Способ получения препарата фолликулостимулирующего гормона из аденогипофизов животных

Изобретение относится к ветеринарии. Способ получения препарата фолликулостимулирующего гормона из аденогипофизов животных включает гомогенизацию, экстракцию, осаждение балластных белков, выделение и концентрацию гормона, причем гомогенизацию аденогипофизов осуществляют в соотношении 1:6-1:7 в присутствии буферного раствора с рН 7,0-7,5, включающего 0,89-0,90% натрия хлорида, 3,2-3,4% сернокислого аммония, 0,1% поверхностно-активного вещества твин-80, остальное - вода, а концентрацию гормона проводят путем замораживания смеси со скоростью 5°С/ч и последующего оттаивания и отделения растворимой фазы, содержащей фолликулостимулирующий гормон. Изобретение обеспечивает повышение биологической активности полученного препарата фолликулостимулирующего гормона. 2 табл.

 

Изобретение относится к биологии, в частности к получению препаратов, используемых в животноводстве и ветеринарной медицине с целью стимуляции половой функции, а также при эндокринных нарушениях у самок сельскохозяйственных животных.

Известен способ получения препарата ФСГ из гипофизов лошадей ((W.E.Braselton, W.H. Mc Shan. Rurification and properties of folliclestimulating and luteinzing hormones from horse pituitary glands. - Arch. Biochem., 1970. v.139. - P.45), который включает измельчение гипофиза, экстракцию этанолом, диализацию против хлорида натрия, осаждение метафосфорной кислотой, центрифугирование, гельфильтрацию на сефадексе G-100, хроматографию на карбоксиметил-сефадексе, препаративный электрофорез в полиакриламидном челе, рехроматографию и стандартизацию препарата.

Известен также способ получения препарата ФСГ (А.с. СССР №413947, А61К 17/18, 1974), который включает гомогенизацию железистой ткани, экстракцию и очистку гормона путем дифференцированного растворения его в растворах сернокислого аммония нисходящих концентраций.

Однако многоэтапность и сложность технологического процесса первого способа делает его длительным, что приводит к снижению выхода препарата. Недостатком второго способа является то, что применение для очистки гормона дифференцированного растворения в растворах сернокислого аммония разных концентраций не позволяет полностью освободиться от балластных белков, что приводит к потерям препарата и снижению его биологической активности.

В качестве протопипа выбран способ получения ФСГ, который включает гомогенизацию аденогипофизов животных, экстракцию, осаждение балластных белков и выделение гормона (Патент РФ №2062619, 1996 г.). При этом для дезагрегации клеточной ткани и более полного перехода гормона в жидкую фазу в гомогенизат добавляют сернокислый аммоний, этиловый спирт и йодид калия.

Недостатком этого способа является то, что применение с целью дезагрегации клеточной ткани сернокислого аммония, этилового спирта и йодида калия процесс дезагрегации протекает на низком уровне и определенная часть гормона не освобождается из тканей аденогипофиза, что уменьшает выход препарата.

Целью изобретения является увеличения выхода препарата с высокой биологической активностью.

Для этого получают от животных гипофизы, отделяют аденогипофизы (передняя часть гипофизов) и заливают их буферным раствором с рН 7,0-7,5 в соотношении 1:6-7 и который включает 0,89-0,90% натрия хлорида, 3,2-3,4% сернокислого аммония, 0,1% твина-80. Данную смесь гомогенизируют в течение 2-4 мин при температуре 2-4°С до получения однородной массы. После этого гомогенизат экстрагируют в течение 50-60 мин при 2-4°С и центрифугируют до расслоения жидкости с образованием плотного осадка, после чего добавляют сернокислый аммоний до 35-40% от насыщения и вновь центрифугируют. Выделение гормона осуществляют путем ультрафильтрации под давлением и очистки методом ионообменной хроматографии с последующей очисткой на мембране физиологическим раствором с рН 4,2-4,5, отделением от катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0 и концентрацией.

При увеличении времени гомогенизации, экстракции и повышении температуры происходит активизация протеолитических ферментов, что повышает гидролиз пептидов, в том числе и ФСГ, который относится к гликопротеидам. В этой связи выход препарата уменьшается.

При уменьшении времени гомогенизации, экстракции и понижении температуры снижается процесс дезагрегации клеточной ткани и уменьшается выход гормона из тканей аденогипофиза в жидкую фазу.

Внесение в гомогенизат поверхностно-активного вещества твин-80 способствует разрушению клеточных мембран. В результате активизируется процесс солюбилизации - самопроизвольного перехода нерастворимых в воде веществ в разведенный раствор с образованием термически устойчивой системы. В результате происходит более полный выход гормона из тканей аденогипофиза в жидкую фазу.

С целью освобождения смеси от балластных веществ проводят центрифугирование до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. В надосадочную жидкость (фугат) для осаждения сопутствующих белков и других гормонов гипофиза вносят сернокислый аммоний до 35-40% от насыщения и вновь центрифугируют до образования плотного осадка. Полученный фугат с целью освобождения от сернокислого аммония и концентрирования гормона подвергают ультрафильтрации на мембране УАП-200 под давлением. Затем сконцентрированный гормон очищают методом ионообменной хроматографии. Для этого катионит КУ-2 перемешивают со сконцентрированным раствором гормона в течение 50-60 минут до полного их связывания, переносят на мембрану и отмывают от балластных белков физиологическим раствором с рН 4,2 до тех пор, пока в промывной жидкости не будет содержаться белка, наличие которого контролируют спектрофотометрически. Данная среда является оптимальной для связывания катионита с гормоном. При смещении рН в сторону увеличения или уменьшения взаимодействия гормона с катионитом не происходит. Отделяют гормон от катионита буферным раствором рН 8,5-9,0, что позволяет получить наиболее полный выход гормонального препарата.

После отделения смесь подвергают концентрации. С этой целью ее помещают в сосуд, переносят в рефрижератор и подвергают постепенному замораживанию со скоростью 5°С/ч. По мере замораживания растворимая фаза, содержащая ФСГ, скапливается в нижней части сосуда, и ее отделяют после оттаивания раствора.

Полученный препарат представляет сосбой прозрачную жидкость с желтоватым оттенком, без запаха и примесей.

Пример 1. У крупного рогатого скота в условиях мясокомбината отбирали гипофизы, отделяли аденогипофизы и замораживали в жидком азоте. К 100 г замороженных аденогипофизов приливали 700 мл буферного раствора с рН 7,0 и содержащего 6,3 г натрия хлорида, 23,8 г сернокислого аммония, 0,7 мл твин-80, и гомогенизировали в течение 3 мин при температуре 2-4°С до получения однородной массы. Затем гомогенизат экстрагировали в течение 60 мин при температуре 2-4°С. После этого гомогенизат экстрагировали в течение 60 минут при температуре 2-4°С. После этого грубую взвесь тканей осаждали центрифугированием при температуре 2-4°С до расслоения жидкости с образованием плотного осадка. В полученный фугат, для освобождения от сопутствующих белков и других гормонов гипофиза, вносили сернокислый аммоний до 40% от насыщения и вновь центрифугировали в том же режиме. Полученный фугат, с целью освобождения от сернокислого аммония и концентрирования гормона, подвергали ультрафильтрации на мембране УАП-200 под давлением. Сконцентрированный гормон очищали методом ионообменной хроматографии на катионите КУ-2. Для этого катионит предварительно обрабатывали в небольшом количестве физиологического раствора с рН 4,2 и затем прибавляли к нему сконцентрированный раствор гормона. Смесь перемешивали в течение 60 минут до полного связывания с катионитом. После этого катионит со связанным гормоном переносили на мембрану и отмывали от балластных белков физиологическим раствором с рН 4,2, до тех пор пока в промывной жидкости белок не обнаруживался. Отделяли гормон от катионита буферным раствором с рН 8,5-9,0.

После отделения смесь концентрировали. Для этого помещали в сосуд, переносили в рефрижератор и подвергали постепенному замораживанию со скоростью 5°С/ч. По мере замораживания растворимая фаза, содержащая фолликулостимулирующий гормон, скапливалась в нижний части сосуда и ее отделяли после оттаивания раствора. В результате получали концентрированный препарат в объеме 350 мл, без запаха и примесей.

Стандартизация полученного препарата в соответствии с препаратом ФСГ-п фирмы Scherinq Corporation (США) показала, что его биологическая активность составляла в 1 мл 50-60 ME (2,5-3,0 Armour Standard).

Проверку препарата на токсичность проводили на белых мышах и морских свинках. После внутрибрюшинного введения изготовленного препарата явлений токсикоза и падежа среди лабораторных животных не наблюдалось.

Расфасовывали препарат в стеклянные флаконы по 50 мл, закрывали резиновыми и обкатывали алюминиевыми колпачками. Хранят препарат при температуре 2-5°С, срок годности 24 мес.

Пример 2. Производственную апробацию изготовленного препарата проводили в условиях учебно-опытного хозяйства Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И.Иванова. Препарат использовали с целью получения эмбрионов для их трансплантации у коров. Было сформировано три группы клинически здоровых коров-аналогов черно-пестрой породы по 10 голов в каждой. Первую группу стимулировали изготовленным препаратом ФСГ, вторую группу - препаратом ФСГ-п фирмы Scherinq Corporation, третью группу - препаратом-прототипом.

Стимуляцию коров всех групп препаратами начинали с 8 дня полового цикла по 5-дневной схеме в сочетании с простагландиновым препаратом эстрофаном (500 мкг). На 13-14 день полового цикла у стимулированных коров выявляли половую охоту быком-пробником и проводили искусственное осеменение. На 20 день полового цикла осуществляли нехирургическое извлечение эмбрионов и проводили их оценку.

Стимуляцию коров всех групп препаратами начинали с 9 дня полового цикла. С этой целью каждому животному внутримышечно вводили по 120 ME препарата два раза в сутки с интервалом через 12 часов. На третьи сутки после начала введения вместе с препаратами ФСГ вводили простагландиновый препарат эстрофан (500 мкг). Через 2 дня после введения эстрофана у коров выявляли половую охоту с использованием быка-пробника и при ее наличии проводили искусственное осеменение согласно инструкции. На 20 день полового цикла осуществляли нехирургическое извлечение эмбрионов и проводили их оценку.

Результаты исследований показали, что изготовленный препарат ФСГ по своей биологической активности не уступает препарату ФСГ-п и превосходит препарат-прототип (таблица 1).

Таблица 1
Стимуляция половой функции у коров препаратами ФСГ
Показатели Используемые препараты
Опытный препарат ФСГ-п Препарат-прототип
Стимулировано коров 16 16 16
Проявилась супер-овуляция у коров 14 (87,5%) 14 (87,5%) 13 (81,2%)
Количество эмбрионов на донора 7,5±0,17* 7,8±0,24* 6,5±0,14
в том числе:
- полноценных 5,5±0,20* 6,0±0,21* 4,0±0,18
- дегенеративных 1,0±0,01 1,0±0,01 1,5±0,02
Примечание: * - при Р<0,05 по сравнению с препаратом-прототипом

Пример 3. В условиях свиноводческого комплекса «Магнитный» Курской области изготовленный препарат ФСГ использовали для стимуляции половой охоты у свиноматок-первопоросок после отъема поросят. Было отобрано три группы свиноматок крупной белой породы по 15 голов в каждой. Свиноматки первой опытной группы подвергались обработке изготовленным препаратом ФСГ, который вводили через 24 часа после отъема поросят внутримышечно в дозе 200 ME /гол. Свиноматок второй опытной группы стимулировали препаратом-прототипом по той же схеме, что и животных первой опытной группы. Свиноматкам третьей контрольной группы вместо препаратов вводили стерильную дистиллированную воду.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2, из которой следует, что после применения изготовленного препарата половая охота у свиноматок наступала раньше и синхронно по сравнению с препаратом-прототипом.

Таблица 2
Проявление половой охоты у свиноматок-первоопоросок после отъема поросят, подвергавшихся стимуляции препаратами ФСГ
Группа Выявлена половая охота у свиноматок после отъема поросят в течение суток
1-5 6-10 11-15 16-20 Всего
1 (предложенный препарат) 6 9 - - 15
2 (препарат-прототип) 4 4 5 - 13
3 (контрольная) - 3 3 3 9

Таким образом предлагаемый способ получения препарата ФСГ из аденогипофизов животных позволяет получить препарат с высокой биологической активностью и не вызывающий побочных действий.

Способ получения препарата фолликулостимулирующего гормона из аденогипофизов животных, включающий гомогенизацию, экстракцию, осаждение балластных белков, выделение и концентрацию гормона, отличающийся тем, что гомогенизацию осуществляют в соотношении 1:6-1:7 в присутствии буферного раствора с рН 7,0-7,5, включающего 0,89-0,90% натрия хлорида, 3,2-3,4% сернокислого аммония, 0,1% поверхностно-активного вещества твин-80, остальное - вода, а концентрацию гормона проводят путем замораживания смеси со скоростью 5°С/ч и последующего оттаивания и отделения растворимой фазы, содержащей фолликулостимулирующий гормон.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области ветеринарной гинекологии. .

Изобретение относится к области женской сексуальной дисфункции. .
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается конкретно лекарственного средства для женщин, обладающего противозачаточным и защитным от инфекционных заболеваний действием: герпесе, ВИЧ инфекции, вирусных заболеваниях.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается конкретно лекарственного средства для женщин, обладающего противозачаточным и защитным от инфекционных заболеваний действием: герпесе, ВИЧ инфекции, вирусных заболеваниях.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для разработки способов коррекции эндотелиальной дисфункции у беременных.

Изобретение относится к усилителю тестостерона, к лекарственному препарату, который предотвращает, ослабляет и/или лечит симптомы или заболевания, вызванные недостатком тестостерона, и к добавке для лечения климактерического расстройства у мужчин.

Изобретение относится к новым циклогексиламиновым производным, имеющим структуру, соответствующую формуле (I),обладающим свойствами ингибитора активности по меньшей мере одного транспортера моноамина, такого как транспортер серотонина, транспортер допамина или транспортер норэпинефрина, или комбинации двух или более транспортеров.
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии и андрологии, и может быть использовано для лечения аутоиммунного мужского бесплодия. .
Изобретение относится к ветеринарии. .

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству для стимуляции синтеза гликогена в сердечной мышце. .

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам на основе пептидов для лечения заболеваний предстательной железы. .
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается лечения заболеваний щитовидной железы, сопровождаемых гипотиреозом. .

Изобретение относится к биологии и медицине. .
Изобретение относится к медицине, в частности к урологии и эндокринологии, и может быть использовано при лечении доброкачественной гиперплазии предстательной железы и эректильной дисфункции у мужчин.

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, рефлексотерапии. .

Изобретение относится к медицине, в том числе к клинической эндокринологии, и может быть использовано у больных с неэндокринными заболеваниями при лечении синтетическими глюкокортикостероидами (ГКС)

Изобретение относится к ветеринарии

Наверх