Способ получения сухих липосомальных препаратов (варианты)
Владельцы патента RU 2437649:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства (RU)
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способов получения высокодисперсных липосомальных препаратов для профилактики и лечения заболеваний человека и животных. Предлагается способ получения сухих липосомальных препаратов, включающий в себя смешение фосфолипидов, порошкообразного носителя и биологически активного вещества и дальнейшую обработку полученной смеси, отличающийся тем, что в загрузочный бункер струйной мельницы засыпают композицию, состоящую из биологически активного вещества, фосфолипида из группы, включающей витол и лецитин ПРО, и водорастворимого порошкообразного носителя и подвергают помолу в струйной мельнице при давлении не менее 2,5 атм и расходе газа не менее 100 л/мин с дальнейшим выделением фракции с размером частиц меньшем чем 50 мкм. Как вариант, предлагается подвергать помолу смесь фосфолипидов и порошкообразного носителя, а затем добавляют к полученному продукту раствор биологически активного вещества в полярном растворителе, и подвергают суспензию лиофильному высушиванию, обрабатывая ее при необходимости перед сушкой ультразвуком при частоте 40 кГц. Предлагаемый способ простой в использовании. Он более безопасен и экологичен. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.
Изобретение относится к области прикладной биотехнологии, а именно к способам получения высокодисперсных липосомальных препаратов для профилактики и лечения заболеваний человека и животных. Изобретение может быть использовано также в медицине, косметике, пищевой и химической промышленности, в сельском хозяйстве.
В настоящее время существуют разнообразные методы приготовления липосом, позволяющие получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема, а также способы иммобилизации в них веществ (Liposomes, a practical approach. Ed. by R.R.C.New, Oxford etc., IRL Press, 1990).
В частности, липосомы получают выпариванием фосфолипидов из органической фазы в виде тонкой пленки на внутренней стенке стеклянной колбы роторного испарителя, после чего в колбу вносят водяной или солевой раствор, содержащие лекарственное вещество. Диспергирование фосфолипидов в водной или солевой среде осуществляют путем встряхивания колбы со стеклянными шариками. В результате образуется суспензия, состоящая из замкнутых многослойных липосом с включенным во внутренний их объем лекарственным веществом. Для дальнейшего формирования липосом и улучшения их качеств используют такие приемы, как озвучивание, экструзия, замораживание - оттаивание, обработка детергентами и др. (Bangham A.D., Prog. Biophis. Mol. Biol., 1968, v.18, pp.29-95; Липосомы в биологических системах. Под ред. Грегориадиса Г. и Аллисона А.-М., Медицина, 1983; пат. Украины, №5654, 1995; пат. США №4883665, 1990; Ефременко В.И., Липосомы, Ставрополь, 1999).
Известен способ получения липосом путем выпаривания и обращения фаз, когда фосфолипиды растворяют в органическом растворителе, который затем приводят в контакт с водной фазой, содержащей лекарственные вещества. После отгонки растворителя под вакуумом получают взвесь липосом с высокой эффективностью иммобилизации в них материала (Sada E.et.al., Biotechnol. and Bioeng., 1988, v.32, №6, pp.826-830; Szulc J. et. al., Farm. Pol, 1985, v.41, №6, pp.319-322).
Крупные моноламеллярные липосомы получают в процессе многократно повторяющихся циклов замораживания водных фосфолипидных дисперсий с последующим оттаиванием в присутствии криопротекторов (Pick U., Arch. Biochem. a. Biophys., 1981, v.212, pp.186-194).
Недостатками описанных способов являются: нестабильность получаемых водных дисперсий липосом с включенным в них лекарственным веществом, сложность в изготовлении, невозможность использовать данные способы для промышленного производства липосомальных препаратов.
Наиболее перспективными для коммерческого применения являются сухие липосомальные препараты, основу которых составляет композиция, состоящая из порошка, приемлемого для организма наполнителя, хорошо растворимого в воде, фосфолипидов, высушенных в виде тонких пленок, и покрывающего частицы порошкообразного наполнителя, и биологически активного вещества. После добавления воды к сухому, покрытому фосфолипидами наполнителю (пролипосомам) он быстро растворяется, и из фосфолипидов образуются липосомы, которые включают биологически активное вещество в зависимости от его природы или во внутренний объем, или в бислойную оболочку липосом (Payne N.I. et al.:, J. Pharm. Sci., 1986, v.75, №4, pp.325-329; Preparation of liposomes. In: Liposomes, a practical approach, ed. by R.R.C.New. Oxford, IRL Press, 1990, pp.33-104). Технология получения заключается в том, что раствор фосфолипидов в хлороформе (или другом органическом растворителе) напыляют на тонко измельченный наполнитель (или другую подложку), находящийся в быстро вращающейся колбе роторного испарителя, погруженной в термостатируемую водяную баню при температуре 30-45°С. Гидрофобные биологически активные вещества растворяют вместе с фосфолипидами в растворителе. Гидрофильные соединения могут быть перемешаны с наполнителем. Раствор фосфолипидов в хлороформе распыляют небольшими порциями до тех пор, пока он весь не будет использован, после чего, чтобы избавиться от остатков органического растворителя, композицию досушивают под вакуумом или подвергают лиофилизации. Полученный сухой липосомальный препарат фасуют небольшими порциями в стеклянные флаконы, которые герметически укупоривают и хранят до использования. Препарат может храниться при температуре не выше плюс 10°С в течение года.
Недостатками данного способа являются ограниченность применения из-за негативного влияния растворителя на свойства получаемого препарата, невозможность соблюсти точную дозировку препарата из-за существенных потерь ингредиентов, трудность масштабирования и непригодность данного способа для промышленного использования.
Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получения сухих липосомальных лекарственных препаратов, осуществляемый смешиванием в емкости биологически активного вещества (БАВ), фосфолипидов, растворителя и порошкообразного наполнителя до достижения однородности композиции, после чего получают липосомальный препарат путем отгонки растворителя при перемешивании в условиях пониженного давления (RU 2130771, 1999). Данный способ значительно упрощает и удешевляет приготовление липосомальных препаратов, а также обеспечивает достаточно высокий процент включения в липосомы биологически активных веществ.
Недостатками прототипа являются ограниченная область его применения в связи с возможностью потери активности многих биологически активных веществ, в частности белков и ферментов, из-за денатурирующего действия органических растворителей. Кроме того, при промышленном производстве использование токсичных органических растворителей может оказывать негативное влияние на экологию окружающей среды и требует повышенных мер безопасности.
Задачей настоящего изобретения являлась разработка более эффективной и безопасной промышленной технологии получения высокодисперсных активных липосомальных препаратов, применимой для включения в липосомы практически любых биологически активных веществ.
Технический результат достигается в результате использования одного из двух вариантов способа. По первому варианту смесь сухих фосфолипидов, водорастворимого порошкообразного наполнителя и БАВ смешивают в емкости, а затем подвергают обработке в струйной мельнице при давлении не менее 2,5 атм и расходе воздуха не менее 100 л/мин, после чего фракционируют полученный продукт, выделяя из него фракцию менее 50 мкм. Полученный продукт фасуют, хранят и перед применением регидратируют в воде или биологически приемлемой жидкости, в частности в водосодержащем растворителе, например физрастворе. Данный способ наиболее перспективен для получения липосом с БАД, растворимыми в неполярных растворителях, хотя применим и в случае использования полярных БАД.
По второму варианту предварительно обработке в струйной мельнице подвергают смесь сухих фосфолипидов и водорастворимого порошкообразного наполнителя, а БАВ вводят в полученную смесь в виде водного раствора, после чего полученный продукт далее подвергают лиофильному высушиванию. При этом при необходимости перед высушиванием его подвергают кратковременному (около минуты) воздействию ультразвуком на частоте 40 кГц, что повышает дисперсность образующейся суспензии.
В качестве водорастворимого порошкообразного наполнителя используют разрешенные Минздравом для производства лекарств, легкорастворимые физиологически приемлемые для организма вещества, такие как: сахара и полисахариды (сахароза, глюкоза, манноза, декстраны и т.п.), полиолы (сорбит, маннит, ПВС и др.), хлористый натрий, глицин, поликлюкин и другие. Выбор используемого наполнителя определяется экспериментально, исходя из особенностей используемого БАД и требований к получаемому препарату. В качестве фосфолипидов могут быть использованы как конкретные фосфолипиды, так и их смеси, полученные из растительного, животного или микробиологического сырья. Конкретная рецептура липосомального препарата определяется в основном особенностями БАВ и требованиями к дисперсности получаемых липосомальных частиц. В частности, при получении липосомального препарата с размером частиц менее 20 мкм появляется возможность их использования для интранозального применения и т.п.
Сущность заявляемого способа состоит в том, что в результате одновременного измельчения биологически активного вещества, фосфолипида и наполнителя получают композицию, содержащую относительно крупные частицы наполнителя (20-40 мкм) и высокодисперсные частицы (менее 10 мкм) биологически активного вещества и фосфолипида. В результате аутогезии, возникающей в условиях сочетания процессов измельчения наполнителя и образования при измельчении заряженных частиц с развитой поверхностью, а также интенсивного перемешивания всех компонентов, полученные высокодисперсные частицы биологически активного вещества и фосфолипидов прилипают к поверхности крупных частиц наполнителя, образуя сухой липосомальный препарат, состоящий из частиц сложной формы с развитой внешней поверхностью (см. фиг.1). После растворения препарата в водной среде или биологической жидкости наполнитель быстро растворяется, а из фосфолипидов образуются липосомы, в которые включается биологически активное вещество, находящееся в растворе (см. фиг.2).
Во втором варианте сначала получают «пустой» липосомальный препарат путем смешивания в загрузочной емкости мельницы фосфолипида и наполнителя с последующей обработкой полученной смеси в струйной мельнице, при которой микрочастицы фосфолипидов сорбируются на поверхности частиц наполнителя. Затем высокодисперсную смесь обрабатывают раствором биологически активного вещества в полярном растворителе, например воде или физиологическом растворе. При этом наполнитель растворяется, а из фосфолипидов образуются везикулы, которые захватывают растворенные в воде БАВ и носитель, после чего полученный жидкий липосомальный препарат биологически активного вещества подвергают сублимационному высушиванию, фасуют, хранят и при необходимости дополнительно подвергают гидратации.
Обработку смеси проводят на установке измельчения, содержащей последовательно соединенные струйную мельницу и два циклонных сепаратора. Проведение процесса измельчения при давлении менее 2,5 атм и расходе воздуха менее 100 л/мин не обеспечивает достаточную степень измельчения смеси и приводит к уменьшению количества БАВ, включаемого в липосомы, а также ведет к ухудшению ФДС и соответственно ухудшению биодоступности БАВ для организма.
Нв фиг.1 приведена микрофотография сухого липосомального интерлейкина - 2 при увеличении ×2000.
На фиг.2 приведена микрофотография регидратированного липосомального препарата интерлейкина - 2 при увеличении ×10000.
Липосомальные препараты, полученные по каждому из предлагаемых вариантов, как показала экспериментальная проверка, обладают повышенной биологической активностью, которая сохраняется в препарате длительное время (до 1 года).
Сущность и преимущества заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.
ПРИМЕР 1. Приготовление липосомального интерферона-альфа 2b (ИФН-альфа 2b).
В загрузочный бункер струйной мельницы засыпали 10 г полиглюкина и 1,0 г сухого порошкообразного фосфолипида витол. Помол осуществляли потоком осушенного и фильтрованного сжатого воздуха под давлением 2,5±0,1 атм и расходе газа 234 л/мин.
В результате получали 10 г сухого липосомального препарата с диаметром частиц менее 40 мкм. Полученный порошок дисперговали в 10 мл воды, нагретой до (38±2)°С и растворяли в ней 2,5 мг рекомбинантного ИФН-альфа 2b с активностью 200×106 ME/мг. Полученную суспензию липосом, в которые включается ИФН-альфа 2b озвучивали ультазвуком на частоте 40 кГц в течение 1 минуты, а затем подвергали лиофильному высушиванию. В результате получали сухой липосомальный препарат с концентрацией ИНФ-альфа 2b 250 мкг/г и активностью 50×106 МЕ/г.
С помощью метода гельфильтрации разделяли препарат на липосомальную и нелипосомальную фракции, в которых определяли содержание ИФН-альфа 2 методом ИФА. Результаты исследования показали, что с липосомами связано около 45% ИФН-альфа 2, использовавшегося для приготовления препарата.
ПРИМЕР 2. Приготовление липосомальной супероксиддисмутазы (СОД). В загрузочную емкость струйной мельницы помещали 20,0 г порошкообразного сорбита, 2,0 г сухих фосфолипидов лецитина ПРО и 0,01 г лиофилизированной СОД.
Помол осуществляют струйным потоком сжатого воздуха под давлением 2,5±0,1 атм и расходе газа 100 л/мин.
В результате получили 20,0 г сухого высокодисперсного порошка белого цвета с диаметром частиц менее 30 мкм, содержащего СОД в концентрации 500 мкг/г. Полученный сухой липосомальный препарат СОД характеризовался равномерным распределением СОД по всему объему порошка. Результаты спектрофотометрического исследования содержания СОД в навесках, взятых на разных уровнях объема препарата, показали 500±10 мкг/г. Результаты исследований показали, что с липосомами связано 42% СОД.
После растворения порошка в 50 мл нагретой до (38±2)°С воды образуется устойчивая в течение по крайней мере шести недель высокодисперсная суспензия липосом с включенной в них СОД.
ПРИМЕР 3. Приготовление липосомального интерлейкина-2 (ИЛ-2).
В емкость помещали 5,0 г полиглюкина, 0,5 г сухого гранулированного фосфолипида лецитин ПРО и содержимое 1 ампулы с лиофилизированным рекомбинантным ИЛ-2 (Proleukin, 18×106 ME/ампула), тщательно перемешивали и помещали в герметически закрытый бункер струйной мельницы. Помол осуществляли струйным потоком осушенного и фильтрованного сжатого воздуха под давлением 3,5±0,1 атм и расходе газа 235 л/мин. В результате получили 5,0 г сухого высоко дисперсного порошка белого цвета с диаметром частиц менее 40 мкм, содержащего 3,6×106 МБ ИЛ-2/г. Результаты исследования показали, что с липосомами связано 33% ИЛ-2, используемого для приготовления препарата.
ПРИМЕР 4. Приготовление липосомального интерлейкина-1 бета (ИЛ-1 бета).
В загрузочный бункер мельницы помещали 20,0 г полиглюкина и 2,0 г сухого гранулированного фосфолипида витол. Помол осуществляли потоком осушенного и фильтрованного сжатого воздуха под давлением 3,5±0,1 атм и расходе газа 204 л/мин. В результате получили 20 г сухого порошка белого цвета с диаметром частиц менее 50 мкм.
Полученный порошок диспергировали в 50 мл воды, нагретой до температуры (38±2)°С, в которой было предварительно растворено 400 мкг рекомбинантного ИЛ-1 бета с активностью 100×106 ME/мг и подвергали обработке ультразвуком на частоте 40 кГц в течение 1,5 минут. При этом образовалась суспензия высокодисперсных липосом с включенным в них ИЛ-1 бета. Полученную суспензию липосом подвергли затем лиофильному высушиванию, в результате чего был получен сухой липосомальный препарат ИЛ-1 бета с концентрацией последнего 20 мкг/г (2×10 6 ME/г). Результаты исследований показали, что с липосомами связано 37% ИЛ-1 бета, используемого для приготовления препарата
ПРИМЕР 5. Изучение влияния природы ингредиентов и их соотношения на включение БАВ в липосомы на примере интерферона-альфа 2b.
В условиях примера 1 получали липосомальные препараты на основе использования различных наполнителей и фосфолипидов. Полученные результаты приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| Влияние природы ингредиентов на фракционно-дисперсный состав липосом интерферона-альфа 2b | |||||
| Рецептура | Характеристика препарата | ||||
| Фосфолипид (ФЛ) | Наполнитель (НП) | Соотношение ФЛ:НП | % частиц менее 5 мкм | % частиц 6-10 мкм | Масс-медианный диаметр частиц, мкм |
| Лецитин ПРО | Хлорид натрия | 1:5 | 0 | 14 | 70 |
| Лецитин ПРО | Глицин | 1:5 | 2,5 | 20 | 60 |
| Лецитин ПРО | Полиглюкин | 1:5 | 8,5 | 20,5 | 57 |
| Лецитин ПРО | Полиглюкин | 1:10 | 13 | 25,5 | 51 |
| Витол | Полиглюкин | 1:10 | 14 | 32 | 52 |
| Витол | Хлорид натрия | 1:10 | 15,5 | 20 | 56 |
| Витол | Глицин | 1:10 | 13 | 35 | 57 |
Как следует из таблицы 1 для получения высокодисперсных липосом интерферона-альфа 2b (с высоким содержанием частиц менее 10 мкм), лучшие результаты достигаются при использовании в качестве фосфолипидов витола. Повышение содержания наполнителя в рецептуре способствует повышению дисперсности препарата.
ПРИМЕР 5. Влияние ультразвуковой обработки на размер частиц липосомального препарата.
В условиях примера 4 проводились исследования на влияние ультразвуковой обработки при частоте 40 кГц на фракционно-дисперсный состав липосомального интерферона-альфа 2b. Полученные результаты приведены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Влияние озвучивания суспензий на дисперсность липосомальных частиц интерферона-альфа 2b | ||||
| Обработка ультразвуком | Композиция | % по числу частиц диаметром менее - 5 мкм | % по числу частиц диаметром 6-10 мкм | Масс-медианный диаметр, мкм |
| Лецитин ПРО+ полиглюкин (1:10) | 13 | 25.5 | 51 | |
| 40 кГц 55 сек | Лецитин ПРО+ полиглюкин (1:10) | 61 | 29 | 23 |
| - | Витол + полиглюкин (1:10) | 14 | 32 | 52 |
| 40 кГц 70 сек | Витол + полиглюкин (1:10) | 75 | 24.5 | 6 |
Полученные результаты показали, что при использовании заявляемого способа удается получить высокодисперсные липосомальные препараты с большим содержанием БАВ по более простой и экологичной технологии.
1. Способ получения сухих липосомальных препаратов, включающий в себя смешение фосфолипидов, порошкообразного носителя и биологически активного вещества и дальнейшую обработку полученной смеси, отличающийся тем, что в загрузочный бункер струйной мельницы засыпают композицию, состоящую из биологически активного вещества, фосфолипида из группы, включающей витол и лецитин ПРО, и водорастворимого порошкообразного носителя и подвергают помолу в струйной мельнице при давлении не менее 2,5 атм и расходе газа не менее 100 л/мин с дальнейшим выделением фракции с размером частиц, меньшим чем 50 мкм.
2. Способ получения сухих липосомальных препаратов, включающий в себя смешение фосфолипидов и порошкообразного носителя и дальнейшую обработку полученной смеси, отличающийся тем, что в загрузочный бункер струйной мельницы засыпают композицию, состоящую из фосфолипида из группы, включающей витол и лецитин ПРО, и водорастворимого порошкообразного наполнителя и подвергают помолу в струйной мельнице при давлении не менее 2,5 атм. и расходе газа не менее 100 л/мин с дальнейшим выделением фракции с размером частиц, меньшим чем 50 мкм, затем добавляют к ней раствор биологически активного вещества в полярном растворителе, перемешивают и подвергают лиофильному высушиванию.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что суспензию фосфолипидов, порошкообразного носителя и биологически активного вещества в полярном растворителе перед сушкой подвергают обработке ультразвуком на частоте 40 кГц.
