Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью



Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью
Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью
Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью
Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью
Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью
Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью
Способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью

 


Владельцы патента RU 2437934:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения фракции из клеток Escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью, предусматривает консервирование клеток бактерий в присутствии забуференного 80-90% глицерина, обработку 3% тритоном X-100 с целью снятия клеточной оболочки. Полученные цитоплазматические белки экстрагируют возрастающими концентрациями солей, а именно 0,14 М, 0,35 M, 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом. Осуществляют аффинную хроматографию на сефарозе 4В с иммобилизованным трипсином и оценивают ингибирующую протеазы активность в элюатах. Изобретение может быть использовано при анализе молекулярно-генетических механизмов формирования структуры клетки прокариот и роли белковых компонентов в их организации, а также особенностей ремоделирования генома, что является необходимым для раскрытия путей регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также поиска новых мишеней для лекарственных средств и разработки экологически безопасных новых лечебных препаратов. 3 табл., 4 ил.

 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии прокариотической клетки и может быть применено к анализу молекулярно-генетических механизмов формирования структуры клетки прокариот и роли белковых компонентов в их организации, а также особенностей ремоделирования генома, что является необходимым для раскрытия путей регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также поиску новых мишеней для лекарственных средств и разработке экологически безопасных лечебных препаратов.

Известен способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью [1], котором был описан способ получения фракций из клеточных ядер соматических клеток растений. Недостаток этого метода заключается в том, что получение надмолекулярно-генетических структур осуществляется из клеточных ядер растений, а не из безъядерной прокариотической клетки, оболочка которой не может быть снята 0,5% тритоном Х-100.

Вышеуказанный способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью, был принят за основу, в котором первоначально производят консервацию растительных тканей в забуференном 80-90% глицерине с последующей трехступенчатой гомогенизацией в забуференной 20% глицериновой среде, низкоскоростное центрифугирование растительного гомогената и очистку ядер через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 масса/объем) забуференный глицериновый градиент с последующей очисткой ядер буфером, содержащем 0,5% тритона Х-100 с последующей экстракцией ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия, 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом и 0,5 н. раствором гидроксида натрия при сопутствующей аффинной хроматографии вышеперечисленных ядерных фракций на сефарозе 4В с иммобилизованным трипсином либо ингибитором трипсина.

Недостатком этого способа является то, что трехступенчатая гомогенизация неприемлема для клеток прокариот, т.к. культура уже состоит из отдельных клеток не объединенных в ткань, 0.5% тритон Х-100 не снимает клеточную оболочку прокариотической клетки, экстракция фракций 0,5 н. гидроксидом натрия невозможна, т.к. клеточный остаток целиком растворяется в 6 М гуанидин гидрохлориде с 0,1% β-меркаптоэтанолом.

Целью изобретения является расширение спектра сравнительных методов, позволяющих получать фракции из клеток различных уровней организации.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения фракций из клеток Escherichia coli, обладающих протеолитической и ингибирующей протеазы активностью, у консервированных в присутствии забуференного 80-90% глицерина клеток снимают клеточную оболочку 3% тритоном Х-100, затем проводят экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом, при одновременной на двух колонках аффинной хроматографией на сефарозе 4В с иммобилизованным ингибитором трипсином и трипсином соответственно, оценивают протеолитическую и ингибирующую протеазы активности.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Опыты проводили на протяжении жизненного цикла клеток штамма Е. coli JC-158 (Hfr PO1, thi1, serA6, lacI22, relA1) [5], предоставленного Ступак И.В. и Ступак Е.Э., выращивание культуры проводилось Тропыниной Т.С. (Институт биологии УНЦ РАН, лаборатория математической и молекулярной генетики) и штамма E.coli 5а, предоставленного Маркушевой Т.В. (Институт биологии УНЦ РАН, группа генетики микроорганизмов). В работе для выращивания использовалась богатая питательная среда LB (Луриа-Бертани). В 1 литре дистиллированной воды растворялись при помешивании (на магнитной мешалке типа MM 2A): бакто-триптон (Difco, США) - 10 г; дрожжевой экстракт (Difco, США) 5 г; NaCl 10 г, рН до 7,5. Среда стерилизовалась при 120-123°С, при давлении пара 1 атм в стандартном автоклаве.

Бактериальные клетки, использованные в эксперименте, первоначально находились в агаризованных столбиках LB (на 1 литр среды 1,5 г агар-агара, Difco, США) и хранились при температуре 4°С.При такой температуре и практически полном отсутствии кислорода происходит замедление всех физиологических процессов в клетках. Для того чтобы перевести клетки в "нормальное физиологическое состояние", а именно аэробное дыхание, бактериальную культуру из агаризованного столбика в стерильных условиях переносили с помощью бактериологической петли в жидкую среду LB в объеме 5 мл, находящуюся в химической пробирке объемом 20 мл, закрывали ватно-марлевой пробкой и инкубировали при 37°С, 160 об/мин на лабораторном термостатируемом встряхивателе (П5.10-Э5960) в течение 16 часов. Отдельно выросшая хорошо сформировавшаяся колония бактерий с агаризованной среды LB пересевалась с помощью бактериологической петли в жидкую среду LB в объеме 5 мл и инкубировалась при 37°С, 160 об/мин 7 часов. Затем 100 мкл подросшей культуры клеток пересевались в свежую жидкую среду LB в объеме 5 мл и инкубировались при 37°С, 160 об/мин 16 часов. 2 мл культуры клеток вносились в кювету с рабочей длиной 5,075 мм, и измерялась оптическая плотность на колориметре фотоэлектрическом концентрационном (КФК-2) при длине волны 590 нм. Это значение составляло 1,0. В свежую жидкую среду LB в объеме 120 мл в 500 мл колбе высевались 120 мкл 16-часовой культуры и проводилось инкубирование при 37°С, 160 об/мин в течение 7 часов 10 минут.

Первая проба была взята через 50 минут после начала инкубирования. Оптическая плотность первой пробы составляла 0,005. Для дальнейшего анализа отбирались образцы в объеме 1,5 мл. Клетки осаждались центрифугированием при 12000 об/мин на центрифуге Эппендорф в течение 5 мин. Надосадочная жидкость удалялась, осадки подсушивались. К осадкам добавлялось по 50 мкл среды следующего состава: 80-90% глицерин на 0,01 М трис-HCl буфере, рН 6.8, с добавлением 0.005 М MgCl2; 0.025 М КСl; 0.003 М CaCl2; 0.005 М NaCl для консервации клеток при минус 25°С. Последующие пробы отбирались через каждые 20 минут в течение 7 часов 10 минут.

Далее осадки клеток промывали 3% тритоном Х-100 в среде следующего состава: 0.02М триэтаноламин (ТЭА)·HCl, рН 6.8; 0.005 М MgCl2; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl2; 0.005 М NaCl, рН 6,8; встряхивали в течение 30 мин на микрошейкере (Micro-shaker type 326 m, Польша), с последующим центрифугированием при 4000 об/мин (К-23, ГДР) в течение 20 мин для снятия клеточной оболочки, после чего осадок дважды промывали в среде следующего состава: 0.005 М MgCl2; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl2; 0.005 М NaCl; 0,01 М трис-HCl, рН 6.8, с последующим центрифугированием при вышеуказанных условиях. Более низкие концентрации тритона Х-100 не снимали оболочки клеток Е. coli.

Цитоплазматические белки экстрагировали 0,14 М NaCl, 0.01 М трис-HCl буфером, рН 6.8. Фракцию непрочносвязанную с клеточным остатком выделяли путем экстракции осадка 0,35 М NaCl, 0.01 М трис-HCl буфером, рН 6.8. Далее осадок фракционировали суспендированием в трис-HCl буфере с 2 М NaCl. В осадке оставалась фракция, содержащая клеточный остаток с клеточной оболочкой. Последующую экстракцию проводили 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом на трис-HCl буфере. В вышеуказанном буфере осадок растворялся полностью, поэтому экстракцию 0,5 н. NaOH не проводили. Клеточные фракции хранили при -196°С в азоте.

Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [1,3]. Метод использовался в случае микронаноколичественного определения белка.

Аффинную хроматографию проводили на двух колонках (0,5x4 см) с иммобилизованным трипсином («СПОФА», ЧССР) и ингибитором трипсина соответственно, ковалентно присоединенных к CNBr-активированной агарозе (Институт химии АН Эстонии) [1]. Гель содержал 0,1 мкмоль присоединенного трипсина («Спофа», Чехословакия) и ингибитора трипсина соответственно. Уравновешивание колонок для связывания трипсина и ингибитора проводили с помощью 0.05 М трис-HCl, рН 8.0 (из буфера был исключен СаСl2 вследствие того, что при последующих реакциях по определению протеолитической и ингибиторной активностей он давал осадочную реакцию). Связавшийся белок элюировали 0.1 н. Na-ацетатным буфером, рН 3.0. Работу колонок с иммобилизованным трипсином или ингибитором трипсина проверяли пропусканием через них чистого сывороточного альбумина (Реахим), а также альбумина с добавлением ингибитора трипсина или просто трипсина (по 10 мкг соответственно). Колонки не связывали чистый сывороточный альбумин, а из смеси альбумин-трипсин или альбумин-ингибитор трипсина идентифицировали трипсин (колонка с иммобилизованным ингибитором трипсина) или ингибитор трипсина (колонка с иммобилизованным трипсином). Полученные фракции наносились на обе колонки одновременно, чтобы сохранить физиологический статус фракции, и результаты эксперимента были корректными.

Протеолитическую активность протеаз определяли по расщеплению низкомолекулярного белка протамина («Calbiochem», США) [1]. Количество освободившегося аргинина рассчитывали, пользуясь калибровочным графиком. В качестве стандарта использовали D,L-аргинин («Reanal», Венгрия), Активность протеаз и их ингибиторов выражали в нмоль аргинина на 1 мг/с.

Анализ полноты выделения клеточных фракций (табл.1) и фракций, полученных после аффинной хроматографии (табл.3), показал, что все фракции представляют собой не чистый белок, а комплексы нуклеиновых кислот, белка и гексоз. Для определения ДНК и РНК использовали метод А.С.Спирина [4]. Для определения содержания гексоз использовали метод [2].

На фиг.1 представлена кривая роста штамма Е.coli JC-158. На оси ординат показана оптическая плотность периодической культуры. На оси абсцисс показан возраст периодической культуры в мин, измеряемый в течение 7 часов 10 минут в растущей культуре клеток.

На фиг.2 представлена полнота выделения белкового компонента в надмолекулярно-генетических структурах клеток Е.coli JC-158. На оси ординат показан процент выхода белка, на оси абсцисс - возраст культуры.

Эффективность последовательной ступенчатой экстракции протеаз и ингибиторов трипсина из клеток Е.coli JC-158 показана на фиг.3. На оси ординат (фиг.3) показана активность протеаз (1) и ингибиторов трипсина (2) выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс указан возраст культуры в мин (от 50 до 430 мин). Использованы следующие обозначения: Цп - цитоплазма; Фр-I - фракция непрочносвязанная с клеточным остатком (35 М NaCl); Фр-II - фракция прочносвязанная с клеточным остатком (2 М NaCl); Ко - клеточный остаток с клеточной оболочкой;

На фиг.4 показана последующая идентификация фракций, полученных из клеток Е.coli JC-158, на колонках либо с иммобилизованным ингибитором трипсина либо с трипсином. На оси ординат показано содержание протеолитических и ингибиторных надмолекулярно-генетических комплексов в расчете на 1 клетку (пг). На оси абсцисс указан возраст культуры в мин (от 50 до 430 мин). Использованы следующие обозначения: 1 - протеолитический комплекс; 2 - ингибиторный комплекс.

Исследование фракций, обладающих протеолитической и ингибиторной активностью, включает предварительную консервацию клеток в глицериновой среде, снятие клеточной оболочки и выделение из них клеточных фракций возрастающими концентрациями солей. Табл.1 показывает, что структура клеток (штамма Е. coli 5 а) не нарушена и иллюстрирует полноту выделения клеточных фракций. Табл.2 и 3 иллюстрируют компонентный состав аффинновыделенных протеолитических (табл.2) и ингибиторных (табл.3) комплексов в течение роста клеток штамма Е. coli 5a в периодической культуре.

Предложенный способ рекомендуется в исследовании молекулярно-генетических механизмов формирования прокариотической структуры клетки и роли белковых компонентов в их организации, в частности в исследованиях Arg-X протеиназ и их ингибиторов, участвующих в ремоделировании хроматина, для построения компьютерных моделей организации прокариот. Знание биохимических процессов, происходящих на разных фазах роста популяции бактерий, позволяет раскрыть пути регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также способствует поиску новых мишеней для лекарственных средств, что дает возможность управления бактериальными сообществами, населяющими человеческий организм. Предложенный способ также рекомендуется в разработках в области нанотехнологий, а именно полиалкиленгуанидинов (ПАГ), как экологически безопасных биоцидных полимеров, широкий биоцидный спектр действия которых обусловлен наличием в повторяющихся звеньях гуанидиновых группировок, являющихся активным началом некоторых природных и синтетических лекарственных средств, и, кроме того, для понимания перспектив практического применения аргининсодержащих препаратов, применяющихся в клинике

Источники информации

1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство №1733471 //БИ 1992, №18, с.96.

2. Иванова Э.А., Вафина Г.Х., Ремеева P.Г. Способ определения углеводных компонентов в клеточных ядрах. Патент №2108571 // БИ №10, 10.04.98.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С.342.

4. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия, 1968, т.23, 35, с.656.

5. Myrphy D.B., Pembroke J.T. Transfer of the IncJ plasmid R391 to recombination deficient E.coli K12: evidence that R391 behaves as a conjugal transposon//FEMS Microbiology Letters, 1995, V.134, P.153-158.

Способ получения фракции из клеток Escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью, включающий консервацию клеток в присутствии забуференного 80-90% глицерина с последующим снятием клеточных оболочек 3% тритоном Х-100, экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом, аффинную хроматографию на сефарозе 4 В с иммобилизованным трипсином и последующей оценкой в элюатах ингибирующей протеазы активности.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к микробиологическому синтезу веществ с использованием иммобилизованных бактериальных клеток, и может быть использовано для ферментативного получения натурального сахарозаменителя изомальтулозы.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается штамма-продуцента бактериородопсина. .
Изобретение относится к технологии производства диагностического препарата, необходимого для здравоохранения и ветеринарии при оценке напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностики инфекции у лиц, привлекаемых к работам с возбудителем сибирской язвы.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению протеолитических фракций из прокариотических клеток, и может быть использовано при анализе молекулярно-генетических механизмов формирования структуры клетки прокариот и роли белковых компонентов в их организации, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения внутреннего стандарта в аналитике, в исследованиях обмена веществ при проведении опытов по откармливанию животных, в метаболических исследованиях, при изучении цикла обмена веществ, путей и/или периодов распада, а также интеркаляций.

Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается питательной среды для производства копропорфирина III. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения IgAl-протеазы из N. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биомедицинской промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Sphingobacterium Mizutae-32, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, названную SpmI, которая узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5'-AT'CGAT-3'.

Изобретение относится к области биологии и, более конкретно, к области клинической биохимии. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных ферментных препаратов, и может быть использовано в медицине при терапии ожоговых и инфицированных ран, в парфюмерной промышленности, а также в научно-исследовательской работе, например, для определения структуры коллагенов.
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в мясной промышленности для гидролиза и модифицирования коллагенсодержащего сырья. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новую сериновую протеазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа
Наверх