Способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодифференцированных глиом

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии. Определение границ инвазии низкодифференцированных глиом осуществляют путем визуализации астроглиального вала, окружающего низкодифференцированную глиому. Получают иммуногенный рекомбинантный GFAP человека, иммунизируют им мышь линии Balb/C, выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp 2/0-Ag14, получают гибридомы. Тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически на наличие анти-GFAP антител, из них отбирают клон гибридных клеток, продуцирующий анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo. Очищают анти-GFAP антитела из супернатанта отобранного клона и ковалентно связывают с липосомальными наноконтейнерами, содержащими диагностическую метку. Антитела отобранного клона гибридных клеток модифицируют по ε-аминогруппам остатков лизина и инкубируют с раствором stelths-липосом. Полученную наносистему вводят в сосудистое русло пациента и визуализируют астроглиальный вал по расположению диагностической метки в тканях головного мозга. Способ позволяет профилактировать рецидивы низкодифференцированных глиом после их хирургического лечения путем выбора оптимального объема предстоящей операции за счет определения границ опухолевой инвазии с помощью визуализации астроглиального вала опухоли. 5 з.п. ф-лы, 4 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно нейрохирургии, может быть использовано для прижизненной диагностики низкодифференцированных глиом и профилактике послеоперационных рецидивов.

В структуре нейроонкологических заболеваний 40-45% принадлежит низкодифференцированным глиомам. Прогноз для пациентов со злокачественными глиомами довольно мрачен, несмотря на значительный прогресс в современной нейроонкологической практике. Причина подобного состояния проблемы заключается в неэффективности существующих стратегий лечения и диагностики в отношении столь высокоинвазивных опухолей. Довольно часто злокачественные клетки глии распространяются по всему мозгу. Активная миграция глиомных клеток исключает радикальную хирургию глиобластомы, в результате чего рецидив опухолевого роста после хирургического лечения неизбежен, несмотря на агрессивное послеоперационное применение адъювантной лучевой терапии и/или химиотерапии.

Таким образом, способность распознавать опухоли мозга в начале болезни является необходимым условием для предотвращения массового воздействия инвазивно растущей опухоли на соседние структуры нервной ткани. Однако в настоящее время современные технологии визуализации не являются достаточно чувствительными для обнаружения опухоли на ранней стадии, тем более для визуализации инвазивных тяжей опухоли (Shaheen Е Lakhan and Lindsey Harle «Difficult diagnosis of brainstem glioblastoma multiforme in a woman: a case report and review of the literature» J Med Case Reports. 2009; 3: 87).

В эпоху активного развития современной нейроонкологии было проведено большое количество исследований в области лечения и диагностики мультиформных глиобластом. Активно развиваются такие направления, как иммунотерапия, генная терапия и адресная доставка лекарств через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (Gupta В. et al. «Monoclonal antibody 2C5-modified doxorubicin-loaded liposomes with significantly enhanced therapeutic activity against intracranial human brain U-87 MG tumor xenografts in nude mice» Cancer Immunol Immunother. 2007 Aug; 56(8):1215-23). Следует отметить, что существенных успехов в терапии глиобластом практически не достигнуто, поскольку по-прежнему не разработан доступ непосредственно к опухолевым клеткам, мигрировавших от основного очага по перивазальным и периневральным путям. (Hefti М et al. «Multicentric tumor manifestations of high grade gliomas: independent proliferation or hallmark of extensive disease?», J.Cen Eur Neurosurg. 2010 Feb; 71(1):20-5.).

В литературе имеется публикация, где описывается способ визуализации низкодифференцированных глиом методом магниторезонансной томографии (Thu MS et al. «lron Labeling and Pre-Clinical MRI Visualization of Therapeutic Human Neural Stem Cells in a Murine Glioma Model, J. PLoS One. 2009 Sep 29;4(9):e7218). Все исследования проводят в рамках пилотного эксперимента "A Pilot Feasibility Study of Oral 5-Fluorocytosine and Genetically modified Neural Stem Cells Expressing Escherichia coli Cytosine Deaminase for Treatment of Recurrent High-Grade Gliomas" и в больше степени направлено на изучение терапевтического эффекта применения нейрональных стволовых клеток.

Способ визуализации границ опухолевой инвазии низкодифференцированных глиом с целью диагностики имеет ряд преимуществ, поскольку высокая частота послеоперационных рецидивов глиобластомы обусловлена ее инвазивным ростом (Zalutsky M.R et al. «Dosimetry and Radiographic Analysis of 1311-Labeled Anti-Tenascin 81C6 Murine Monoclonal Antibody in Newly Diagnosed Patients with Malignant Gliomas: A Phase II Study», Journal of Nuclear Medicine Vol.46 No.6 1042-1051 2005). Опухолевые клетки, быстро распространяясь по перивазальным и периневральным пространствам, образуют длинные тонкие тяжи инвазии, макроскопически невидимые, вследствие чего опухоль не может быть полность удалена (Sanson М et al «FABP7 expression in glioblastomas: relation to prognosis, invasion and EGFR status», J Neurooncol. 2007 Sep; 84(3):245-8).

Таким образом, сложность визуализации глиом заключается в характере инвазивного роста опухоли, при котором ее длинные тяжи внедряются глубоко в непораженные ткани мозга. Известно, что границы опухолевой инвазии очерчены астроглиальным валом, повторяющим конфигурацию границ инвазии (Чехонин В.П. и соавт., 2008).

В литературе нами не найдено способов визуализации низкодифференцированных глиом по астроглиальному валу.

Задачей изобретения является разработка способа прижизненной визуализации границ инвазии низкодифференцированных глиом по астроглиальному валу, сопровождающему опухоль.

Технический результат заключается в профилактике рецидивов низкодифференцированных глиом после их хирургического лечения путем выбора оптимального объема предстоящей операции за счет определения границ опухолевой инвазии с помощью визуализации астроглиального вала опухоли.

Важно подчеркнуть, что GFAP цитоплазматический белок и в условиях нормального функционирования организма недоступен для циркулирующих в крови антител. В процессе опухолевого роста количество реактивных астроцитов возрастает, по мере инвазии они разрушаются, что сопровождается выходом GFAP в межклеточное пространство, откуда белок в скором времени утилизируется в кровь и ликвор, где уровень его по мере роста опухоли увеличивается.

Нами установлено, что GFAP реактивных астроцитов периоглиомного вала доступен для циркулирующей в крови наносистемы на основе анти-GFAP антител при низкодифференцированных глиомах. Полученная наносистема способна проникать через паталогический гемато-энцефалический барьер из кровеносного русла в область глиомы, что позволило нам визуализировать астроглиальный вал по ходу опухолевой инвазии.

Сущность изобретения заключается в следующем. Определение границ инвазии низкодифференцированных глиом осуществляют путем визуализации астроглиального вала, окружающего низкодифференцированную глиому. Получают иммуногенный рекомбинантный GFAP человека. Иммунизируют им мышь линии Balb/C. Выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp 2/0-Ag14. Получают гибридомы. Тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически на наличие анти-GFAP антител. По результатам иммунохимического тестирования из них отбирают клон гибридных клеток, продуцирующих анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo. Из супертнатанта отобранного клона гибридных клеток выделяют антитела и ковалентно связывают с липосомальными наноконтейнерами, содержащими диагностическую метку. Для конъюгирования анти-GFAP антител с липосомальными наноконтейнерами антитела отобранной гибридомы модифицируют по ε-аминогруппам остатков лизина. После чего их инкубируют с раствором stelths-липосом. Полученную наносистему в количестве вводят в сосудистое русло пациента. Визуализацию астроглиального вала осуществляют по расположению диагностической метки в тканях головного мозга.

В частном случае, полученную наносистему вводят в количестве не менее 500 мкг/кг веса пациента по белку.

В частном случае, для отбора клона, продуцирующего анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo применяют метод иммунохимического тестирования на живой культуре астроцитов человека и/или крысы.

В частном случае, для увеличения продукции анти-GFAP антител проводят введение отобранного клона гибридных клеток, продуцирующие анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo, интраперитонеально мышам линии Balb/C. Далее, не менее чем через 7 дней, отбирают у них асцитическую жидкость. Из полученных асцитов выделяют антитела методом иммуноаффинной хроматографии с помощью GFAP, ковалентно связанного CN-Br-сефарозой.

Модификация анти-GFAP антител отобранной гибридомы по ε-аминогруппам остатков лизина может проводиться, например, с помощью 2-иминотиолана.

Изобретение поясняется следующими фигурами.

На фиг.1 представлен срез головного мозга крысы, где иммунохимически in vitro показана глиома, окруженная астроглиальным валом, где позиция 1 - астроглиальный вал, позиция 2 - глиома на 10 сутки после имплантации глиомных клеток в мозг крысы.

На фиг.2 представлен участок периглиомного пространства, где имеются инвазивные тяжи (позиция 3) на малом увеличении. На фиг.3 представлен участок периглиомного пространства, окруженного реактивными астроцитами, на большом увеличении, где позиция 4 - инвазивный тяж на большом увеличении, позиция 5 - реактивные астроциты, спровождающие инвазивный тяж растущей глиомы на большом увеличении.

На фиг.4 представлены результаты визуализации глиомы по астроглиальному валу in vivo, где А - визуализация астроглиального вала in vivo на малом увеличении, а Б - визуализация астроглиального вала in vivo на большом увеличении.

Способ осуществляется следующим образом.

Для получения иммуногенного рекомбинантного GFAP человека может быть использована, например, методика, подробно изложеная в кандидатской диссертации «Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного GFAP. Разработка количественного иммуноферментного анализа» (К.A. Павлов, 2009 г.).

Препарат моноклональных анти-GFAP антител получают путем гибридизации мышиной миеломной линии Sp 2/0-Ag14.1 с лимфоцитами селезенки иммунных мышей линии Balb/c по методу Келлера и Мильдштейна (1976). Иммунизацию проводят высокоочищенным препаратом рекомбинантного GFAP человека. Подкожно в три точки вводят очищенный препарат GFAP (20 мкг) с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с интервалом 1 раз в 10 дней, с последующим 2-месячным перерывом. Затем повторяют цикл иммунизации и на 5-6-й день после второго цикла иммунизации вводят внутрибрюшинно 50 мкг GFAP в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Эффективность иммунизации оценивают методом иммунодиффузии и прямого иммуноферментного анализа. Гибридизацию проводят на 3-4-й день после последней инъекции антигена в соотношении клеток миеломы и В-лимфоцитов 1:10. Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Скрининг гибридом на продукцию анти-GFAP антител проводят методами сэндвич-вариант ИФА, иммуногистохимии и иммуноцитохимии in vitro и in vivo. По результатам иммунохимического тестирования in vivo, в частности, на живой культуре астроцитов человека и/или крысы отбирают клон гибридных клеток, способный распознавать GFAP в нативной конформации. При культивировании отобранного клона гибридных клеток в брюшинной полости мышей Balb/c (1-2 млн. кл. на мышь), предварительно сенсибилизированных пристаном, образуются асцитные опухоли. Асцитическая жидкость (3-10 мл на мышь) получают на 7-10 день после инокуляции клеток. Очистку моноклональных антител из асцита проводят с помощью аффинной хроматографии на CN-Br-сефарозе с иммобилизованным белком GFAP по стандартному протоколу с элюцией градиентом рН.

Таким образом, продуцируемые отобранным клоном гибридных клеток моноклональные антитела высокочувствительны, специфичны и пригодны для использования in vivo.

Приготовление наносистемы складывается из приготовления липосомальных наноконтейнеров с диагностической меткой и последующей конъюгации с анти-GFAP антителами отобранного клона гибридных клеток.

Синтез ПЭГилированных липосомальных наноконтейнеров или stelth-липосом проводится по общепринятой методике, модифицированной в соответствии с задачами конкретного эксперимента (Kamps et al., J.Drug Target», 2000, 8(4), 235-245). Модификация состоит в следующем.

Основными компонентами stelth-липосом являются: лецитин из желтков куриных яиц, холестерин и дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), конъюгированный с PEG-2000 (полиэтиленгликоль 2000 Да). Для связывания с тиолированными антителами в состав липосом вводят малеимидное производное DSPE-PEG-2000 (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(малеимид-(полиэтиленгликоль)-2000)). В его молекуле малеимидная группа присоединена к внешнему концу цепи ПЭГ-2000, что позволяет «выводить» белок-вектор за пределы экранирующего слоя PEG.

Cо stelth-липосомами ковалентно связывают любую диагностическую метку в зависимости от метода ее детектирования, например флюоресцентную метку, радионуклидную метку (метод сцинтиографии), МРТ-контрастную(наноконтейнеры с контрастирующим агентом).

Для введения в анти-GFAP антитела фрагмента, содержащего SH-группу, антитела модифицируют по ε-аминогруппам остатков лизина с помощью 2-иминотиолана в 0,1 моль/л натрий-фосфатном буфере в концентрации 1 мг/мл в условиях темноты в течение 1 ч под аргоном при комнатной температуре. После остановки реакции тиолирования от избытка имитиолана освобождаются с помощью гель-фильтрации через сефадекс G-25.

Тиолированные анти-GFAP антитела инкубируют с липосомальными наноконтейнерами, уже содержащими малеимидное производное DSPE-PEG-2000, что приводит к образованию тиоэфирной связи между SH-группой MАТ и малеимидным фрагментом. Этот метод позволяет достигнуть высокоэффективного связывания антител с поверхностью stelth-липосом.

После завершению инкубации отделяют от несвязавшихся антител и N-этилмалеимида с помощью гельфильтрации на колонке (1×17 см) с сефадексом G-100, уравновешенной с 0,1 моль/л натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), при скорости потока 25 мл/час по показаниям спекторфотометра.

Полученную наносистему концентрируют до нужной концентрации и стерилизуют методом фильтрования через ацетатцеллюлозные фильтры (Millipore) с диаметром отверстий 0,22 мкм в условиях стерильного бокса.

Для визуализации структур астроглиального вала in vivo полученную наносистему вводят в кровеносное русло пациента не менее чем 500 мкг/кг веса пациента, после чего через определенные интервалы времени в зависимости от диагностического метода регистрируют сигнал накопления диагностической метки, а именно в зоне экспрессии GFAP реактивных астроцитов, сопровождающих инвазию глиомы.

Селективность накопления моноклональных антител в зоне экспрессии GFAP при внутривенном введении может оцениваться различными методами в зависимости от типа диагностической метки, в частности методами сцинтиграфии (радионуклидная метка), ПЭТ (короткоживущие изотопы), MРТ (наноконтейнеры с контрастирующим агентом).

Для доказательств возможности осуществления предложенного способа с достижением заявленного назначения и указанного технического результата приводим следующие данные.

ПРИМЕР 1

Очищенные анти-GFAP антитела из отобранного клона гибридных клеток, распознающего GFAP in vivo, с целью определения специфичности к GFAP реактивных астроцитов, их функциональной активности и рабочей концентрации протестировали на срезах головного мозга крысы с глиомой С6. При иммунофлюоресцентном анализе на срезах головного мозга крысы с глиомой С6 полученные моноклональные антитела четко визуализируют реактивные астроциты вокруг имлантированной опухоли (Фиг.1).

Анти-GFAP антитела диализовали против 0,1 моль/л натрий-фосфатного буфера (рН 7,4) в течение 1 ч при перемешивании, освобождая от триса.

Анти-GFAP антитела модифицировали по ε-аминогруппам остатков лизина с помощью 2-иминотиолана в 0,1 моль/л натрий-фосфатном буфере в концентрации 1 мг/мл для введения фрагмента, содержащего SH-группу. Реакцию тиолирования проводили в условиях темноты в течение 1 ч под аргоном при комнатной температуре, после останавливали отделением избытка 2-иминотиолана от белка с помощью гель-фильтрации через сефадекс G-25.

Паралелльно готовили липосомальные наноконтейнеры. Лецитин, холестерин, DSPE-PEG-2000, его малеимидное производное и флюресцентную метку Dil растворили в смеси хлороформ-метанол (9:1) в концентрации суммарных липидов 5-10 мг/мл в молярном соотношении 23:16:1.6:1:0.4. Смесь высушили на роторном испарителе при пониженном давлении. Сухую липидную пленку растворили в абсолютном циклогексане, заморозили в жидком азоте, лиофилизовали, после чего смесь липидов эмульгировали в 0,1 М фосфатном буфере. Гидратированную эмульсию обработали в ультразвуковом дезинтеграторе и 15-кратно пропустили через поликарбонатные мембранные фильтры с размерами пор 400, 200, 100 и 50 нм с помощью мини-экструдера.

После этого инкубировали тиолированные анти-GFAP антитела с липосомальными наноконтейнерами, уже содержащими малеимидное производное DSPE-PEG-2000 и диагностическую метку Dil. Малеимидное производное приводит к образованию тиоэфирной связи с SH-группой анти-GFAP антител. Отделение липосом, конъюгированных с антителами, от несвязавшихся антител и N-этилмалеимида проводили с помощью гельфильтрации на колонке (1×17 см) с сефадексом G-100, уравновешенной с 0,1 моль/л натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), при скорости потока 25 мл/час. Контроль за движением образца осуществляли визуально по окраске Dil. Стерилизацию липосом проводили методом фильтрования через ацетатцеллюлозные фильтры (Millipore) с диаметром отверстий 0,22 мкм в условиях стерильного бокса.

Эффективность связывания оценили по соотношению концентрации белка во фракциях stelth-липосом и несвязавшихся иммуноглобулинов. Этот показатель при эффективной пришивке иммуноглобулинов составил 70-80%.

Моделью глиобластомы человека на крысах является индуцированная глиома С6 (Auer RN.., et al A simple and reproducible experimental in vivo glioma model. Can J Neurol Sci 1981; 8:325-331). По морфологии, характеру инвазивного роста и спектру экспрессируемых белков глиома С6 очень близка мультиформной глиобластоме человека. Спектр экспрессируемых клетками глиомы С6 белков включает белки базальной мембраны, белки клеточной адгезии и тканевые протеолитические ферменты, обеспечивающие деградацию межклеточного матрикса в процессе инвазии, сигнальные белки, факторы роста и их рецепторы, поддерживающие высокий уровень пролиферации опухолевых клеток и стимулирующие ангиогенез (Grobben В., De Deyn (2002) Rat С6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. // Cell Tissue Res. 310, p.257-270).

Для моделирования глиобластомы применили методику стереотаксической имплантации предварительно культивированных глиомных клеток в стриатум мозга крысы (Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., 2007) (фиг.1, 2, 3).

Пяти крысам имплантировали методом стереотаксиса глиомные клетки линии С6 крысы в количестве 5·10⁵. На 18 сутки роста глиомы каждой крысе под кетаминовым наркозом в системный кровоток ввели 1 мл препарата полученной наносистемы, содержащего 100 мкг анти-GFAP антител из расчета 500 мкг/кг по белку. Наносистема на основе анти-GFAP антител циркулировала в кровотоке каждой крысы в течение 48 часов, после чего каждая крыса подверглась перфузии 4% раствором параформальдегида с последующей декапитацией и извлечением головного мозга. Извлеченный мозг был подвергнут дополнительной фиксации в 4% растворе параформальдегида при +4°C, после чего на замораживающем микротоме из него приготовили срезы толщиной 100 микрон. Срезы с глиомой смонтировали на предметное стекло с последующим нанесением на них 80% глицерина в Tr-HCl буфере (рН 8,3) под покровное стекло.

Оценку адресной доставки наносистемы на основе анти-GFAP антител к мишени в организме живой крысы провели с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии по флюресцентной метке Dil. На фиг.4 вокруг имплантированной глиомы С6 по (зеленая флюоресценция) визуализируются реактивные астроциты, сопровождающие опухолевую инвазию (позиция А, позиция Б).

Проведенное экспериментальное иммунохимическое исследование на живых крысах с имплантированной глиомой С6 показало перспективность применения полученной наносистемы для визуализации астроглиального вала по локализации диагностической метки. Во всех случаях у 5 экспериментальных животных визуализированные по предложенному способу границы опухолевой инвазии глиомы полностью совпали с границами опухолевой инвазии, определенной с помощью гистологических исследований.

1. Способ определения границ инвазии низкодифференцированных глиом, при котором границы инвазии определяют путем визуализации астроглиального вала, окружающего низкодифференцированную глиому, для чего получают иммуногенный рекомбинантный GFAP человека, иммунизируют им мышь линии Balb/C, выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp 2/0-Agl4, получают гибридомы, тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически на наличие анти-GFAP антител, из них отбирают клон гибридных клеток, продуцирующий анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo; очищают анти-GFAP антитела из супернатанта отобранного клона и ковалентно связывают с липосомальными наноконтейнерами, содержащими диагностическую метку, при этом антитела отобранного клона гибридных клеток модифицируют по ε-аминогруппам остатков лизина и инкубируют с раствором stelths-липосом, полученную наносистему вводят в сосудистое русло пациента и визуализируют астроглиальный вал по расположению диагностической метки в тканях головного мозга.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученную наносистему вводят в количестве не менее 500 мкг/кг веса пациента по белку.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбор клона, продуцирующего анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo, осуществляют методом иммунохимического тестирования на живой культуре астроцитов человека и/или крысы.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для увеличения продукции анти-GFAP антител отобранным клоном внутрибрюшинно мышам вводят клетки отобранного клона, затем не менее чем через 7 дней отбирают у них асцитическую жидкость.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищают анти-GFAP антитела из супернатанта отобранного клона методом иммуноаффинной хроматографии с помощью GFAP, ковалентно связанного CN-Br-сефарозой.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что анти-GFAP антитела отобранного клона модифицируют по ε-аминогруппам остатков лизина с помощью 2-иминотиолана.