Способ получения эритроцитарных мембран с сохранением их морфофункционального состояния при длительном хранении


 


Владельцы патента RU 2436093:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт кардиологии Сибирского отделения РАМН (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения эритроцитарных мембран. Способ получения эритроцитарных мембран, заключающийся в том, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, затем замораживают и хранят при определенных условиях, перед проведением исследований образцы размораживают и проводят гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl с осаждением мембран центрифугированием. Эритроцитарные мембраны, полученные вышеописанным способом, сохраняют свое морфофункциональное состояние. 1 табл.

 

Изобретение относится к фундаментальной медицине и может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.

Подавляющее большинство современных лекарственных препаратов действуют через структуры (ионные каналы, рецепторы), локализованные на клеточных мембранных. Фармакологическая доступность этих структур и само их наличие во многом зависит от морфофункционального состояния мембраны. Одним из важных показателей состояния клеточной мембраны является вязкость ее липидного бислоя. В настоящее время для оценки вязкостных характеристик мембран используют флюоресцентные зонды, а в качестве объекта исследования мембраны эритроцитов, получаемые из образцов цельной крови.

Известен способ получения эритроцитарных мембран для исследовательских целей заключается в том, что используют свежую гепаринизированную кровь с последующим гемолизом эритроцитарной массы в 0,4 М трисНС1 с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин [Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan. D.J. The Preparation and Chemical Characteristics of Hemoglobin-Free Ghosts of Human Erythrocytes Arch. Biochem. Biophys., 1962, vol.201, P.119-130.].

Данный способ является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является то, что забор крови должен проводиться в непосредственной близости от лаборатории и предполагает непрерывное проведение всех этапов выделения эритроцитарных мембран. Способ не позволяет получать эритроцитарные мембраны для оценки их физико-химических свойств из проб крови пациентов в ходе экспедиционной работы. В связи с этим разработка способа получения эритроцитарных мембран с сохранением их морфофункционального состояния после длительного хранении и пригодных для последующего лабораторного исследования является весьма актуальным.

Задача изобретения - разработать способ получения эритроцитарных мембран человека и животных, позволяющий сохранить у них физико-химические характеристики липидного бислоя, содержание белка и показатели активности ферментов при длительном хранении.

Поставленная задача решается тем, что для получения эритроцитарных мембран используют гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl, с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО (диметилсульфоксид), в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С. Собственно выделение мембран может быть отложено на срок, необходимый для формирования полного массива исследуемых образцов или доставки образцов в специализированную лабораторию.

Действие способа связано с защитой мембран эритроцитов от хаотичной деструкции в результате заморозки.

Новым в предлагаемом изобретении является обработка эритроцитарной массы равным объемом буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С с последующим замораживанием и хранением, до этапа лабораторного исследования, при температуре (-20)-(-40)°С.

Проведенные нами исследования дали возможность подобрать необходимые условия обработки эритроцитарной массы и режим ее криохранения, обеспечивающие сохранность физико-химических характеристик липидного бислоя эритроцитарных мембран.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Образец свежей гепаринизированной крови центрифугируется 15 мин при 3000 об/мин. Образовавшийся слой плазмы удаляется. К оставшейся в пробирке эритроцитарной массе добавляется равный ей объем буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО. Содержимое пробирки перемешивается путем мягкого покачивания и оставляется на 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С. Подготовленные образцы переносятся в холодильник с температурой (-20)-(-40)°С, где они хранятся до момента исследования. Образцы размораживаются при комнатной температуре, после чего проводится гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М трисHCl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин. Выделенные мембраны используются в исследованиях в соответствии с стандартными указаниями.

Пример. У экспериментального животного производили забор крови в пробирку, содержащую гепарин, стандартным методом. Кровь перемешивали со стабилизатором и центрифугировали с целью отделения форменных элементов от плазмы в течение 15 мин при 3000 об/мин. Аккуратно при помощи пипетки удаляли плазму. К эритроцитарному осадку добавляли равный объем буфера Кребса-Хензелайта (рН 7,5), содержащего 20% ДМСО, мягко перемешивали содержимое пробирки и оставляли пробу при температуре (+4)-(+8)0С на 30 мин. Затем пробирку с образцом стабилизированных эритроцитов переносили для хранения в морозильную камеру с температурой (-25)°С. Перед процедурой выделения мембран пробу размораживали при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин с последующим удалением надосадочной жидкости. Затем приступали к получению эритроцитарных мембран стандартным методом. Полученный эритроцитарный осадок трижды отмывали 0,145 М NaCl в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4). В процессе отмывки эритроциты осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. К отмытым эритроцитам добавляли двадцатикратный объем гипотонической гемолизирующей среды и пробирку с образцом помещали на 30 минут в ледяную баню. Эритроцитарные мембраны осаждали центрифугированием пробы при 15 000 об/мин в течениеи 20 минут. Полученный осадок эритроцитарных мембран трижды промывали 18 мл промывочной среды и осаждали в центрифуге при 15 000 об/мин в течение 20 минут. Выделенные мембраны для дальнейших исследований разводили в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4).

Эффективность предлагаемого способа получения эритроцитарных мембран человека и животных проверена в 20 сравнительных исследованиях (табл.1).

Таблица 1.
Показатели общего белка и активность K+/Na+АТФазы мембран эритроцитов
Группа Общий белок мг/пробу Активность K+/Na+АТФазы мкмоль Pi/час × мг белка
Нативные пробы 8,3±0,7 0,021±0,003
Пробы после криохранения 7,9±0,8 0,026±0,014

Из таблицы видно, что проведенная авторами обработка и последующее криохранение эритроцитарной массы, а также размораживание и выделение эритроцитарных мембран не повлияли на показатель общего белка по сравнению с аналогичными образцами, полученными из незамороженной крови. Также не были выявлены достоверные различия в активности K+/Na+-АТФ-азы, определенной в эритроцитарных мембранах, полученных из нативных эритроцитов и эритроцитов, обработанных нашим способом.

Предлагаемое изобретение позволяет сохранить эритроцитарные мембраны человека или животных при длительном хранении с неизменными физико-химическими характеристиками липидного бислоя, содержания белка и активности ферментов.

Способ получения эритроцитарных мембран, заключающийся в гемолизе эритроцитарной массы с последующим осаждением мембран путем центрифугирования, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 мин при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С, перед проведением исследований образцы размораживают при комнатной температуре и проводят гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин, в течение 20 мин.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины и касается способа прогноза некроза лейомиомы матки у беременных во втором триместре. .

Изобретение относится к области медицины, в частности к анализу крови, и касается реактива для анализа незрелых лейкоцитов в периферической крови, включающего: полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество, солюбилизирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из производного саркозина, производного холевой кислоты и метилглюканамида, и краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты, причем реактив имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови. .
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и предназначено для прогнозирования состояния фертильности у женщин репродуктивного возраста с миомой матки.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и предназначено для прогнозирования состояния фертильности у женщин репродуктивного возраста с миомой матки.

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу инфекционных болезней, и описывает способ оценки тяжести течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий определение маркера дисфункции эндотелия сосудов в крови, где в плазме крови в качестве маркера дисфункции эндотелия сосудов определяют концентрацию антигена ингибитора активаторов плазминогена 1 типа (ИАП-1) в лихорадочный период болезни и значение концентрации антигена ИАП-1 от 341,2 до 570,0 нг/мл оценивают как предиктор среднетяжелой формы заболевания, от 240,4 до 320,1 нг/мл - как предиктор тяжелой формы заболевания без осложнений, от 138,3 до 75,5 нг/мл оценивают как предиктор тяжелой формы заболевания с осложненным течением.
Изобретение относится к медицине, к хирургии, анестезиологии-реаниматологии и интенсивной терапии, и может быть использовано для диагностики внутреннего кровотечения.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и касается способа прогнозирования фетопатии у беременных с гипотиреозом и ожирением. .

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки реакции организма на внешнее воздействие, при исследовании разных форм патологии и в экологических экспериментах.
Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, и может быть использовано для контроля эффективности гемодиафильтрации при проведении экстракорпорального лечения при острой почечной недостаточности
Изобретение относится к области медицины, а именно к нефрологии

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам для анализа газов живого организма
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству
Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для экспресс-определения атерогенности плазмы крови человека
Изобретение относится к медицине, а именно к психоневрологии, и описывает способ прогнозирования восстановления неврологических функций у больных в остром периоде ишемического инсульта путем проведения клинических и биохимических исследований общей концентрации альбумина (ОКА) в сыворотке крови в г/л, где дополнительно на 5-7 день заболевания определяют эффективную концентрацию альбумина (ЭКА), рассчитывают резерв связывания альбумина (РСА) и при величине этого показателя менее единицы прогнозируют отрицательный результат восстановления неврологических функций у больных в остром периоде ишемического инсульта
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и онкологии, и касается способа прогноза чувствительности к интерферону у больных почечно-клеточным раком (ПКР)

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения содержания глюкозы в клетке крови

Изобретение относится к локационной измерительной технике, биологии, применительно к определению содержания примесей в отдельных объемах воздушной среды, окружающей живой объект
Наверх