп исследователей описали получение векторов на основе ДНК, способных генерировать siPHK в клетках. Этот способ обычно включает в себя транскрипцию коротких шпилечных РНК, которые подвергаются эффективному процессингу с образованием siPHK в клетках. Paddison et al. PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui et al. PNAS 2002, 8:5515-5520; и Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553. В этих сообщениях описаны способы получения siPHK, способных специфически нацеливаться на многочисленные эндогенно и экзогенно экспрессируемые гены.

Недавно siPHK успешно использовали для ингибирования в организме приматов; подробнее см. Tolentino et al., Retina 24(1) February 2004 I 132-138.

Ген и полипептид р53

Ген р53 человека является хорошо известным и в высокой степени исследованным геном. Полипептид р53 играет ключевую роль в клеточных механизмах стрессовых реакций посредством превращения различных стимулов, например разрушающих ДНК условий, таких как гамма-излучение, нарушение регуляции транскрипции или репликации и неопластической трансформации, в сигнал для остановки клеточного роста или апоптоза (Gottlieb et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta, 1287, p.77). Полипептид р53 является существенным для индукции запрограммированной смерти клеток или «апоптоза» в качестве реакции на такие стимулы.

Большинство противораковых терапий повреждают или убивают также и нормальные клетки, которые содержат нативный р53, вызывая тяжелые побочные эффекты, ассоциированные с повреждением или смертью здоровых клеток. Поскольку такие побочные эффекты в высокой степени определяются р53-опосредованной смертью нормальных клеток, в качестве терапевтической стратегии во избежание этих тяжелых токсичных событий была предложена временная супрессия р53 во время острой фазы противораковой терапии. Это было описано в Патенте США №6593353 и в Komarov PG et al., 1999, A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy, Science, 285(5434):1651, 1653. Было показано, что р53 участвует в индуцированной химиотерапией и облучением алопеции (Botcharev et al., 2000, p53 is essential for Chemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research, 60, 5002-5006).

Алопеция

Недавно были получены разительные успехи в понимании молекул и путей, регулирующих образование волосяных фолликулов и рост волос. Химиотерапия нарушает пролиферацию кератиноцитов матрикса в волосяной луковице, которые образуют волосяной стержень. Это заставляет волосяные фолликулы входить в стадию дистрофической регрессии, при которой целостность волосяного стержня оказывается нарушенной, и затем этот волос разрывается и выпадает. Поскольку более чем 90% фолликулов волосистой части головы в любой момент находятся в стадии роста, эти волосы быстро выпадают после химиотерапии, и, следовательно, такая алопеция является быстрой и обширной (George Cotsarelis and Sarah E. Millar, 2001, Towards a molecular understanding of hair loss and its treatment, TRENDS in Molecular Medicine Vol.7, №7). Химиотерапевтическими лекарственными средствами, которые с наибольшей вероятностью вызывают выпадение волос, являются цисплатин, цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, ифосфамид и винкристин. Индуцированная облучением общая алопеция наблюдается фактически у 100% пациентов, которые получают облучение всего головного мозга (WBR), в частности, 3000 рад и более.

Выпадение волос является одним из наиболее нежелательных побочных действий химиотерапии среди пациентов с раком, хотя выпавшие волосы со временем снова вырастают после химиотерапии. С точки зрения пациента, выпадение волос (алопеция) стоит на втором месте только после тошноты в качестве вызывающего беспокойство побочного действия химиотерапии. Приблизительно 75% пациентов оценивают индуцированное химиотерапией выпадение волос как событие, вызывающее такое же или большее расстройство, что и вызванная раком боль.

Таким образом, хотя нарушение роста волос не представляет угрозу жизни, его огромное влияние на социальные взаимодействия и на психологическое благополучие пациентов является несомненным. Эта потребность в способах лечения выпадения волос питает мультимиллиардную (в долларах) промышленность. Несмотря на это, большинство продаваемых в настоящее время продуктов неэффективно, что подтверждается тем фактом, что Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) одобрило только два способа лечения выпадения волос. Ни одна из известных терапий и ни одно из известных лекарственных средств не является эффективным в отношении индуцируемой лечением рака алопеции.

Острая почечная недостаточность (ОПН) (ARF)

ОПН является клиническим синдромом, характеризующимся быстрым ухудшением почечной функции, развивающимся в течение нескольких дней. Основным признаком ОПН является резкое уменьшение скорости клубочковой фильтрации (GFR), приводящее к удерживанию азотистых продуктов выделения (мочевины, креатинина). В общей мировой популяции ежегодно имеют место 170-200 случаев тяжелой ОПН на миллион населения. К настоящему времени не существует специфической терапии для установленной ОПН. Было обнаружено, что несколько лекарственных средств ослабляют токсическую и ишемическую экспериментальную ОПН, о чем судили по более низким уровням сывороточного креатинина, уменьшению гистологического повреждения и более быстрому восстановлению почечной функции на моделях различных животных. Они включают в себя антиоксиданты, блокаторы кальциевых каналов, мочегонные средства, вазоактивные вещества, гормоны роста, противовоспалительные агенты и другие. Однако лекарственные средства, которые исследовались в клинических испытаниях, не обнаруживали преимущества, и их использование в клинической ОПН не было одобрено.

У большинства госпитализированных пациентов ОПН вызывала острый некроз почечных канальцев (ATN), который происходит в результате ишемического и/или нефротоксического повреждений. Почечная гипоперфузия вызывается гиповолемическим, кардиогенным и септическим шоком, введением вазоконстрикторных лекарственных средств или реноваскулярным повреждением. Нефротоксины включают в себя экзогенные токсины, такие как контрастные вещества и аминогликозиды, а также эндогенный токсин, такой как миоглобин. Однако недавние исследования подтверждают, что апоптоз в почечных тканях в большинстве случаев ОПН человека является сильно выраженным. Основным сайтом апоптотической смерти клеток является дистальный нефрон. Во время начальной фазы ишемического повреждения потеря целостности актинового цитоскелета приводит к уплощению эпителия с потерей щеточной каемки, потерей фокальных клеточных контактов и к последующему высвобождению клетки из выстилающего субстрата. Было сделано предположение, что апоптотическая смерть канальцевых клеток может быть более прогностической в отношении функциональных изменений, чем некротическая смерть клеток (Komarov et al. Science, 1999 Sep. 10; 285(5434):1733-7); см. также (Supavekin et al. Kidney Int. 2003 May; 63(5):1714-24).

Таким образом, в настоящее время нет удовлетворительных способов терапии для предупреждения и/или лечения токсической алопеции и острой почечной недостаточности и нет удовлетворительного способа терапии многих других заболеваний и нарушений, которые сопровождаются повышенным уровнем полипептида р53, и, следовательно, существует потребность в развитии новых соединений для этой цели.

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает новые двухцепочечные олигорибонуклеотиды, которые ингибируют ген р53. Данное изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько таких олигорибонуклеотидов, и вектор, способный экспрессировать этот олигорибонуклеотид. Данное изобретение обеспечивает также способ лечения пациента, страдающего от заболевания, в котором временное (обратимое) ингибирование активности р53 является полезным, предусматривающий введение этому пациенту одного или нескольких олигорибонуклеотидов, обычно в виде фармацевтической композиции, в терапевтически эффективной дозе таким образом, чтобы посредством этого лечить этого пациента. Данное изобретение рассматривает также лечение других нарушений, которые сопровождаются повышенным уровнем полипептида р53. Поскольку долгосрочная инактивация р53 может значительно увеличивать риск рака, предпочтительно, чтобы ингибирование р53 с использованием молекул согласно изобретению было временным (транзиторным).

В одном предпочтительном варианте осуществления описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть использованы в лечении опухолей в случаях, когда временная супрессия р53 с использованием siPHK р53 могла бы быть полезной вместе с общепринятой химиотерапией (как описано здесь) или лучевой терапией (радиотерапией). Например, описанные здесь новые молекулы siPHK будут защищать нормальные р53-содержащие клетки от индуцированного химиотерапией или лучевой терапией апоптоза. Описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть также использованы для ингибирования экспрессии р53 в конкретных раковых клетках в случаях, когда ингибирование р53 потенцирует апоптотическую клеточную смерть этих клеток. Конкретно, лучевая терапия и химиотерапия могут вызывать тяжелые побочные действия, такие как тяжелое повреждение лимфоидной и гемопоэтической системы и кишечного эпителия, которые ограничивают эффективность этих терапий, и могут вызывать выпадение волос, которое вызывает психологическое расстройство. Эти побочные действия обусловлены р53-опосредованным апоптозом. Таким образом, для элиминации или уменьшения вредных побочных действий, ассоциированных с лечением рака, была бы полезна индукция временного ингибирования активности р53 в нормальных клетках с использованием молекул siPHK согласно изобретению с защитой посредством этого нормальной ткани.

В другом предпочтительном варианте осуществления описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть использованы в лечении острой почечной недостаточности (ОПН), которая характеризуется быстрым нарушением почечной функции, ассоциированным с апопототической смертью клеток в почечной ткани.

Описанные здесь новые молекулы siPHK могут быть также использованы в других состояниях, в которых р53 активируется как следствие различных стрессов, связанных с повреждениями, такими как ожог, гипертермия (перегревание организма), гипоксия, связанная с блокированным кровоснабжением, таким как в случае инфаркта миокарда, и ишемия. Временное ингибирование р53 с использованием молекул siPHK согласно изобретению может быть терапевтически эффективным в уменьшении или элиминации р53-зависимой смерти нейронов в центральной нервной системе, т.е. при повреждении головного мозга и спинного мозга, консервировании тканей и органов перед трансплантацией, подготовке хозяина для пересадки костного мозга и в уменьшении или элиминации нейронного повреждения во время припадка.

р53 играет также роль в старении клеток. В частности, морфологические и физиологические изменения нормальных тканей, связанные со старением, могут быть связаны с активностью р53. Известно, что старые клетки, которые накапливаются в тканях с течением времени, поддерживают очень высокие уровни р53-зависимой транскрипции. р53-зависимая секреция ингибиторов факторов роста накапливается в стареющей ткани. Таким образом, описанные здесь молекулы siPHK могут быть также использованы в супрессии старения тканей.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. На этой фигуре представлена нуклеотидная последовательность гена р53 человека SEQ ID NO:1.

Фиг.2. На этой фигуре представлена аминокислотная последовательность полипептида р53 человека SEQ ID NO:2.

Фиг.3. На этой фигуре показаны результаты Вестерн-блота, демонстрирующие действие различных siPHK р53 человека на экспрессию р53.

Фиг.4. На этой фигуре показаны результаты Вестерн-блота, демонстрирующие действие различных siPHK р53 мыши на экспрессию р53.

Фиг.5. На этой фигуре показан уровень сывороточного креатинина как показатель острой почечной недостаточности у животных, которые были подвергнуты билатеральному пережиманию почечных артерий и были обработаны соединением siPHK р53 или контролем, как указано.

Фиг.6. На этой фигуре показана степень некроза канальцев в почечной ткани у животных, которые были подвергнуты билатеральному пережиманию почечных артерий и были обработаны соединением siPHK р53.

Фиг.7. Эта фигура демонстрирует, что обработка siPHK р53 вызывает отрицательную регуляцию экспрессии про-апоптотического гена Puma в кортикальном компартменте почки у животного, подвергнутого ишемическому/реперфузионному повреждению почки.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится, в общем, к соединениям, которые вызывают отрицательную регуляцию экспрессии гена р53, конкретно, к новым малым интерферирующим РНК (siPHK) и к применению этих новых siPHK в лечении различных заболеваний и медицинских состояний, в частности алопеции или острой почечной недостаточности или нарушения, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53.

Авторы согласно изобретению обнаружили, что полезно индуцировать временное ингибирование р53 для лечения указанных заболеваний или нарушений. Способы, молекулы и композиции, которые ингибируют р53, обсуждаются здесь подробно, и любые из указанных молекул и/или композиций могут быть с пользой использованы в лечении пациента, страдающего от любого из указанных состояний.

Данное изобретение обеспечивает способы и композиции для ингибирования экспрессии гена р53-мишени in vivo. Обычно этот способ включает в себя введение олигорибонуклеотидов, таких как малые интерферирующие РНК (т.е. siPHK), которые нацелены на конкретную мРНК р53 и гибридизуются или взаимодействуют с этой мРНК в биологических условиях (внутри клетки), или материала нуклеиновой кислоты, который может продуцировать siPHK в клетке, в количестве, достаточном для отрицательной регуляции экспрессии гена-мишени по механизму интерференции РНК. В частности, рассматриваемый способ может быть использован для ингибирования экспрессии гена р53 для лечения заболевания.

Согласно данному изобретению, молекулы siPHK или ингибиторы гена р53 могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения различных патологий, в частности алопеции и острой почечной недостаточности, или других нарушений, сопровождающихся повышенным уровнем полипептида р53. Поскольку долгосрочная инактивация р53 может значительно увеличивать риск рака, предпочтительно, чтобы ингибирование р53 с использованием молекул согласно изобретению было временным/обратимым.

Данное изобретение связано с двухцепочечными олигорибонуклеотидами (siPHK), которые вызывают отрицательную регуляцию экспрессии гена р53. siPHK согласно изобретению является дуплексным олигорибонуклеотидом, в котором смысловая цепь произведена из мРНК-последовательности гена р53, а антисмысловая цепь является комплементарной смысловой цепи. Обычно некоторое отклонение от мРНК-последовательности-мишени допускается без нарушения активности siPHK (см., например, Czauderna et al 2003 Nucleic Acids Research 31(11), 2705-2716). siPHK согласно изобретению ингибирует экспрессию гена на посттранскрипционном уровне, с разрушением или без разрушения мРНК. Не связывая себя теорией, авторы считают, что siPHK может быть нацелена на мРНК для специфического расщепления и деградации и/или может ингибировать трансляцию из мРНК-мишени.

Имеются по меньшей мере четыре варианта полипептидов р53 (см. Bourdon et al. Genes Dev., 2005; 19:2122-2137). Последовательность, приведенная на фиг.1, является нуклеотидной последовательностью gi-8400737. Соответствующая полипептидная последовательность имеет 393 аминокислоты; см. фиг.2. Все варианты и любые другие подобные минорные варианты включены в определение полипептида р53 и в определение генов р53, кодирующих их.

В данном контексте термин «ген р53» определяется как любой гомолог гена р53, имеющий предпочтительно 90% гомологию, более предпочтительно, 95% гомологию и даже более предпочтительно, 98% гомологию с кодирующим аминокислоты районом SEQ ID NO:1 или последовательностями нуклеиновых кислот, которые связываются с геном р53 в условиях гибридизации высокой жесткости, которые хорошо известны в данной области (например, см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), обновленные в 1995 и 1998 годах.

В данном контексте термин «р53» или «полипептид р53» определяется как любой гомолог полипептида р53, имеющий предпочтительно 90% гомологию, более предпочтительно, 95% гомологию и даже более предпочтительно, 98% гомологию с SEQ ID NO:2, в виде полноразмерной последовательности или ее фрагмента или домена, в виде мутанта или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты сплайсингового варианта, в виде химеры с другими полипептидами, при условии, что любая последовательность из вышеуказанных последовательностей имеет ту же самую или по существу ту же самую биологическую функцию, что и полипептид р53.

Обычно siPHK, используемые в данном изобретении, содержат рибонуклеиновую кислоту, содержащую двухцепочечную структуру, причем эта двухцепочечная структура содержит первую цепь и вторую цепь, причем первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, и причем указанный первый сегмент является по меньшей мере частично комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени, а второй сегмент является по меньшей мере частично идентичным нуклеиновой кислоте-мишени, причем указанная первая цепь и/или указанная вторая цепь содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию в положении 2', причем в этой цепи каждая группа модифицированных нуклеотидов фланкирована на одной или на обеих сторонах фланкирующей группой нуклеотидов, причем эти фланкирующие нуклеотиды, образующие фланкирующую группу нуклеотидов, являются либо немодифицированными нуклеотидами, либо нуклеотидами, имеющими модификацию, отличающуюся от модификации вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов. Кроме того, указанная первая цепь и/или указанная вторая цепь может содержать указанное множество модифицированных нуклеотидов и может содержать указанное множество групп модифицированных нуклеотидов.

Группа модифицированных нуклеотидов и/или группа фланкирующих нуклеотидов может содержать некоторое количество нуклеотидов, причем это количество нуклеотидов выбрано из группы, состоящей из 1-10 нуклеотидов. В связи с любыми указанными здесь диапазонами должно быть понятно, что каждый диапазон включает в себя любое отдельное целое число между соответствующими числами, используемыми для определения диапазона, в том числе указанные два числа, ограничивающие указанный диапазон. Таким образом, в данном случае эта группа содержит один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида, четыре нуклеотида, пять нуклеотидов, шесть нуклеотидов, семь нуклеотидов, восемь нуклеотидов, девять нуклеотидов и десять нуклеотидов.

Распределение модифицированных нуклеотидов указанной первой цепи может быть смещено на один или несколько нуклеотидов относительно распределения модифицированных нуклеотидов второй цепи.

Обсуждаемые выше модификации могут быть выбраны из группы, состоящей из амино, фтора, метокси, алкокси, алкила, амино, фтора, хлора, брома, CN, CF, имидазола, карбоксилата, тиоата, низшего С₁-С₁₀ алкила, замещенного низшего алкила, алкарила, или аралкила, OCF₃, OCN, O-, S- или N-алкила; O-, S- или N-алкенила; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂, N₃; гетероциклоалкила; гетероциклоалкарила; аминоалкиламино; полиалкиламино или замещенного силила, как, среди прочих, описано в Европейских патентах ЕРО 586520 В1 или ЕРО 618925 В1.

Двухцепочечная структура siPHK может быть затуплена на одной стороне или на обеих сторонах. Более конкретно, эта двухцепочечная структура может быть затуплена на стороне двухцепочечной структуры, которая ограничена 5'-концом первой цепи и 3'-концом второй цепи, или эта двухцепочечная структура может быть затуплена на стороне двухцепочечной структуры, которая ограничена 3'-концом первой цепи и 5'-концом второй цепи.

Кроме того, по меньшей мере одна из этих двух цепей может иметь выступ по меньшей мере одного нуклеотида на 5'-конце; этот выступ может состоять из по меньшей мере одного дезоксирибонуклеотида. По меньшей мере одна из этих цепей может также необязательно иметь выступ из по меньшей мере одного нуклеотида на 3'-конце.

Длина двухцепочечной структуры этой siPHK обычно равна приблизительно 17-21, и более предпочтительно, 18-19 оснований. Кроме того, длина указанной первой цепи и/или длина указанной второй цепи может независимо друг от друга быть выбрана из группы, содержащей диапазоны приблизительно в 15 оснований - приблизительно в 23 основания, в 17 оснований - 21 основание и в 18 или 19 оснований.

Кроме того, комплементарность между указанной первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью может быть абсолютной, или дуплекс, образованный между первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью, может содержать по меньшей мере 15 нуклеотидов, где имеется одно ошибочное спаривание или два ошибочных спаривания между указанной первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью, образующими указанную двухцепочечную структуру.

В некоторых случаях как первая цепь, так и вторая цепь, каждая, содержат по меньшей мере одну группу модифицированных нуклеотидов и по меньшей мере одну фланкирующую группу нуклеотидов, причем каждая группа модифицированных нуклеотидов содержит по меньшей мере один нуклеотид и каждая фланкирующая группа нуклеотидов содержит по меньшей мере один нуклеотид, причем каждая группа модифицированных нуклеотидов первой цепи сопоставляется с фланкирующей группой нуклеотидов на второй цепи, причем наиболее концевой 5'-нуклеотид первой цепи является нуклеотидом группы модифицированных нуклеотидов, а наиболее 3'-концевой нуклеотид второй цепи является нуклеотидом фланкирующей группы нуклеотидов. Каждая группа модифицированных нуклеотидов может состоять из единственного нуклеотида и/или каждая фланкирующая группа нуклеотидов может состоять из единственного нуклеотида.

Кроме того, может быть так, что на первой цепи нуклеотид, образующий фланкирующую группу нуклеотидов, является немодифицированным нуклеотидом, который расположен в 3'-направлении относительно нуклеотида, образующего группу модифицированных нуклеотидов, а на второй цепи нуклеотид, образующий группу модифицированных нуклеотидов, является модифицированным нуклеотидом, который расположен в 5'-направлении относительно нуклеотида, образующего фланкирующую группу нуклеотидов.

Кроме того, первая цепь siPHK может содержать восемь-двенадцать, предпочтительно девять-одиннадцать, групп модифицированных нуклеотидов, а вторая цепь может содержать семь-одиннадцать, предпочтительно восемь-десять, групп модифицированных нуклеотидов.

Первая цепь и вторая цепь могут быть связаны структурой петли, которая может состоять из полимера, не являющегося нуклеиновой кислотой, такого как, помимо прочего, полиэтиленгликоль. Альтернативно, эта структура петли может состоять из нуклеиновой кислоты.

Кроме того, 5'-конец первой цепи siPHK может быть связан с 3'-концом второй цепи или 3'-конец первой цепи может быть связан с 5'-концом второй цепи, причем указанная связь осуществляется через представляющий собой нуклеиновую кислоту линкер, обычно имеющий длину 10-2000 нуклеооснований.

В частности, данное изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру А:

5'(N)_x - Z 3' (антисмысловая цепь)

3'Z' -(N')_y 5' (смысловая цепь)

где каждый N и N' означает рибонуклеотид, который может быть модифицированным или немодифицированным по его сахарному остатку, а (N)_x и (N')_y означает олигомер, в котором каждый последовательный N или N' соединен с последующим N или N' ковалентной связью;

где каждый из x и y означает целое число 19-40;

где каждый из Z и Z' может присутствовать или отсутствовать, но, если присутствует, означает dTdT и является ковалентно присоединенным на 3'-конце цепи, в которой он присутствует; и

где последовательность (N)_x содержит антисмысловую последовательность относительно мРНК р53, в частности, любой из антисмысловых последовательностей, представленных в любой из таблиц А, В и С.

Специалистам с квалификацией в данной области будет легко понятно, что соединения согласно изобретению состоят из множества нуклеотидов, которые связаны ковалентными связями. Каждая такая ковалентная связь может быть фосфодиэфирной связью, фосфотиоатной связью или комбинацией из обеих, вдоль длины нуклеотидной последовательности отдельной цепи. Другие возможные модификации скелета описаны, помимо прочего, в патентах США с номерами 5587361; 6242589; 6277967; 6326358; 5399676; 5489677 и 5596086.

В конкретных вариантах осуществления х и y равны предпочтительно целому числу приблизительно 19 - приблизительно 27, наиболее предпочтительно, приблизительно 19 - приблизительно 23. В конкретном варианте осуществления соединения согласно изобретению х может быть равен y (т.е. х=y) и в предпочтительных вариантах осуществления х=y=19 или х=y=21. В особенно предпочтительном варианте осуществления х=y=19.

В одном из воплощений соединения согласно изобретению и Z, и Z' отсутствуют; в другом варианте один из Z или Z' присутствует.

В одном из воплощений соединения согласно изобретению все рибонуклеотиды согласно соединению являются немодифицированными по их сахарным остаткам.

В предпочтительных вариантах воплощения соединения согласно изобретению по меньшей мере один рибонуклеотид модифицирован по его сахарному остатку, предпочтительно в положении 2'. Эта модификация в положении 2' приводит к присутствию группы, которая предпочтительно выбрана из группы, состоящей из амино, фтора, метокси, алкокси и алкильной групп. В наиболее предпочтительном в настоящее время варианте осуществления эта группа в положении 2' является метокси (2'-О-метилом).

В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения антисимметричные рибонуклеотиды модифицированы как в антисмысловой, так и в смысловой цепях согласно соединению. В частности, siPHK, используемая в примерах, была модифицирована таким образом, что 2'-О-Ме-группа присутствовала на первом, третьем, пятом, седьмом, девятом, одиннадцатом, тринадцатом, пятнадцатом, семнадцатом и девятнадцатом нуклеотиде антисмысловой цепи, причем та же самая модификация, т.е. 2'-О-Ме-группа, присутствовала на втором, четвертом, шестом, восьмом, десятом, двенадцатом, четырнадцатом, шестнадцатом и восемнадцатом нуклеотиде смысловой цепи. Кроме того, следует отметить, что в случае конкретных нуклеиновых кислот согласно изобретению первый сегмент является идентичным первой цепи, а второй сегмент является идентичным второй цепи, и эти нуклеиновые кислоты также являются затупленными.

В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность siPHK является последовательностью 15 в таблице А.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления согласно изобретению, обе антисмысловая и смысловая цепи молекулы siPHK являются фосфорилированными только на 3'-конце, но не на 5'-конце. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления согласно изобретению, обе - антисмысловая и смысловая - цепи являются нефосфорилированными на 3'-конце, а также на 5'-конце. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, 1-ый нуклеотид в положении 5' является специфически модифицированным во избежание любой возможности 5'-фосфорилирования in vivo.

В другом варианте воплощения соединения согласно изобретению, рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах антисмысловой цепи являются модифицированными по их сахарным остаткам, а рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах смысловой цепи являются немодифицированными по их сахарным остаткам.

Кроме того, изобретение связано с вектором, способным экспрессировать любой из вышеуказанных олигорибонуклеотидов в немодифицированной форме в клетке, после чего может быть произведена подходящая модификация.

Изобретение связано также с композицией, содержащей одно или несколько соединений согласно изобретению в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе. Эта композиция может содержать смесь двух или более различных siPHK.

Настоящее изобретение связано также с композицией, которая содержит вышеуказанное соединение согласно изобретению, ковалентно или нековалентно связанное с одним или несколькими соединениями согласно изобретению, в количестве, эффективном для ингибирования р53 человека, и носитель. Эта композиция может внутриклеточно подвергаться процессингу под действием эндогенных клеточных комплексов, с образованием одного или нескольких олигорибонуклеотидов согласно изобретению.

Настоящее изобретение связано также с композицией, содержащей носитель и одно или несколько соединений согласно изобретению в количестве, эффективном для отрицательной регуляции экспрессии в клетке р53 человека, причем это соединение содержит последовательность, по существу комплементарную последовательности (N)_x.

Кроме того, данное изобретение связано со способом отрицательной регуляции экспрессии гена р53 по меньшей мере на 50% в сравнении с контролем, предусматривающим контактирование мРНК-транскрипта гена р53 с одним или несколькими соединениями согласно изобретению.

В одном варианте осуществления указанный олигорибонуклеотид отрицательно регулирует р53, причем такая отрицательная регуляция выбрана из группы, состоящей из отрицательной регуляции функции р53, отрицательной регуляции полипептида р53 и отрицательной регуляции экспрессии мРНК р53.

В одном варианте осуществления соединение вызывает отрицательную регуляцию полипептида р53, причем эта отрицательная регуляция р53 выбрана из группы, состоящей из отрицательной регуляции функции р53 (которая может быть испытана ферментативным анализом или, помимо прочего, анализом связывания с известным взаимодействующим агентом нативного гена/полипептида, отрицательной регуляции белка р53 (которая может, помимо прочего, быть испытана методом Вестерн-блоттинга, ELISA или иммунопреципитации) и отрицательной регуляции экспрессии мРНК р53 (которая может быть, помимо прочего, испытана методом Нозерн-блоттинга, количественной ОТ-ПЦР, гибридизации in situ или гибридизации микромассива (биочипа)).

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения пациента, страдающего от заболевания, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53, предусматривающий введение пациенту композиции согласно изобретению в терапевтически эффективной для лечения дозе. Предпочтительно, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего от заболевания, при котором полезно временное ингибирование р53. В одном предпочтительном варианте осуществления, композиции согласно изобретению используют для лечения опухолей вместе с общепринятой химиотерапией или лучевой терапией для предупреждения алопеции, связанной с химиотерапией или лучевой терапией. В другом предпочтительном варианте осуществления, композиции согласно изобретению используют для лечения острой почечной недостаточности. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления, композиции согласно изобретению используют в состояниях, при которых р53 активируется как следствие различных стрессов, ассоциированных с повреждениями, такими как ожог, гипертермия (перегревание организма), гипоксия, ассоциированная с блокированным кровоснабжением, например, при инфаркте миокарда, инсульте и ишемии. Временное (обратимое) ингибирование р53 с использованием молекул siPHK согласно изобретению может быть терапевтически эффективным в уменьшении или элиминации р53-зависимой смерти нейронов в центральной нервной системе, т.е. в повреждении головного мозга и спинного мозга, в консервировании ткани и органа перед трансплантацией, подготовке хозяина для пересадки костного мозга, уменьшении или элиминации нейронного повреждения во время припадка и в супрессии старения тканей.

Данное изобретение обеспечивает также применение терапевтически эффективной дозы одного или нескольких соединений согласно изобретению для приготовления композиции для лечения заболевания, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53, например, у пациента, страдающего от алопеции или острой почечной недостаточности.

Более конкретно, данное изобретение связано с олигорибонуклеотидом, в котором одна цепь содержит смежные нуклеотиды, имеющие, от 5' к 3', последовательность, представленную в SEQ ID NO:3-25 (таблица А, смысловые цепи), или в SEQ ID NO:49-119 (таблица В, смысловые цепи), или в SEQ ID NO:191-253 (таблица С, смысловые цепи), или его гомолог, в котором изменено основание в 1-2 из нуклеотидов в каждом концевом районе.

Концевым районом этого олигонуклеотида называют основания 1-4 и/или 16-19 в 19-мерной последовательности и основания 1-4 и/или 18-21 в 21-мерной последовательности.

Кроме того, изобретение связано с олигорибонуклеотидами, в которых одна цепь содержит последовательные нуклеотиды, имеющие, от 5' к 3', последовательность, представленную в SEQ ID NO:26-48 (таблица А, антисмысловые цепи), или SEQ ID NO:120-190 (таблица В, антисмысловые цепи) или SEQ ID NO:254-316 (Таблица С, антисмысловые цепи), или их гомолог, в котором изменено основание в 1-2 из нуклеотидов в каждом концевом районе.

Предпочтительными олигонуклеотидами согласно изобретению являются олигонуклеотиды р53 человека с порядковыми номерами 3, 5, 20 и 23 в таблице D и олигонуклеотиды р53 мыши с порядковыми номерами 11, 12, 14, 17 и 18 в таблице Е. Они идентичны порядковым номерам 3, 5, 20 и 23 (человек), а также 11, 12, 14, 17 и 18 (мышь) в таблице А. Наиболее предпочтительными олигонуклеотидами согласно изобретению являются олигонуклеотиды р53 человека, имеющие последовательность порядкового номера 23 в таблице А.

Наиболее предпочтительным соединением согласно изобретению в настоящее время является затупленный на концах 19-мерный олигонуклеотид, т.е. х=y=19 и Z, и Z' оба отсутствуют. Эта олигонуклеотидная молекула является либо фосфорилированной на 3'-концах как смысловой, так и антисмысловой цепи, либо вообще нефосфорилированной; или имеет 1-ый нуклеотид в положении 5' на смысловой цепи, специфически модифицированный во избежание любой возможности 5'-фосфорилирования in vivo. Антисимметричные рибонуклеотиды модифицированы в положении 2' как в антисмысловой, так и в смысловой цепях, причем группой в положении 2' является метокси (2'-О-метил), и причем рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах антисмысловой цепи являются модифицированными по их сахарным остаткам, а рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах смысловой цепи являются немодифицированными по их сахарным остаткам. Наиболее предпочтительными в настоящее время подобными соединениями являются такие модифицированные олигонуклеотиды, содержащие последовательности, имеющие порядковый номер 23 в таблице А.

В одном аспекте изобретения олигонуклеотид содержит двухцепочечную структуру, причем такая двухцепочечная структура содержит

первую цепь и вторую цепь, причем

первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, а вторая цепь содержит второй сегмент смежных нуклеотидов, причем

указанный первый сегмент является либо комплементарным, либо идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей р53, а второй сегмент является либо идентичным, либо комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей р53.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит приблизительно 14-40 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 18-30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 19-27 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида, в частности приблизительно 19 нуклеотидов - 21 нуклеотид. В таком варианте осуществления этот олигонуклеотид может иметь длину 17-40 нуклеотидов.

Кроме того, дополнительные нуклеиновые кислоты согласно изобретению содержат по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов любого из полинуклеотидов в этих таблицах и, более предпочтительно, 14 смежных пар нуклеотидных оснований на любом конце двухцепочечной структуры, состоящей из первого сегмента и второго сегмента, как описано выше.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит последовательность по меньшей мере из 14 смежных нуклеотидов олигонуклеотида, причем такой олигонуклеотид выбран из группы, содержащей SEQ ID NO:3-316, предпочтительно из группы, содержащей олигорибонуклеотиды, имеющие последовательность любого из порядковых номеров 3, 5, 20 или 23 (человек) или имеющие последовательность любого из порядковых номеров 11, 12, 14, 17 и 18 (мышь) в таблице А, более предпочтительно выбран из группы, имеющей последовательность любого из порядковых номеров 3, 5, 20 или 23 в таблице А.

Кроме того, дополнительные нуклеиновые кислоты согласно изобретению содержат по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов любой из SEQ ID NO:3-316 и, более предпочтительно, 14 смежных пар нуклеотидных оснований на любом конце двухцепочечной структуры, состоящей из первого сегмента и второго сегмента, как описано выше. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что при такой потенциальной длине нуклеиновой кислоты согласно изобретению и, в частности, отдельных сегментов, образующих такую нуклеиновую кислоту согласно изобретению, возможны некоторые смещения относительно кодирующей последовательности р53 в каждую сторону, причем такие смещения могут быть смещениями на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 нуклеотидов в обоих направлениях, причем генерированные таким образом молекулы двухцепочечной кислоты будут также входить в объем согласно изобретению.

Доставка: Были разработаны системы доставки, нацеленные специфически на усиленную и улучшенную доставку siPHK в клетки млекопитающих, см., например, Shen et al. (FEBS letters 539: 111-114 (2003)), Xia et al., Nature Biotechnology 20: 1006-1010 (2002), Reich et al., Molecular Vision 9: 210-216 (2003), Sorensen et al. (J. Mol. Biol. 327: 761-766 (2003), Lewis et al., Nature Genetics 32: 107-108 (2002) и Simeoni et al., Nucleic Acids Research 31, 11: 2717-2724 (2003). siPHK была недавно использована для ингибирования в организме приматов; подробнее см. Tolentino et al., Retina 24(1) February 2004 I 132-138. Респираторные препараты siPHK описаны в заявке на патент США №2004/0063654 Davis et al. Конъюгированные с холестерином siPHK (и конъюгированные с другими стероидами и липидами siPHK) могут быть использованы для доставки, см. Soutschek et al Nature 432: 173-177(2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs; и Lorenz et al. Bioorg. Med. Chemistry. Lett. 14:4975-4977 (2004) Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells.

siPHK или фармацевтические композиции согласно изобретению вводят и предоставляют в дозах в соответствии с медицинской практикой, с учетом клинического состояния индивидуального пациента, подлежащего лечению заболевания, места и способа введения, схемы введения, возраста, пола, массы тела пациента и других факторов, известных врачам-практикам.

Таким образом, «терапевтически эффективную дозу» для указанных здесь целей определяют с учетом обстоятельств, которые известны в данной области. Эта доза должна быть эффективна для получения улучшения, в том числе, но не только, улучшенного коэффициента выживаемости, или более быстрого выздоровления, или улучшения или элиминации симптомов и других показателей, которые выбираются в качестве подходящих критериев специалистами с квалификацией в данной области. Соединения согласно изобретению могут вводиться любым из общепринятых способов введения. Следует отметить, что соединение может быть введено в виде соединения или в виде фармацевтически приемлемой соли и может быть введено отдельно или в виде активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями, растворителями, разбавителями, эксципиентами, адъювантами и наполнителями. Соединения могут вводиться перорально, подкожно или парентерально, в том числе внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрибрюшинным и интраназальным введением, а также внутриоболочечным и инфузионным способами. Применимы также имплантаты этих соединений. Жидкие формы могут быть приготовлены для инъекции, причем этот термин включает в себя подкожный, чрескожный, внутривенный, внутримышечный, внутриоболочечный и другие парентеральные способы введения. Жидкие композиции включают в себя водные растворы, с органическими сорастворителями или без органических сорастворителей, водные и масляные суспензии, эмульсии с годными в пищу маслами, а также подобными фармацевтическими наполнителями. Кроме того, в определенных обстоятельствах композиции для применения в новых способах терапии согласно изобретению могут быть приготовлены в виде аэрозолей для интраназального и подобного введения. Подлежащим лечению пациентом является теплокровное животное, в частности млекопитающие, в том числе человек. Фармацевтически приемлемыми носителями, растворителями, разбавителями, эксципиентами, адъювантами и наполнителями, а также носителями имплантатов обычно называют инертные, нетоксичные твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующий материал, не реагирующие с активными ингредиентами согласно изобретению, и они включают в себя липосомы и микросферы. Примеры систем доставки, применимых в данном изобретении, включают в себя системы доставки, описанные в патентах США с номерами 5225182; 5169383; 5167616; 4959217; 4925678; 4487603; 4486194; 4447233; 4447224; 4439196 и 4475196. Многие другие подобные имплантаты, системы доставки и модули хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области. В одном конкретном варианте осуществления согласно изобретению особенно предпочтительными являются готовые формы для местной и трансдермальной доставки.

Обычно активная доза соединения для человека находится в диапазоне от 1 нг/кг приблизительно до 20-100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно приблизительно от 0,01 мг приблизительно до 2-10 мг/кг массы тела в день, по схеме одна доза в день, или два раза, или три раза, или более раз в день в течение периода 1-4 недель или более.

Отмечается, что доставка соединений siPHK в соответствии с данным изобретением в клетки-мишени в проксимальных почечных канальцах является особенно эффективной в лечении острой почечной недостаточности. Без ограничения теорией, это может быть обусловлено тем фактом, что обычно молекулы siPHK экскретируются из организма через клетки проксимальных почечных канальцев. Таким образом, голые молекулы siPHK природно концентрируются в этих клетках, которые являются мишенями для терапии при острой почечной недостаточности.

Термин «лечение» относится в данном контексте к введению терапевтического вещества, эффективного в ослаблении симптомов, ассоциированных с заболеванием, для ослабления тяжести или лечения этого заболевания или для предотвращения возникновения этого заболевания.

В конкретном варианте осуществления введение предусматривает внутривенное введение. В другом конкретном варианте осуществления введение предусматривает местное или локальное введение.

Другим аспектом изобретения является способ лечения пациента, страдающего от алопеции или острой почечной недостаточности или нарушения, сопровождающегося повышенным уровнем полипептида р53, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции согласно изобретению в терапевтически эффективном для лечения количестве.

В предпочтительном варианте осуществления для лечения алопеции введение предусматривает местное или локальное введение. В другом предпочтительном варианте осуществления введение предусматривает трансдермальное введение. В конкретном варианте осуществления фармацевтическую композицию наносят на волосистую часть кожи головы пациента. В предпочтительном варианте осуществления для лечения ОПН введение предусматривает внутривенное, внутриартериальное или внутрибрюшинное введение.

Другим аспектом изобретения является способ предупреждения алопеции у пациента, подвергающегося лечению, которое вызывает алопецию, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции согласно изобретению в терапевтически эффективном для лечения пациента количестве.

В другом аспекте согласно изобретению обеспечена фармацевтическая композиция, которая содержит любой из вышеописанных олигорибонуклеотидов (SEQ ID NO:3-316) или векторов и фармацевтически приемлемый носитель. Другим аспектом изобретения является применение терапевтически эффективного количества любого из вышеописанных олигорибонуклеотидов (SEQ ID NO:3-316) или векторов для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего от алопеции или острой почечной недостаточности или нарушения, которое сопровождается повышенным уровнем р53.

В предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство включает в себя местное лекарственное средство. В конкретном варианте осуществления лекарственное средство наносят на волосистую часть кожи головы пациента. В другом предпочтительном варианте осуществления лекарственное средство включает в себя средство для трансдермального введения.

Во всех вышеописанных аспектах согласно изобретению алопеция может быть индуцирована химиотерапией или лучевой терапией и называется далее «токсической алопецией». Более подробно, токсическая алопеция может быть вызвана облучением, например гамма-излучением, или химиотерапевтическими агентами, такими как этопозид, 5-ФУ (5-фторурацил), цисплатин, доксорубицин, винкаалкалоид, винкристин, винбластин, винорелбин, таксол, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, меклоретамин, митомицин, дакарбазин, карбоплатинум, тиотепа, даунорубицин, идарубицин, митоксантрон, блеомицин, эсперамицин А1, дактиномицин, пликамицин, кармустин, ломустин, тауромустин, стрептозоцин, мелфалан, дактиномицин, прокарбазин, дексаметазон, преднизон, 2-хлордезоксиаденозин, цитарабин, доцетаксел, флударабин, гемцитабин, херцептин, гидроксимочевина, иринотекан, метотрексат, оксалиплатин, ритуксин, семустин, эпирубицин, этопозид, томудекс и топотекан или химический аналог одного из этих химиотерапевтических агентов. Химиотерапевтическими агентами, с наибольшей вероятностью вызывающими выпадение волос, являются: цисплатин, цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, ифосфамид и винкристин.

Соединения согласно изобретению предпочтительно используют для лечения острой почечной недостаточности, в частности острой почечной недостаточности, вызываемой ишемией у пациентов после хирургии, и острой почечной недостаточности, вызываемой химиотерапевтическим лечением, таким как введение цисплатина, или ассоциированной с сепсисом острой почечной недостаточности. Предпочтительным применением соединений согласно изобретению является применение для предотвращения острой почечной недостаточности у пациентов, имеющих высокую степень риска, подвергающихся обширной операции на сердце или васкулярной хирургии. Пациенты при высоком риске развития острой почечной недостаточности могут быть идентифицированы с использованием различных способов балльной оценки, таких как Clevland Clinic algorithm или способ, разработанный US Academic Hospitals (QMMI), и способ, разработанный Veterans' Administration (CICSS). Другими предпочтительными применениями соединений согласно изобретению являются применения для предупреждения ишемической острой почечной недостаточности у пациентов с трансплантацией почки или для предотвращения токсичной почечной недостаточности у пациентов, получающих химиотерапию. Другими применениями являются применения для заживления ран, при острой печеночной недостаточности, индуцированной цисплатином глухоты (возможно, местным нанесением), размножения in vivo гемопоэтических стволовых клеток, консервирования донорских органов/тканей перед трансплантацией замачиванием в растворе siPHK (возможно, посредством электропорации) и последующего улучшения выживания трансплантированной ткани после трансплантации. Другими показаниями могут быть инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, индуцированная доксорубицином кардиотоксичность, инфаркт миокарда/сердечная недостаточность и улучшение выживаемости ткани трансплантата после трансплантации (системным введением). Без связи с определенной теорией, все эти нарушения сопровождаются повышенным уровнем полипептида р53.

Данное изобретение обеспечивает также способ приготовления фармацевтической композиции, который предусматривает

получение одного или нескольких двухцепочечных соединений согласно изобретению; и

смешивание указанного соединения с фармацевтически приемлемым носителем.

Данное изобретение обеспечивает также способ приготовления фармацевтической композиции, который предусматривает смешивание одного или нескольких соединений согласно изобретению с фармацевтически приемлемым носителем.

В предпочтительном варианте осуществления соединение, используемое в приготовлении фармацевтической композиции, смешивают с носителем в фармацевтически эффективной дозе. В конкретном варианте осуществления соединение согласно изобретению конъюгирует со стерином, или с липидом, или другой подходящей молекулой, например с холестерином.

Модификации или аналоги нуклеотидов могут быть введены для улучшения терапевтических свойств этих нуклеотидов. Улучшенные свойства включают в себя увеличенную устойчивость к нуклеазам и/или увеличенную способность проникать через клеточные мембраны.

Таким образом, данное изобретение включает в себя также все аналоги или модификации олигонуклеотида согласно изобретению, которые по существу не изменяют функцию этого полинуклеотида или олигонуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления такая модификация относится к группе основания нуклеотида, к сахарной части нуклеотида и/или фосфатной части нуклеотида.

В вариантах осуществления согласно изобретению эти нуклеотиды могут быть выбраны из природно встречающихся или синтетически модифицированных оснований. Природно встречающиеся основания включают в себя аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил. Модифицированные основания этих олигонуклеотидов включают в себя инозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиоалкиладенин, 8-гидроксиладенин, и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8-аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанин, 8-гидроксилгуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин.

Кроме того, могут быть получены аналоги полинуклеотидов, в которых структуры нуклеотидов фундаментально изменены и которые более подходят в качестве терапевтических или экспериментальных реагентов. Примером аналога нуклеотида является пептиднуклеиновая кислота (ПНК), в которой дезоксирибоза- (или рибоза)фосфатный скелет в ДНК (или РНК) заменен полиамидным скелетом, который сходен со скелетом, обнаруживаемым в пептидах. Было показано, что ПНК-аналоги устойчивы к деградации ферментами и имеют пролонгированные периоды существования in vivo и in vitro. Кроме того, было показано, что ПНК сильнее связываются с комплементарной последовательностью ДНК, чем с молекулой ДНК. Это наблюдение связывают с отсутствием отталкивания зарядов между цепью ПНК и цепью ДНК. Другие модификации, которые могут быть произведены в отношении олигонуклеотидов, включают в себя полимерные скелеты, циклические скелеты или ациклические скелеты молекул.

В одном варианте осуществления модификацией является модификация фосфатной части, причем эта модифицированная фосфатная часть выбрана из группы, содержащей фосфотиоат.

Соединения согласно изобретению могут быть синтезированы любым из способов, которые хорошо известны в данной области для синтеза рибонуклеиновых (или дезоксирибонуклеиновых) олигонуклеотидов. Такой синтез описан, помимо прочего, в Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1992; 48: 2223-2311, Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 и Caruthers M.H. et al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313, синтез тиоатов, помимо прочего, описан в Eckstein F., Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402, синтез молекул РНК описан в Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31 и соответствующие процессы далее по ходу описаны, помимо прочего, у Pingoud A. et al., in IRL Press 1989 Edited by Oliver R.W.A.; Kap. 7: 183-208 и Sproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31 (выше).

В данной области известны и другие синтетические процедуры, например процедуры, описанные у Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids res., 18, 5433; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; и Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59, и в этих процессах могут быть использованы обычные защитные и связывающие группы нуклеиновых кислот, такие как диметокситритил, на 5'-конце. В случае необходимости включают модифицированные (например, 2'-О-метилированные) нуклеотиды и немодифицированные нуклеотиды.

Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы по отдельности и соединены вместе после синтеза, например, путем лигирования (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., International PCT publication No. WO93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204) или гибридизации после синтеза и/или удаления защитных групп.

Отмечается, что может быть использован коммерчески доступный прибор (доступный, помимо прочего, из Applied Biosystems); олигонуклеотиды получают в соответствии с описанными здесь последовательностями. Перекрывающиеся пары химически синтезированных фрагментов могут быть лигированы с использованием способов, хорошо известных в данной области (например, см. Патент США №6121426). Цепи синтезируют по отдельности и затем отжигают друг с другом в пробирке. Затем двухцепочечные siPHK отделяют от одноцепочечных олигонуклеотидов, которые не отожглись (например, вследствие избытка одного из них), при помощи ВЖХ. Что касается siPHK или фрагментов siPHK согласно изобретению, две или более таких последовательностей могут быть синтезированы и связаны вместе для применения в данном изобретении.

Соединения согласно изобретению могут быть также синтезированы с использованием методологии тандемного синтеза, описанного в публикации заявки на патент США с номером US 2004/0019001 (McSwiggen), где обе цепи синтезируют в виде единого смежного олигонуклеотидного фрагмента или единой цепи, разделяемой расщепляемым линкером, который затем расщепляют, с получением отдельных фрагментов siPHK или цепей, которые гибридизуются и дают возможность очистки этого siPHK-дуплекса. Этим линкером может быть полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую две или более молекул siPHK, для лечения любого из заболеваний и состояний, упомянутых здесь, причем указанные две молекулы могут быть физически смешаны вместе в фармацевтической композиции в количествах, которые генерируют равную или иным образом выгодную активность, или могут быть ковалентно или нековалентно связаны или соединены вместе представляющим собой нуклеиновую кислоту линкером с длиной в диапазоне 2-100, предпочтительно 2-50 или 2-30 нуклеотидов. В одном варианте осуществления эти молекулы siPHK состоят из двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, описанной здесь, где две последовательности siPHK выбраны из таблиц А-С, предпочтительно из таблицы А, SEQ ID NO:3, 5, 20 и 23 (последовательности человека) и 11, 12, 14, 17 и 18 (последовательности мыши).

В другом варианте осуществления молекулы siPHK состоят из двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, где первая последовательность siPHK выбрана из таблиц А-С, предпочтительно из таблицы А, SEQ ID NO:3, 5, 20 и 23 (последовательности р53 человека) или 11, 12, 14, 17 и 18 (последовательности р53 мыши), а вторая молекула siPHK нацелена на про-апоптотический ген, обеспечивая посредством этого полезную активность. Тандемная двухцепочечная структура, которая содержит две или более последовательностей siPHK, подвергается внутриклеточному процессингу, с образованием двух или более различных siPHK. Такой второй молекулой siPHK является предпочтительно молекула siPHK, которая нацелена на про-апоптотический ген.

Молекулы siPHK связаны ковалентно или нековалентно или соединены линкером с образованием тандемной молекулы siPHK. Такие тандемные молекулы siPHK, содержащие две последовательности siPHK, имеют обычно длину 38-150 нуклеотидов, более предпочтительно, 38 или 40-60 нуклеотидов или являются более длинными соответственно, если в эту тандемную молекулу включены более чем две последовательности siPHK. Ожидается также более длинная тандемная молекула, состоящая из двух или более длинных последовательностей, которые кодируют siPHK, продуцированную через внутренний клеточный процессинг, например длинные дцРНК, а также тандемная молекула, кодирующая две или более shPHK. Такие тандемные молекулы также рассматриваются как часть согласно изобретению.

Молекулы siPHK, которые нацелены на р53, могут быть основным активным компонентом в фармацевтической композиции или могут быть одним активным компонентом фармацевтической композиции, содержащей две или более siPHK (или молекул, которые кодируют или эндогенно продуцируют две или более siPHK, независимо от того, являются ли они смесью молекул или одной или более тандемными молекулами, которые кодируют две или более siPHK), причем указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит одну или несколько дополнительных молекул siPHK, которые нацелены на один или несколько дополнительных генов. Одновременное ингибирование р53 и указанных дополнительных генов будет, возможно, иметь аддитивное или синергическое действие в отношении лечения описанных здесь заболеваний.

В конкретном примере фармацевтическая композиция для лечения описанных здесь заболеваний может состоять из следующих комбинаций соединений: 1) siPHK р53 и siPHK Fas; 2) siPHK р53 и siPHK Вах; 3) siPHK р53 и siPHK Noxa; 4) siPHK р53 и siPHK Puma; 5) siPHK р53 и siPHK RTP801; 6) siPHK р53 и siPHK PIDD; 7) siPHK р53, siPHK Fas и любая из siPHK RTP801L, siPHK Вах, siPHK Noxa или siPHK Puma или siPHK PIDD для образования тримеров или полимеров (т.е. тандемных молекул, которые кодируют три siPHK). Другими предпочтительными возможностями про-апоптотических генов для комбинации с siPHK р53 являются гены TNFα, каспазы 2, каспазы 3, каспазы 9, E2F1 и PARP-1. Предпочтительной комбинацией в соответствии с данным изобретением является siPHK р53 и siPHK RTP801 (см. РСТ Заявку на патент РСТ/ЕР 2005/008891).

Кроме того, siPHK р53 или любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая или кодирующая siPHK р53, может быть связана (ковалентно или нековалентно) с антителами против интернализуемых молекул клеточной поверхности, экспрессируемых на клетках-мишенях, для достижения усиленного нацеливания для лечения описанных здесь заболеваний. Например, анти-Fas-антитело (предпочтительно, нейтрализующее антитело) может быть объединено с молекулой siPHK р53.

Соединения согласно изобретению могут доставляться либо непосредственно, либо вирусными или невирусными векторами. При непосредственной доставке эти последовательности обычно делают устойчивыми к нуклеазам. Альтернативно, эти последовательности могут быть включены в экспрессионные кассеты или конструкции, так что эта последовательность экспрессируется в клетке, как обсуждается здесь ниже. Обычно эта конструкция содержит подходящую регуляторную последовательность или промотор для создания возможности экспрессии этой последовательности в клетке-мишени. Векторы, необязательно используемые для доставки соединений согласно изобретению, являются коммерчески доступными и могут быть модифицированы для цели доставки соединений согласно изобретению способами, известными специалисту с квалификацией в данной области.

Рассматривается также, что длинный олигонуклеотид (обычно с длиной приблизительно 25-500 нуклеотидов), содержащий одну или несколько структур стебля и петли, где районы стебля содержат последовательности олигонуклеотидов согласно изобретению, может доставляться в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе, и может процессироваться внутриклеточно эндогенными клеточными комплексами (например, DROSHA и DICER, описанными выше) с образованием одного или нескольких меньших двухцепочечных олигонуклеотидов (siPHK), которые являются олигонуклеотидами согласно изобретению. Этот олигонуклеотид может быть назван тандемной конструкцией shPHK. Предполагается, что этот длинный олигонуклеотид является одноцепочечным олигонуклеотидом, содержащим одну или несколько структур стебля и петли, где каждый район стебля содержит смысловую и соответствующую антисмысловую последовательность siPHK гена р53. В частности, предполагается, что этот олигонуклеотид содержит смысловую и антисмысловую последовательности siPHK, изображенные в любой из таблиц А, В или С.

В данном контексте термин «полипептид» относится, наряду с полипептидом, к олигопептиду, пептиду и полноразмерному белку.

Скрининг инактивирующих р53 соединений

Некоторые соединения и композиции согласно изобретению могут быть использованы в скрининг-анализе для идентификации и выделения соединений, которые модулируют активность р53, в конкретных соединениях, которые модулируют алопецию или острую почечную недостаточность или нарушение, сопровождающееся повышенным уровнем полипептида р53. Подлежащие скринингу соединения включают в себя, помимо прочего, такие вещества, как малые химические молекулы и антисмысловые олигонуклеотиды.

Ингибирующая активность соединений согласно изобретению в отношении активности полипептида р53 или связывания соединений согласно изобретению с р53 может быть использована для определения взаимодействия дополнительного соединения с полипептидом р53, например, если это дополнительное соединение конкурирует с олигонуклеотидами согласно изобретению за ингибирование р53 или если это дополнительное соединение снимает указанное ингибирование. Эти ингибирование или активация могут быть тестированы различными способами, такими как, помимо прочего, анализ на продукт активности полипептида р53 или вытеснение связывающего соединения из полипептида р53 в радиоактивном или флуоресцентном конкурентном анализе.

Данное изобретение иллюстрируется более подробно ниже со ссылкой на примеры, но не должно рассматриваться как ограниченное этими примерами.

Цитирование любого приведенного здесь документа не предназначено для признания, что такой документ является прототипом предшествующего уровня техники или рассматриваемым материалом в отношении патентоспособности любого пункта формулы данной заявки. Любое утверждение в отношении содержания или даты любого документа основано на информации, доступной для заявителя в момент подачи заявки, и не является признанием в отношении правильности такого утверждения.

ПРИМЕРЫ

Общие способы в молекулярной биологии

Стандартные протоколы молекулярной биологии, известные в данной области, не описанные конкретно здесь, обычно выполняются по существу, как описано у Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989, 1992) и у Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), и у Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), и у Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, и у Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) и как описано в патентах США 4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057, и включены здесь в качестве ссылки. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили обычно, как описано в PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990). ПЦР in situ (в клетке) в комбинации с проточной цитометрией может быть использована для детектирования клеток, содержащих конкретные последовательности ДНК и мРНК (Testoni et al., 1996, Blood 87:3822). Способы выполнения ОТ-ПЦР также хорошо известны в данной области.

ПРИМЕР 1

Генерирование последовательностей для активных соединений siPHK

С использованием патентованных алгоритмов и известной последовательности гена р53 (SEQ ID NO:1) генерировали последовательности многих потенциальных siPHK. Таблица А показывает 23 siPHK, которые до настоящего времени были отобраны, химически синтезированы и испытаны на активность (см. Пример 2). Все эти siPHK являются 19-мерами.

Обратите внимание на то, что в приведенной выше таблице А смысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:3-25 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:26-48 соответственно. Соединение №1 siPHK (SEQ ID NO:3 и 26) известно из литературы (Dirac and Bernards, Reversal of senescence in mouse fibroblasts through lentiviral suppression of p53, J. Biol. Chem. (2003) 278:11731) и siPHK №2 (SEQ ID NO:4 и 27) также известна из литературы (Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553). Однако применение этих соединений в способах лечения, описанных здесь, не было описано ранее и, следовательно, является новым.

Таблица В ниже показывает дополнительные 71 19-мерные siPHK, которые были генерированы с использованием патентованных алгоритмов.

Обратите внимание на то, что в приведенной выше таблице В смысловые цепи siPHK 1-71 имеют SEQ ID NO:49-11, соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-71 имеют SEQ ID NO:120-190 соответственно.

Таблица С ниже показывает дополнительные 63 21-мерные siPHK, которые были генерированы с использованием патентованных алгоритмов.

Обратите внимание на то, что в приведенной выше таблице С смысловые цепи siPHK 1-63 имеют SEQ ID NO:191-253 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-63 имеют SEQ ID NO:254-316 соответственно.

ПРИМЕР 2

Испытание соединений siPHK на анти-р53-активность

Протоколы

I. Получение siPHK (двухцепочечных олигонуклеотидов)

Лиофилизированные олигонуклеотиды растворяли в не содержащей РНКаз дистиллированной воде с получением конечной концентрации 100 мкМ. Разбавленные олигонуклеотиды выдерживали при комнатной температуре в течение 15 минут и сразу после этого замораживали в жидком азоте.

Эти олигонуклеотиды хранили при -80°С и разбавляли буфером ЗФР перед использованием.

II. Трансфекция siPHK в клетки человека с использованием реагента Липофектамина2000:

2·10⁵ клеток р53-wt HCT116 или SW480 высевали на лунку в 6-луночной чашке. Спустя 24 часа клетки трансфицировали олигонуклеотидами р53 с использованием реагента Липофектамина2000 (полученного из Invitrogen).

Выполняли следующую процедуру:

1. Перед трансфекцией клеточную среду заменяли 1500 мкл свежей среды без антибиотиков.

2. В стерильную, пластиковую пробирку добавляли реагент Липофектамин2000 (количество рассчитывали в соответствии с 5 мкл на лунку) к 250 мкл бессывороточной среды и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре.

3. В другую пробирку добавляли анти-р53-олигонуклеотиды (варьирующиеся количества для подгонки к желаемой конечной концентрации на лунку) к 250 мкл бессывороточной среды.

4. Комплекс Липофектамина2000 объединяли с раствором олигонуклеотида р53 и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.

5. Полученную смесь добавляли по каплям к клеткам и эти клетки инкубировали при 37°С.

6. Клетки SW480: спустя 48 часов после трансфекции эти клетки собирали и белки экстрагировали с использованием буфера RIPA.

7. Клетки НСТ116:

Спустя 40 часов после трансфекции к клеткам добавляли 5Fu (Sigma) для получения конечной концентрации 25 мкг/мл. Спустя 48 часов после трансфекции клеток (8 часов после обработки 5Fu) эти клетки собирали и белки экстрагировали с использованием буфера RIPA.

8. Экспрессию р53 определяли Вестерн-блот-анализом с использованием моноклонального антитела (Do-1-клона, Santa Cruz). Для нормализации блоты испытывали на экспрессию тубулина.

III. Котрансфекция гена р53 мыши и олигонуклеотидов р53 мыши в клетки РС3 с использованием реагента Липофектамина2000:

2·10⁵ клеток р53-0 РС3 высевали на лунку в 6-луночной чашке. Спустя 24 часа клетки котрансфицировали геном р53 мыши и геном GFP, и олигонуклеотидом р53 мыши с использованием реагента Липофектамина2000 (Invitrogen). Выполняли следующую процедуру:

1. Перед трансфекцией клеточную среду заменяли 1500 мкл свежей среды без антибиотиков.

2. В стерильную, пластиковую пробирку добавляли реагент Липофектамин2000 (5 мкл на лунку) к 250 мкл бессывороточной среды и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре.

3. В другую пробирку добавляли 4 мкг ДНК (ген р53:ген GFP, 10:1) и олигонуклеотиды р53 человека к 250 мкл бессывороточной среды.

4. Комплекс Липофектамина2000 объединяли с раствором олигонуклеотида р53 и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.

5. Полученную смесь добавляли по каплям к клеткам и эти клетки инкубировали при 37°С.

6. Спустя 48 часов после трансфекции эти клетки собирали и белки экстрагировали с использованием буфера RIPA.

7. Экспрессию р53 определяли Вестерн-блот-анализом с использованием моноклонального антитела (Clone240, Chemicon). Для нормализации блоты испытывали на экспрессию GFP.

Результаты:

А. Олигонуклеотиды р53 человека:

Таблица D
Номер	Олиго	Вид	Источник	Результаты теста
SW480	HCT116
2	Hu2'	Человек	Литература	(-)	(+)
3	QHMon1	Человек, обезьяна	Патентованный	(++)	(+++)
4	QHMon	Человек, обезьяна	Патентованный	(-)	Не тестировали
5	QH1	Человек	Патентованный	(+++)	(+++)
6	QH2	Человек	Патентованный	(-)	Не тестировали
13	А17	Человек, мышь	Патентованный	(-)	Не тестировали
14	Е2	Человек, мышь, крыса	Патентованный	(+)	Не тестировали
15	Е6	Человек, мышь, крыса	Патентованный	(-)	Не тестировали
16	В1	Человек, мышь, крыса	Патентованный	(-)	Не тестировали
17	В2	Человек, мышь, крыса	Патентованный	(-)	Не тестировали
18	С1	Человек, обезьяна, мышь	Патентованный	(-)	Не тестировали
19	F2	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(-)	Не тестировали
20	F3	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(+++)	(+++)
21	G1	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(+++)	Не тестировали
22	Н2	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(+)	Не тестировали
23	I5	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(+++)	Не тестировали

Примечание: номера в таблице D соответствуют номерам, использованным в таблице А, где смысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:3-25 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:26-48 соответственно.

Как показано в таблице D, четыре олигонуклеотида человека тестировали в двух системах SW480 и HCT116 в соответствии с Протоколом II, приведенным выше. Репрезентативные результаты (Вестерн-блот), на которых основаны результаты теста, показаны на фиг.3.

В. Олигонуклеотиды р53 мыши:

Таблица Е
Номер	Олиго	Вид	Источник	Результаты теста
Клетки РС3/экзогенный р53	0-мышь
1	Мо3	Мышь	Литература	(+++)
7	QM1	Мышь	Патентованный	(-)
8	QM2	Мышь	Патентованный	(-)
9	QM3	Мышь	Патентованный	(-)
10	QM6	мышь	Патентованный	(-)
11	QM4	Мышь, крыса	Патентованный	(+++)
12	QM5	Мышь, крыса	Патентованный	(+++)
13	A17	Человек, мышь	Патентованный	(-)
14	Е2	Человек, мышь, крыса	Патентованный	(++)
15	Е6	Человек, мышь, крыса	Патентованный	(-)
16	В1	Человек, обезьяна, мышь	Патентованный	(-)
17	В2	Человек, обезьяна, мышь	Патентованный	(++)
18	С1	Человек, обезьяна, мышь	Патентованный	(++)
19	G1	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(++)
20	F3	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(+++)
21	I5	Человек, обезьяна, собака	Патентованный	(-)
22	QHMon1	Человек, обезьяна	Патентованный	(++)

Примечание: номера в таблице Е (как и для таблицы D) соответствуют номерам, использованным в таблице А, где смысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:3-25 соответственно, а антисмысловые цепи siPHK 1-23 имеют SEQ ID NO:26-48 соответственно. Репрезентативные результаты Вестерн-блота, на которых основаны результаты теста, показаны на фиг.4.

ПРИМЕР 3

Модельные системы выпадения волос

Тестирование активной siPHK может быть выполнено в следующих системах:

а. Мышиная модель выпадения волос

b. Культивируемые ex vivo волосяные фолликулы человека

с. Трансплантат волосяного фолликула человека в голых мышах

Примечание: Системы для тестирования активной siPHK описаны у Botcharev et al., 2000, p53 is essential for Chemotherapy-induced Hair Loss, Cancer Research, 60, 5002-5006).

ПРИМЕР 4

Модельные системы острой почечной недостаточности (ОПН)

Тестирование активной siPHK для лечения ОПН может быть произведено с использованием индуцированной сепсисом ОПН или индуцированной ишемией-реперфузией ОПН.

1. Индуцированная сепсисом ОПН

Две прогностические модели животных индуцированной сепсисом ОПН описаны Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice, Kidney Int. Nov; 64(5):1620-31. Этими двумя моделями являются введение липополисахарида и слепокишечная лигирующая пункция у мышей, предпочтительно у стареющих мышей.

2. Индуцированная ишемией-реперфузией ОПН

Эта прогностическая модель животного описана Kelly KJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, 2003 January, P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion: protective role of a p53 inhibitor, J Am Soc Nephrol.; 14(1):128-38).

Ишемическое-реперфузионное повреждение индуцировали у крыс после 45 минут билатерального пережимания артерий почек и последующего удаления этого пережимания для создания возможности 24 часов реперфузии. 250 мкг siPHK р53 (последовательность QM5, таблица А) инъецировали в яремную вену за 2 часа до пережимания и спустя 30 минут после этого пережимания. Дополнительные 250 мкг siPHK вводили через хвостовую вену при 4 и 8 часах после пережимания. siPHK против GFP служила в качестве отрицательного контроля. Описанные здесь используемые в этих экспериментах siPHK имели фосфатную группу на 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой цепи. Было обнаружено, что 3'-нефосфорилированная siPHK имеет такую же биологическую активность в модели животного, что и соответствующая 3'-фосфорилированная siPHK. Прогрессирование ОПН подвергали мониторингу измерением сывороточных уровней креатинина до хирургии и спустя 24 часа после хирургии. В конце этого эксперимента крыс перфузировали через постоянную бедренную линию теплым буфером ЗФР и затем 4% параформальдегидом. Левые почки удаляли и хранили в 4% параформальдегиде для последующего гистологического анализа. Острую почечную недостаточность часто определяют как острое увеличение сывороточного уровня креатинина от фона. Увеличение по меньшей мере 0,5 мг на дл или 44,2 мкмоль на л сывороточного креатинина считается указанием на острую почечную недостаточность. Сывороточный креатинин измеряют в момент 0 перед хирургией и при 24 часах после хирургии ОПН.

Для исследования распределения siPHK р53 в почке крысы Cy3-меченые 19-мерные затупленные на концах молекулы siPHK (2 мг/кг), имеющие чередующуюся О-метил-модификацию в сахарных остатках, вводили i.v. в течение 3-5 минут, после чего проводили визуализацию in vivo с использованием двухфотонной конфокальной микроскопии. Анализ конфокальной микроскопией выявил, что большая часть siPHK в почках концентрируется в эндосомном компартменте клеток проксимальных канальцев. Флуоресценция как эндосомной, так и цитоплазматической siPHK была относительно стабильной во время первых 2 часов после доставки и исчезала при 24 часах.

Как видно из фиг.5, имелось десятикратное увеличение уровня сывороточного креатинина после 45 минут обработки билатерального пережимания артерий почек (ЗФР-обработки). Четыре инъекции siPHK р53 (последовательность QM5, таблица А) (за 2 часа до пережимания и спустя 30 минут, 4 часа и 8 часов после пережимания) значимо уменьшали уровень креатинина в сыворотке на 50% (Р<0,001). Эти результаты предполагают, что siPHK р53 может защищать почечную ткань от действий ишемического-реперфузионного повреждения и, следовательно, уменьшает тяжесть ОПН.

Действие обработки siPHK р53 на ишемическое-реперфузионное повреждение определяли дополнительно анализом степени канальцевого некроза в почечной ткани. Канальцевый некроз может оцениваться в баллах следующим образом: нет повреждения (балльная оценка повреждения 0), одноклеточный, изолированный в виде пятен некроз (балльная оценка повреждения 1), канальцевый некроз в менее чем 25% ткани (балльная оценка повреждения 2), канальцевый некроз в 25-50% этой ткани (балльная оценка повреждения 3) и канальцевый некроз в более чем 50% этой ткани (балльная оценка повреждения 4). Фиг.6 демонстрирует повреждение канальцев почек, выраженное в виде балльной оценки повреждения (ось Y) у животных, которые не подвергались ишемическому-реперфузионному повреждению (группа 1), или у животных с ишемическим-реперфузионным повреждением после обработки ЗФР (группа 2), двумя инъекциями siPHK р53 (группа 3), тремя инъекциями siPHK р53 (группа 4) или четырьмя инъекциями siPHK р53 (группа 5). Как показано на фиг.6, четыре инъекции siPHK р53 приводили к значимому уменьшению в канальцевом почечном повреждении в сравнении с обработанной ЗФР контрольной группой. Фиг.7 показывает, что четыре инъекции обработки siPHK р53 отрицательно регулировали экспрессию про-апоптотического гена Puma в кортикальном компартменте почки у животного, подвергнутого ишемическому-реперфузионному повреждению. Это свидетельствует о том, что обработка siPHK р53 способна ингибировать апоптотические процессы в почке после ишемического-реперфузионного повреждения.

1. Соединение в виде двухцепочечной РНК для отрицательной регуляции экспрессии гена р53, имеющее структуру
5'ugaagggugaaauauucuc-Z3' (антисмысловая цепь SEQ ID NO: 48)
3'Z'-acuucccacuuuauaagag 5' (смысловая цепь SEQ ID NO: 25),
где каждый из а, с, u и g означает 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид или немодифицированный рибонуклеотид, и каждый последовательный рибонуклеотид соединен с последующим рибонуклеотидом ковалентной связью;
где каждый из Z и Z' может присутствовать или отсутствовать, но, если присутствует, означает dTdT и является ковалентно присоединенным на 3'-конце цепи, в которой он присутствует; и
где чередующиеся рибонуклеотиды как в антисмысловой цепи, так и в смысловой цепи являются 2'-O-Ме-модифицированными по сахарному остатку рибонуклеотидами, и 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце антисмысловой цепи, и немодифицированный рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце смысловой цепи.

2. Соединение по п.1, где ковалентной связью является фосфодиэфирная связь.

3. Соединение по п.1 или 2, где и Z, и Z' отсутствуют.

4. Соединение по п.1 или 2, где один из Z или Z' присутствует.

5. Соединение по п.1 или 2, где антисмысловая цепь и смысловая цепь являются нефосфорилированными на 3'-конце и 5'-конце.

6. Соединение по п.1 или 2, где антисмысловая цепь и смысловая цепь являются фосфорилированными на их 3'-концах.

7. Соединение в виде двухцепочечной РНК для отрицательной регуляции экспрессии гена р53, имеющее структуру
5' ugaagggugaaauauucuc 3' (антисмысловая цепь SEQ ID NO: 48)
3' acuucccacuuuauaagag 5' (смысловая цепь SEQ ID NO: 25),
где каждый из а, с, u и g означает 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид или немодифицированный рибонуклеотид, и каждый последовательный рибонуклеотид соединен с последующим рибонуклеотидом фосфодиэфирной связью;
где чередующиеся рибонуклеотиды как в антисмысловой цепи, так и в смысловой цепи являются 2'-O-Ме-модифицированными по сахарному остатку рибонуклеотидами, и 2'-O-Ме-модифицированный по сахарному остатку рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце антисмысловой цепи, и немодифицированный рибонуклеотид находится как на 5'-конце, так и 3'-конце смысловой цепи; и где рибонуклеотид на 3'-конце и рибонуклеотид на 5'-конце являются нефосфорилированными как в антисмысловой цепи, так и в смысловой цепи.

8. Фармацевтическая композиция, содержащая любое из соединений по пп.1-7 в количестве, эффективном для отрицательной регуляции экспрессии гена р53 человека, и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7 в количестве, эффективном для лечения пациента, страдающего острой почечной недостаточностью или ишемическим-реперфузионным повреждением, вызванными хирургическим вмешательством, или с высоким риском развития острой почечной недостаточности или ишемического-реперфузионного повреждения, вызванных хирургическим вмешательством, и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Способ лечения пациента, страдающего нарушением, выбранным из группы, состоящей из острой почечной недостаточности и индуцированной цисплатином глухоты, предусматривающий введение этому пациенту соединения по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.

11. Способ улучшения выживаемости трансплантированной ткани после трансплантации у пациента, подвергшегося пересадке почки, предусматривающий введение этому пациенту соединения по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.

12. Применение терапевтически эффективного количества соединения в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления у пациента, страдающего острой почечной недостаточностью, или индуцированной цисплатином глухотой, или для улучшения выживаемости трансплантированной ткани после трансплантации.

13. Способ отрицательной регуляции экспрессии гена р53 по меньшей мере на 50% в сравнении с контролем, предусматривающий приведение мРНК гена р53 в контакт с соединением в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7.

14. Способ предотвращения острой почечной недостаточности у пациента, имеющего высокую степень риска, подвергающегося обширному хирургическому вмешательству, предусматривающий введение этому пациенту соединения по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.

15. Способ по п.14, где хирургическим вмешательством является хирургическая операция на сердце.

16. Способ лечения пациента, страдающего острой почечной недостаточностью или ишемическим-реперфузионным повреждением, вызванными хирургическим вмешательством, или с высоким риском развития острой почечной недостаточности или ишемического-реперфузионного повреждения, вызванных хирургическим вмешательством, который включает введение этому пациенту соединения в виде двухцепочечной РНК по любому из пп.1-7 или композиции по п.8 в терапевтически эффективной дозе, посредством чего осуществляется лечение пациента.

17. Способ по п.16, где хирургическим вмешательством является пересадка почки.

18. Способ по п.16, где хирургическим вмешательством является хирургическая операция на сердце.