Способ получения сетчатого полимерного сорбента для селективной сорбции эндотоксина из плазмы крови

Настоящее изобретение относится к получению сетчатого полимерного сорбента для селективной сорбции эндотоксина. Описан способ получения сетчатого полимерного сорбента для селективной сорбции эндотоксина из плазмы крови, включающий радикальную сополимеризацию функционального мономера и сшивающего агента в присутствии инициатора динитрила-2-азо-бис-изомасляной кислоты, отличающийся тем, что в качестве функционального мономера используют диметиламиноэтилметакрилат, а в качестве сшивающего агента - диметакрилат этиленгликоля и сополимеризацию проводят при нагревании до 70°С в инертной атмосфере в этаноле, глицерине или смеси вода-этанол при концентрации сомономеров в растворе 50 мас.% и соотношении функциональный мономер : сшиватель 30-70:70-30 мол.%. Технический результат - получение сетчатого полимерного плазмосорбента, обладающего высокой селективностью сорбции эндотоксина из плазмы крови, а также механической прочностью. 1 табл.

 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а конкретно к получению сетчатых полимеров, обладающих высокой селективностью сорбции к целевым молекулам-мишеням биологически активных веществ (БАВ).

Лечение сепсиса является одной из наиболее важных проблем современной клинической медицины. В последние годы из плазмы крови был выделен и молекулярно идентифицирован основной токсический агент, вызывающий заболевание сепсисом. Этим агентом является эндотоксин - липополисахарид (ЛПС), постоянный структурный компонент наружной клеточной стенки грамотрицательных бактерий. В настоящее время считается, что воздействие на эндотоксин и его скорейшее выведение из организма являются важнейшими задачами при лечении сепсиса.

Известен способ синтеза аффинных сорбентов для сорбции ЛПС (Z.Wei, W.Huang, J.Li, G.Hou, J.Fang, Zh.Yuan. Studies on Endotoxin removal mechanism of adsorbents with amino acid ligands // Journal of Chromatography B, 2007. V.858. №2. P.288-292.), согласно которому были синтезированы сорбенты на основе агарозы с различными ковалентно присоединенными аминокислотными лигандами. Для этого 2 г Твина-80 в качестве диспергирующего агента растворяли в растворе толуола при 75°C в течение 1 часа. Агарозные зерна охлаждали до комнатной температуры, фракционировали на ситах до размера зерен 20-40 мкм и промывали дистиллированной водой. Затем 1 г агарозных зерен обрабатывали раствором, содержащим 2 мл эпихлоргидрина и 3 мл 1,25 М раствора NaOH, встряхивали при 40°C в течение 2 часов и промывали дистиллированной водой. Обработанные зерна суспендировали в 4 мл 0,4 М раствора гексаметилендиамина, встряхивали при 60°C в течение 2 часов и промывали дистиллированной водой. В результате были синтезированы аминоалкилагарозные зерна сорбентов. Для дальнейшей модификации сорбента 1 г аминоалкилагарозных зерен инкубировали в смеси 1 мл эпихлоргидрина и 5 мл 0,02 М NaOH при 40°C в течение 6 часов и промывали дистиллированной водой. Далее зерна суспендировали в 15 мл раствора, содержащего 0,1 г соответствующей аминокислоты, и доводили до pH 12 2М раствором NaOH. Зерна встряхивали при 60°C в течение 2 часов и промывали дистиллированной водой. В качестве лигандов использовали 10 различных аминокислот: L-серин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-аспаргиновая кислота, глицин, L-гистидин, L-глютаминовая кислота, L-глютамин, L-аспаргин и L-триптофан.

Существенными и очевидными недостатками описанного способа являются многостадийность, длительность и дороговизна процесса синтеза, использование большого количества органических реагентов, а также гидролитическая неустойчивость ковалентной связи лигандов с матрицей сорбента.

Наиболее близким является способ синтеза неаффинного сетчатого полимерного сорбента на основе функционального мономера N,N-диметиламинопропилакриламида (ДМАПАА) и сшивающего агента N-аллилакриламида (AAA) для селективной сорбции эндотоксина (Ch.Hirayama, М.Sakata, Ya.Yugawa, H.Ihara. Cross-linked N,N-dimethylaminopropylacrylamide spherical particles for selective removal of endotoxin // Journal of Chromatography A. 1994. V.676. №2. P.267-275), согласно которому мономер и сшивающий агент смешивали в соотношении ДМАПАА:AAA=10-90:90-10 мол.% при комнатной температуре в растворе 1-гексанола в присутствии инициатора (2 мас.%) азобисизобутиронитрила. Далее в раствор сомономеров при перемешивании вводили водный 25%-ный раствор ангидросульфата натрия с 1%-ной карбоксиметилцеллюлозой в качестве суспендирующего агента. Суспензию нагревали при 80°C в течение 12 часов. Сферические гранулы сополимера ДМАПАА-ААА последовательно промывали водой, горячей водой, метанолом и этанолом. Частицы диаметром 44-105 мкм использовали для сорбции. В зависимости от концентрации сомономеров в полимеризационной смеси достигалась различная степень сшивки сополимеров.

Основным существенным недостатком прототипа является длительное температурное воздействие, в результате которого сополимеры акриламидов подвергались гидролизу с образованием амфолитов. Это понижает его анионообменную сорбционную емкость. Кроме того, гидрофильные свойства сополимеров DAA снижают вклад гидрофобного связывания в селективность сорбции эндотоксина. Также необходимо отметить, что наиболее эффективная сорбция эндотоксина наблюдалась на сетчатых сополимерах, синтезированных при соотношениях ДМАПАА:AAA, равных 70:30 и 90:10. Для этих сорбентов характерно сильное набухание (коэффициенты набухания (К_н) - 4,3 и 7,9 соответственно). Это приводит к значительному ухудшению протекаемости многокомпонентных биологических растворов через сорбционную колонку, увеличению сорбции примесных белковых компонентов и соответственно к понижению селективности сорбции эндотоксина синтезированными сорбентами.

Технической задачей и положительным результатом заявляемого изобретения является разработка способа синтеза нового сшитого полимерного сорбента на основе функционального мономера диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМ) и кроссагента диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ) с получением механически прочных гранул, обладающих высокой селективностью сорбции эндотоксина в препаративных плазмосорбционных процессах и не обладающих недостатками заявленного прототипа.

Указанная задача и результат в изобретении достигаются реализацией предлагаемого способа получения сетчатого полимерного плазмосорбента, при котором сополимеризуют мономер диметиламиноэтилметакрилат (ДМАЭМ) и сшивающий агент диметакрилат этиленгликоля (ДМЭГ) в растворе водно-этанольной смеси, либо этанола, либо глицерина. В качестве инициатора радикальной сополимеризации используют динитрил-2-азо-бис-изомасляной кислоты (ДАК). Полимеризацию осуществляют в течение 2 часов в инертной атмосфере азота при 70°C. Способ реализуют при соотношениях ДМАЭМ:ДМЭГ=30-70:70-30 мол.%; концентрация сомономеров в растворителе 50 мас.%. В результате синтезируются хорошо сшитые (К_{набухания}=1,1-1,4; ρ_{насыпная}=0,32-0,51 г/см³) ионогенные сетчатые полимеры.

Указанные отличительные признаки предлагаемого способа являются существенными, а предлагаемый способ получения сетчатого полимерного плазмосорбента имеет очевидные преимущества перед прототипом.

Анализ уровня техники не выявил технические решения, в которых была бы использована вся совокупность существенных признаков заявленного способа. Это свидетельствует о соответствии условиям патентоспособности: «новизна» и «изобретательский уровень».

Заявляемым способом можно получать сетчатые полимеры в виде хорошо сшитых полимерных частиц с выходом по сомономерам от 88 до 95%. Размер частиц задают фракционированием.

Существенность новизны признаков способа подтверждается следующим. При использовании в качестве растворителя водно-этанольной смеси при концентрации этанола менее 90 об.% происходит частичный гидролиз ДМАЭМ с образованием карбоксильных групп. Повышение концентрации этанола более 90 об.% препятствует гидролизу ДМАЭМ и способствует более полному введению сшивающего агента и суммарного выхода сорбента.

При использовании в качестве растворителя этилового спирта или глицерина мономер ДМАЭМ в ходе синтеза гидролизу не подвергается.

Содержание ДМАЭМ в полимеризационной смеси менее 30 мол.% резко понижает полную анионообменную емкость сорбента. Концентрации ДМАЭМ более 70 мол.% способствуют значительному уменьшению механической прочности сорбента.

Содержание ДМЭГ в полимеризационной смеси менее 30 мол.% приводит к образованию сильнонабухающих сорбентов, ухудшению протекания плазмы крови через сорбционную колонку и понижению гидрофобной сорбционной емкости. Увеличение ДМЭГ более 70 мол.% приводит к уменьшению анионообменной емкости сорбентов.

Полученные сополимеры не содержат определяемые известными аналитическими методами остаточные мономеры и иные низкомолекулярные примеси.

Для доказательства соответствия заявленного способа условию патентоспособности - «промышленная применимость» и для полного раскрытия сущности заявленного изобретения приводятся примеры его конкретного осуществления.

Пример 1. В полипропиленовый стакан (объем 100 мл) загружают 44,74 мл (36 г) смеси вода: этанол в массовом соотношении 9:91. Это соответствует 3,24 мл (3,24 г) воды и 41,5 мл (32,76 г) этанола. Далее добавляют 17 мл (15,7 г) ДМАЭМ и 20 мл (19,8 г) ДМЭГ, что соответствует загрузке ДМАЭМ:ДМЭГ в соотношении 50:50 мол.% и концентрации сомономеров в растворителе 50 мас.%. Инициатор ДАК вводят в реакционную массу в количестве 0,3 мас.% по отношению к массе сомономеров (0,1 г). Синтез проводят в плотно закрытом стакане в инертной среде азота, который подают в полимеризационную массу через капилляр в течение 2 минут. После продувки азотом смесь нагревают на водяной бане и выдерживают в течение 2 часов при 70°C. Полученный блок полимера выгружают из стакана, дробят и промывают от остаточных мономеров смесью горячей воды с этанолом. Вымывание остаточных мономеров контролируют спектрофотометрическим методом при λ=210 нм. Промытый полимер сушат и фракционируют до гранул размером 70-200 мкм. Полученные гранулы представляют собой хорошо сшитый полимер (К_{набухания}=1,4; ρ_{насыпная}=0,43 г/см³). Выход конечного продукта 31,2 г или 88% по сомономерам. Полученный по заявленному способу сорбент характеризуется значительной равновесной емкостью сорбции по эндотоксину (4700 ед/г).

Пример 2. В полипропиленовый стакан объемом 100 мл загружают этанол 45,5 мл (36 г). Далее в стакан добавляют 17 мл (15,7 г) ДМАЭМ и 20 мл (19,8 г) ДМЭГ, что соответствует загрузке ДМАЭМ:ДМЭГ в соотношении 50:50 мол.% и концентрации сомономеров в растворителе 50 мас.%. Инициатор ДАК вводят в полимеризационную смесь в количестве 0,3% по отношению к сумме сомономеров (0,1 г). Далее как в Примере 1. Полученные гранулы представляют собой хорошо сшитый полимер (К_{набухания}=1,1; ρ_{насыпная}=0,43 г/см³). Выход конечного продукта 32 г или 90% по сомономерам. Полученный по заявленному способу сорбент характеризуется значительной равновесной емкостью сорбции по эндотоксину (4800 ед/г).

Пример 3. В полипропиленовый стакан объемом 50 мл загружают этанол 15,2 мл (12 г). Далее в стакан добавляют 11,95 мл (10,99 г) ДМАЭМ и 5,57 мл (5,94 г) ДМЭГ, что соответствует загрузке ДМАЭМ:ДМЭГ в отношении 70:30 мол.% и концентрации сомономеров в растворителе 50 мас.%. Инициатор ДАК вводят в реакционную массу в количестве 0,3% по отношению к массе сомономеров (0,05 г). Далее как в Примере 1. Полученные гранулы представляют собой хорошо сшитый полимер (К_{набухания}=1,2; ρ_{насыпная}=0,34 г/см³). Выход конечного продукта 16,8 г или 95% по сомономерам. Полученный по заявленному способу сорбент характеризуется значительной равновесной емкостью сорбции по эндотоксину (4790 ед/г).

Пример 4. В полипропиленовый стакан объемом 100 мл загружают глицерин 28,8 мл (36 г). Далее в стакан добавляют 17 мл (15,7 г) ДМАЭМ и 20 мл (19,8 г) ДМЭГ, что соответствует загрузке ДМАЭМ:ДМЭГ в соотношении 50:50 мол.% и концентрации сомономеров в растворителе 50 мас.%. Инициатор ДАК вводят в реакционную массу в количестве 0,3% по отношению к массе сомономеров (0,1 г). Далее как в Примере 1. Полученные гранулы представляют собой хорошо сшитый стекловидный полимер (К_{набухания}=1,2; ρ_{насыпная}=0,32 г/см³), хорошо смачиваемый водой. Выход конечного продукта 32 г или 90% по сомономерам. Полученный по заявленному способу сорбент характеризуется значительной равновесной емкостью сорбции по эндотоксину (4750 ед/г).

Пример 5. В полипропиленовый стакан объемом 50 мл загружают глицерин 14,86 мл (18,57 г). Далее в стакан добавляют 5,12 мл (4,71 г) ДМАЭМ и 13,2 мл (13,86 г) ДМЭГ, что соответствует загрузке ДМАЭМ:ДМЭГ в соотношении 30:70 мол.% и концентрации сомономеров в растворителе 50 мас.%. Инициатор ДАК вводят в реакционную массу в количестве 0,3% по отношению к массе сомономеров (0,06 г). Далее как в Примере 1. Полученные гранулы представляют собой хорошо сшитый стекловидный полимер (К_{набухания}=1,1; ρ_{насыпная}=0,51 г/см³), хорошо смачиваемый водой. Выход конечного продукта 16,7 г или 90% по сомономерам. Полученный по заявленному способу сорбент характеризуется значительной равновесной емкостью сорбции по эндотоксину (4900 ед/г).

Данные конкретных примеров синтеза и сорбционных свойств сополимеров ДМАЭМ и ДМЭГ сведены в таблице:

№	М1/М2	Растворитель/инициатор	ПОЕ	Q	Кн	ρ,	q,
1	50/50	вода - этанол	4,5	88	1,4	0,43	4700
(9:91)/ДАК
2	50/50	Этанол/ДАК	5,0	90	1,1	0,43	4800
3	70/30	Этанол/ДАК	3,9	95	1,2	0,34	4790
4	50/50	Глицерин/ДАК	4,2	90	1,2	0,32	4750
5	30/70	Глицерин/ДАК	2,6	90	1,1	0,51	4900

где M₁ - ДМАЭМ, мол.%; M₂ - ДМЭГ, мол.%; ПОЕ - полная обменная емкость по аминогруппам, мг-экв/г; Q - экспериментальный выход по мономеру, мас.%; К_н - коэффициент набухания в воде; ρ - насыпная плотность сорбента, г/см³; q - равновесная сорбционная емкость сорбента по эндотоксину, ед/г.

Способ получения сетчатого полимерного сорбента для селективной сорбции эндотоксина из плазмы крови, включающий радикальную сополимеризацию функционального мономера и сшивающего агента в присутствии инициатора динитрила-2-азо-бис-изомасляной кислоты, отличающийся тем, что в качестве функционального мономера используют диметиламиноэтилметакрилат, а в качестве сшивающего агента диметакрилат этиленгликоля и сополимеризацию проводят при нагревании до 70°С в инертной атмосфере в этаноле, глицерине или смеси вода-этанол при концентрации сомономеров в растворе 50 мас.% и соотношении функциональный мономер : сшиватель 30-70:70-30 мол. %.