Штамм бактерий cupriavidus eutrophus вкпм в-10646 - продуцент полигидроксиалканоатов и способ их получения
Группа изобретений относится к биотехнологии и касается штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - продуцента полигидроксиалканоатов (ПГА) и способа их получения. Штамм выделен из Ralstonia eutropha ВКПМ В-8562 в процессе длительной многоступенчатой селекции по эффективности синтеза многокомпонентных ПГА. ПГА получают путем культивирования штамма в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде при лимите азота. Среда содержит ростовой субстрат с дополнительным источником углерода. В качестве ростового субстрата используют глюкозу или фруктозу, или 3-масляную кислоту, или газовую смесь - водород, кислород и двуокись углерода, или синтез-газ в смеси с кислородом. В качестве дополнительного источника углерода используют раствор 3-валерата калия или растворы 3-валерата калия и 3-гексаноата калия, или растворы 3-валерата калия, 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-масляной кислоты и 4-буторолактона, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона и 3-гексаноата калия, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона, 3-валерата калия и 3-гексаноата калия. Изобретение позволяет получить ПГА с выходом 70-90%. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма-продуцента полимеров гидроксиалкановых кислот (ПГА) и способа их получения. Эти полимеры термопластичны, характеризуются высокой биологической совместимостью и разрушаемостью в биологических средах, поэтому перспективны для различных сфер применения: в медицине (хирургические элементы, имплантаты, матриксы функционирующих клеток), в фармакологии (для создания долговременных лекарственных систем с контролируемым выходом препаратов, предметов гигиены и санитарии), в сельском хозяйстве (биоразрушаемые покрытия и упаковка удобрений и пестицидов с целью адресной доставки).
Среди продуцентов ПГА известны различные прокариотические микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах (сахарах, органических кислотах, отходах сельского хозяйства и промышленности) и синтезировать эти полимеры [Madison L.L., Huisman G.V. Metabolic engineering of poly (3-hydroxyalkanoates): From DNA to plastic // Microbiol. And Molecular Biology Rev. - 1999. - Vol.63. - P.1-25]. Однако для промышленного применения выделено несколько высокопродуктивных микроорганизмов. Это водородокисляющие бактерии Alcaligenes latus, Alcaligenes eutrophus (переименованные из Ralstonia и Wautersia eutropha, в настоящее время отнесенные к роду Cupriavidus), азотфиксаторы Azotobacter vinelandii, метилотрофы Methylomonas, Methylobacterium organophilum [Madison L.L., Huisman G.V. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): From DNA to plastic // Microbiol. And Molecular Biology Rev. - 1999. - Vol.63. - P.1-25], синтезирующие, в основном, полимер 3-гидроксимасляной кислоты (3-гидроксибутират (3-ПГБ)), который является наиболее изученным и распространенным представителем ПГА. 3-ПГБ - это высококристалличный (степень кристалличности - свыше 70%) термопласт, высокая биосовместимость которого базируется на том, что гидроксимасляная кислота является естественным метаболитом клеток и тканей высших организмов и человека [Reusch R.N., Sparrow A.W., Gardiner J.
Transport of poly-beta-hydroxybutyrate in human plasma // Biochim. Biophys Acta. - 1992. - V.1123. - P.33-40].
Несмотря на то что поли-3-ПГБ обладает высокой биологической совместимостью, деградирует в биологических средах и может быть использован для получения различных медицинских изделий, его недостатком является то, что он не кристаллизуется упорядоченно, поэтому этот тип ПГА достаточно трудно перерабатывать в изделия, которые характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени [Lakshmi S., Laurencin С. Biodegradable polymers as biomaterials // Prog. Polym. Sci. - 2007. V.32. - P.762-798].
Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной C-цепи, от C4 до C12 и выше. Мономерный состав ПГА определяет их базовые свойства. Однако синтез гетерополимерных ПГА (т.е. полимеров, образованных мономерами с различной длиной C-цепи) - сложная технологическая задача, решение которой возможно несколькими путями. Первый заключается в поиске новых штаммов - продуцентов ПГА и создании специализированных условий для их выращивания. Второй путь предполагает конструирование генетически модифицированных организмов, в которых объединяют гены, контролирующие синтез ПГА из различных природных штаммов.
Известны штаммы-продуценты многокомпонентных и разнообразных по составу ПГА, образованных не только мономерами 3-гидроксибутирата, но и другими мономерами: 2-гидроксибутиратом, 2-гидроксивалератом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом, 3-гидроксиоктаноатом, 3-гидроксидодеканоатом, а также 4-гидроксибутироатом, 4-гидроксивалератом и их сополимерами. Эти ПГА, в отличие от гомогенного 3-ПГБ, характеризуются более высокой скоростью биодеградации, большей эластичностью и способностью перерабатываться в разнообразные изделия с высокими физико-механическими характеристиками [патенты США №:5,245,023 (September 14, 1993); 6,323,010 (November 27, 2001); 6,316,262 (November 13,2001); 6,593,116 (Jule 15, 2003); 6,689,589 (February 10, 2004); 6,838,493 (January 4, 2005); 7,229,804 (June 12, 2007)].
Недостатки данных штаммов-продуцентов гетерополимерных ПГА, заключаются в том, что они являются генетически модифицированными организмами, требуют для роста специализированных дорогостоящих сред, а также характеризуются нестабильностью в процессе культивирования и возможностью снижения или утраты способности синтезировать ПГА требуемого состава.
Известен природный штамм Alcaligenes eutrophus B-5786 (депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ), способный с высокими выходами синтезировать 3-полигидроксибутират на смесях диоксида углерода, кислорода и водорода [патент РФ №2053292, МПК C12N 1/20, опубл. 27.01.1996 г., (прототип)].
Известен способ получения гетерополимера 3-оксимасляной и 3-оксивалериановой кислот, заключающийся в культивировании штамма Alcaligenes eutrophus ВКПМ B-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат - водород и двуокись углерода или соли уксусной кислоты с добавлением валериановой или пропионовой кислоты, при лимите азота [патент РФ №2051968, МПК C12P 7/62, опубл. 10.01.1996 г., (прототип)].
Недостатки штамма В-5786 и способа получения на его основе ПГА заключаются в высокой чувствительности к солям алкановых кислот с длиной С-цепи свыше C5, неспособности синтезировать сополимеры 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом, а также неспособность использовать глюкозу и другие сахара в качестве ростового субстрата.
Техническим результатом изобретения является выявление нового продуктивного штамма, способного устойчиво синтезировать с высокими (70-90%) выходами технологичные гетерополимерные ПГА, содержащие в качестве макровключений (свыше 10-20 мол.%), помимо 3-гидроксибутирата, другие мономеры (3-гидроксивалерат, 3-гидроксигексаноат, 4-гидроксибутират), имеющие степень кристалличности не выше 50%, растущие на различных субстратах, включая смеси углекислоты с кислородом и водородом различного происхождения, сахара (фруктоза, глюкоза) и спектр органических кислот (ацетат, бутират, а также валерат, гексаноат, бутуролактон и др.) и имеющего более широкие границы физиологического действия по отношению к перечисленным субстратам, являющихся предшественниками мономеров (4-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата) и усиливающих образование гетерополимерных ПГА.
Технический результат достигается тем, что выявлен штамм Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646, который является продуцентом полигидроксиалканоатов.
Технический результат достигается также и тем, что в способе получения полигидроксиалканоатов по п.1, заключающемся в культивировании штамма-продуцента в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат с дополнительным источником углерода, при лимите азота, новым является то, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646, в качестве ростового субстрата используют глюкозу или фруктозу, или 3-масляную кислоту, или газовую смесь - водород, кислород и двуокись углерода, или синтез-газ в смеси с кислородом, а в качестве дополнительного источника углерода используют раствор 3-валерата калия, или растворы 3-валерата калия и 3-гексаноата калия, или растворы 3-валерата калия, 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-маслянной кислоты и 4-буторолактона, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона и 3-гексаноата калия, или растворы 3-маслянной кислоты, 4-буторолактона, 3-валерата калия и 3-гексаноата калия.
Заявляемый штамм является одним из вариантов, выделенных из культуры глюкозоусваивающего штамма Ralstonia eutropha B-8562 (штамм получен в результате длительной селекции штамма B-5786 на средах с единственным источником углерода - глюкозой, штамм депонирован в ВКПМ) в процессе длительной многоступенчатой селекции по эффективности синтеза многокомпонентных ПГА, образованных мономерами с различной длиной С-цепи, на ростовой среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или смеси органических кислот. Для отбора штамма, способного эффективно синтезировать гетерополимерные ПГА, в состав ростовой среды дополнительно вводили натриевые соли алкановых кислот (пентановой, гексановой, октановой и др.), стимулирующие синтез 3-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата, 3-гидроксигептаноата и др.) или 4-бутуролактон, стимулирующий образование 4-гидроксибутирата. Штамм в отличие от прототипа устойчив к воздействию более высоких концентраций токсических субстратов (CO, соли алкановых кислот, 4-бутуролактон).
Заявляемый штамм Cupriavidus eutrophus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), коллекционный номер ВКПМ B-10646.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицателен, клетки-палочки (молодые - короткие, в стационарной фазе - разной длины, размеры 0.3-0.5×1.2-2.0 мк), подвижные (молодые - монотрихи, с возрастом - перетрихи). Слабоподвижен. Оптимум роста 30-31°C, pH 6,7-7,2. На агаризованной среде с пептоном (гетеротрофные условия роста) образуют морфологически однородные округлые колонии, светло-кремовые, непрозрачные со слегка волнистым краем диаметром 2-4 мм. На минеральной агаризованной среде (автотрофные условия роста) колонии мелкие (1,5-2,5 мм), светло-серые, полупрозрачные. В жидкой питательной среде представляет однородную суспензию (минеральная среде Шлегеля, содержащая в качестве источника углерода смесь монокарбоновых кислот (или сахара, органические кислоты, аминокислоты, спирты) при гетеротрофном росте, при автотрофии - смесь диоксида углерода, водорода и кислорода. Облигатный аэроб. Факультативный хемолитоавтотроф. Оксидазоположителен. Гидролитическими ферментами не обладает. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Обладает широким органотрофным потенциалом и способен в качестве источника углерода использовать: сахара (глюкоза, фруктоза), аминокислоты (аланин, серин, лейцин, гистидин, триптофан, глутаминовую, аспарагиновую, лизин), органические кислоты (щавелевую, лимонную, янтарную, фумаровую, уксусную, 3-и 4-масляную кислоту, пентапновую, гексановую, октановую, нонановую), спирты (этанол, глицерин), 4-бутуролактон, CO2 и CO. В качестве источника азота использует нитраты, соли аммония, карбамид, аминокислоты. Активность ферментов цикла ПГА составляет (U/мин×мг белка): β-кетотиолазы 3.57-4.26, ацетоацетил-CoA-редуктазы 0.98-1.23, ПГА-синтазы 0.08-0.10 E., (D)-гидроксибутиратдегидрогеназы 0.18-0.22. Содержание ГЦ пар нуклеотидов в ДНК равно 66%. Клонирован и охарактеризован ДНК фрагмент 1381 н.п., включающий нуклеотидную последовательность гена 16S rRNA штамма В-10646.
Ростовые характеристики: штамм растет на минеральной среде с сахарами или органическими кислотами, а также в атмосфере водорода, двуокиси углерода и кислорода, специфических факторов роста и органических добавок не требуется. Границы физиологического действия рН в диапазоне 4.4-8.6, штамм сохраняет способность к росту в диапазоне температур 20-41°C. Стабильно сохраняет свои характеристики при варьировании условий культивирования и сред (замена источника углерода и энергии, низкие или высокие значения активной реакции среды, повышение температуры до 35°C, использование в качестве ростового токсического субстрата - 4-бутуролактон и соли монокарбоновых кислот. На полной питательной среде удельная скорость роста - до 0.45 1/ч, продуктивность - до 2 г/л час, содержание общего азота - до 12%, белка - до 65%, при дефиците азота в среде накапливает полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (полгидроксиалканоаты, ПГА), максимально до 97% различного химического состава (содержащих мономеры с длиной С-цепи от C4 до C9).
Культивирование бактерий проводят в стерильном режиме с использованием литровых колб, заполненных средой Шлегеля на 40-50% по объему на термостатируемой качалке или с использованием автоматизированного ферментационного комплекса BioFlo 110 («New Brunswic», США) объемом 15 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (pH, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде следующего состава (г/л): Na2HPO4·H2O - 9.1, KH2PO4 - 1.5; MgSO4 H2O - 0.2, Fe3C6H5O7·7H2O - 0.25, NH4Cl - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H3BO3 - 0.228, CoCe2×6H2O - 0.030, CuSO4×5H2O - 0.008, MnCe2×4H2O - 0.008, ZnSO4×7H2O - 0.176, NaMoO4×2H2O - 0.050, NiCe2 - 0.008 (г/л). Коэффициент заполнения ферментера составляет от 0.3 до 0.5, число оборотов мешалки 1000-1500 (об/мин).
При гетеротрофном режиме - исходная концентрация сахаров - 10-15 г/л с подпиткой культуры субстратом с использованием перистальтического насоса-дозатора, аэрация культуры - стерильным воздухом. В автотрофном режиме в качестве источника углерода и энергии используют смесь газов (CO2, H2, O2) с соотношением компонентов как 1:2:7 по объему. Газовую смесь с помощью компрессора мембранного типа непрерывно прокачивают через культуру с расходом 10-14 л/мин. Контроль состава газовой смеси проводят в непрерывном режиме с помощью серийных газоанализаторов, а также на хроматографе ЛХМ-80 МД («Хроматограф», Россия) (детектор - катарометр, газ-носитель - аргон).
Оптимальны для скорости роста значения pH 6.7-7.2, оптимум температуры среды для размножения 29.5-31.5°C. Соотношение газов в смеси при автотрофном росте (% об.): диоксид углерода 5-10, кислород 10-25 (в зависимости от плотности культуры), водород от 30 до 70 (ингибирования нет). Солевая среда Шлегеля (состав указан выше). При гетеротрофном росте - все параметры и среда Шлегеля аналогично автотрофному росту, источник углерода (сахара и/или органические кислоты) - 10-15 г/л.
Таким образом, для заявляемого штамма характерны:
- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава,
- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном виде,
- высокая активность ферментов, контролирующих синтез ПГА,
- способность к синтезу ПГА с высокими выходами,
- устойчивость к воздействию С-субстратов - стимуляторов синтеза гетерополимерных ПГА,
- способность к синтезу гетерополимерных ПГА, образованных различными мономерами с макровключениями последних,
- способность к синтезу ПГА, имеющих степень кристалличности ниже 50%.
Для реализации режима синтеза ПГА заявляемым штаммом, штамм Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 выращивают в периодическом режиме на среде Шлегеля в автотрофном режиме (на газовой смеси водорода:кислорода:углекислоты) или гетеротрофно на сахарах или органических кислотах: на первом этапе при избытке углеродного субстрата на полной питательной среде; на втором этапе - в безазотной среде. Для образования ПГА с различным составом мономеров в состав среды с помощью перистальтического насоса дозатора в культуру вносят дополнительный углеродный субстрат в виде солей кислот (масляной или валериановой, гексановой, октановой, нонановой), а или 4-буторолактон и др. В зависимости от дозы подаваемого дополнительного углеродного субстрата и времени ферментации соотношение мономеров с различной длиной С-цепи в полимере варьируется в широких пределах, при этом синтезируются гетерополимерные ПГА, имеющие степень кристалличности 50% и менее.
Концентрацию ПГА в клеточной биомассе и состав мономеров в нем определяли после предварительного метанолиза проб на хроматомасс-спектрометре Agilent 5975Inert, фирмы «Agilent» (США). Выделение полимера из биомассы проводили дихлорметаном, полученный экстракт после его концентрирования на роторном испарителе Rotavapor R-210 (Швейцария) осаждали изопропанолом. Для получения высокоочищенных образцов процедуру перерастворения и осаждения проводили несколько раз. Полимер высушивали в боксе-ламинаре и анализировали физико-химические характеристики.
С использованием системы гель-проникающей хроматографии «Waters Breeze System» фирмы «Waters» (США) определяли молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение полимеров относительно полистероловых стандартов фирмы «Sigma-Aldrich». Рентгеноструктурный анализ и определение степени кристалличности образцов выполнены на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE фирмы «Bruker» (Германия) (графитовый монохроматор на отраженном пучке). Для определения температурных характеристик ПГА проводили комплексный термический анализ образцов с использованием синхронного термоанализатора STA 449 Jupiter фирмы NETZCSH (Германия), сочетающего одновременное измерение изменений массы (термогравиметрия) и тепловых потоков (дифференциальная сканирующая калориметрия).
Получение полигидроксиалканоатов на основе штамм Cupriavidus eutrophus B-10646 иллюстрируют следующие примеры:
Пример 1.
Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646 суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 10 г/л, Na2HPO4·H2O - 9.1, KH2PO4 - 1.5; MgSO4·H2O - 0.2, Fe3C6H5O7·7H2O - 0.25, NH4Cl - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H3BO3 - 0.228, СоСе2×6H2O - 0.030, CuSO4×5H2O - 0.008, MnCe2×4H2O - 0.008, ZnSO4×7H2O - 0.176, NaMoO4×2H2O - 0.050, NiCe2 - 0.008 (г/л). Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.3-0.5 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 16 ч при 30°C и pH 7.0. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе BioFlo 110 («New Brunswic», США) объемом 15 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (pH, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде следующего состава (г/л): Коэффициент заполнения ферментера составляет от 0.3 до 0.5, регулируемое число оборотов мешалки 1000-1500 (об/мин). Выращивание бактерий проводят при 30°С и pH 7.0 при текущей концентрации глюкозы в культуре 5-10 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л, растворы которых подаются в культуру насом-дозатором раздельными потоками. Через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 24 ч при подаче в культуру раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 40 ч при общем выходе полимера 96% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 99.4; 3-гидроксивалерат - 0.4; 3-гидроксигексаноат - 0.2 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№1).
Пример 2.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 24 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 3 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 40 ч при общем выходе полимера 87% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 6.4; 3-гидроксивалерат - 93.1; 3-гидроксигексаноат - 0.5 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№2).
Пример 3.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч подачу азота в культуру прекращают, и культивирование продолжают 16 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - 5 г/л) и раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 32 ч при общем выходе полимера 87.9% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 73.0 мол.%; 3-гидроксивалерат - 26.1 мол.%; 3-гидроксигексаноат - 1.09 мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№3).
Пример 4.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 24 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-валерата калия и раствора 3-гексаноата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущие концентрации в культуре, соответственно, 3-валерата и 3-гексаноата, 3 г/л и 1 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 40 ч при общем выходе полимера 74.6% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 60.5; 3-гидроксивалерат - 33.0; 3-гидроксигексаноат - 6.5 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№4).
Пример 5.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 34 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-валерата калия, раствора 3-гексаноата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущие концентрации в культуре, соответственно, 3-валерата и 3-гексаноата, 3 г/л и 1 г/л), а также раствора акрилата (текущая концентрация в культуре - 1.5 г/л). Акрилат используют в качестве ингибитора цикла бета-окисления жирных кислот с целью избежания разрушения С-цепи добавляемого в культуру 3-гексаноата и, тем самым, повышения его включения в ПГА. Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 64.6% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 37.8; 3-гидроксивалерат - 26.0; 3-гидроксигексаноат - 36.2 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№5).
Пример 6.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 34 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-валерата калия (текущая концентрация 2.5 г/л), раствора 3-гексаноата калия (текущая концентрация в культуре 2.0 г/л), раствора акрилата (текущая концентрация в культуре - 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 75.0% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 33.9; 3-гидроксивалерат - 30.1; 3-гидроксигексаноат - 36.0 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№6).
Пример 7.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, через 16 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают 30 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора глюкозы (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 3-гексаноата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре 2.5 г/л) и раствора акрилата (текущая концентрация в культуре - 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 46 ч при общем выходе полимера 79.0% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 43.7; 3-гидроксивалерат - следы; 3-гидроксигексаноат - 56.3 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№7).
Пример 8.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют фруктозу при текущей концентрации в культуре 5-10 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л. Через 12 ч подачу азота в культуру прекращают, и культивирование продолжают 22 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-буторолактона в качестве дополнительного источника углерода и прекурсора образования мономеров 4-гидроксибутирата (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 44 ч при общем выходе полимера 87.2% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 70.1; 4-гидроксибутират - 12.0; 3-гидроксивалерата - 1.4; 3-гидроксигексаноат - 0.6 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№8).
Пример 9.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют фруктозу при текущей концентрации в культуре 5-10 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л. Через 16 ч подачу азота в культуру прекращают, и культивирование продолжают 22 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 4-буторолактона и раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущие концентрации которых в культуре составляют по 2.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 38 ч при общем выходе полимера 80.0% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 55.4; 4-гидроксибутират - 8.0; 3-гидроксивалерата - 36.6; 3-гидроксигексаноат - следы (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№9).
Пример 10.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют фруктозу при текущей концентрации в культуре 5-10 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л. Через 16 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 36 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л), раствора 4-бутуролактона (текущая концентрация в культуре составляют 2.5 г/л) и раствора 3-валерата калия (текущая концентрация в культуре - 3 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 52 ч при общем выходе полимера 76.9% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 34.8; 4-гидроксибутират - 18.0; 3-гидроксивалерата - 46.6; 3-гидроксигексаноат - 0.6 (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№10).
Пример 11.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют 3-масляную кислоту при текущей концентрации масляной кислоты в культуре 5 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л. Через 16 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 26 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-буторолактона в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 42 ч при общем выходе полимера 73% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 70.3; 4-гидроксибутират - 28.5; 3-гидроксивалерата - 0.8; 3-гидроксигексаноат - 0.4 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№11).
Пример 12.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют 3-масляную кислоту при текущей концентрации масляной кислоты в культуре 5 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л. Через 20 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 26 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-бутуролактона в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л) и раствора 3-гексаноата калия (текущая концентрация 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 46 ч при общем выходе полимера 70% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 49.3; 4-гидроксибутират - 21.5; 3-гидкроксивалерат -0.8; 3-гидроксигексаноат - 28.4 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№12).
Пример 13.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют 3-масляную кислоту при текущей концентрации масляной кислоты в культуре 5 г/л и NH4Cl - 0.1-0.2 г/л. Через 20 ч подачу азота в культуру прекращают и культивирование продолжают 30 ч при подаче в культуру отдельными потоками раствора 3-масляной кислоты (текущая концентрация в культуре - не выше 5 г/л) и раствора 4-бутуролактона в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л) и раствора 3-валерата калия (текущая концентрация 1.5 г/л) и раствора 3-гексаноата калия (текущая концентрация 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 75% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 36.3; 4-гидроксибутират 16.5; 3-гидроксивалерат -26.8; 3-гидроксигексаноат - 20.4 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№13).
Пример 14.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют смесь газов следующего состава (в об.%): водород 70, кислород 20 и двуокись углерода 10, которую из газгольдера объемом 50 л через систему микробиологических фильтров прокачивают непрерывно через культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Через 24 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают еще 26 ч при подаче в культуру раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 82% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 46.1; 3-гидроксивалерат - 53.0; 3-гидроксигексаноат - 0.9 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№14).
Пример 15.
Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве ростового субстрата используют синтез-газ, получаемый газификацией бурых углей [согласно патенту РФ №2207375, МПК C12P 7/42, опубл. 27.06.2003 г.] или конверсией природного газа [а.с. СССР №1233483, опубл. 1985 - №32] и кислород, используемая газовая смесь содержит (в об.%): водород 60, кислород 20 и двуокись углерода 10, окись углерода 10, которую из газгольдера объемом 50 л через систему микробиологических фильтров прокачивают непрерывно через культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Через 30 ч после отключения подачи азота в культуру, культивирование продолжают еще 30 ч при подаче в культуру раствора 3-валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация 2 г/л) и 3-гексаноата калия (текущая концентрация 1.5 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 60 ч при общем выходе полимера 80% (к весу сухого вещества клетки). Состав полимера: 3-гидроксибутират - 42.8; 3-гидроксивалерат - 36.0; 3-гидроксигексаноат - 20.9 молярных процентов (мол.%). Физико-химические характеристики этого типа ПГА представлены в таблице (№15).
Использование штамма Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646 в качестве продуцента ПГА, варьирования концентрации и типа углеродного субстрата, а также длительности культивирования, позволяет получать спектр разнообразных ПГА, образованных различными мономерами и существенно различающихся по физико-химическим свойствам (таблица 1).
| Таблица 1 | |||||||||
| Состав и физико-химические свойства ПГА, синтезируемые Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646 | |||||||||
| № | Состав ПГА - соотношение мономеров (мол.%) | Свойства ПГА | |||||||
| 3-ГБ | 3-ГВ | 3-ГГ | 4-ГБ | Мв, Да | ПД(n) | Cх, % | Tпл.,°C | T°дегр.,°C | |
| 1 | 99.4 | 0.4 | 0.2 | - | 1340329 | 2.64 | 78* | 182 | 286 |
| 2 | 6.4 | 93.1 | 0.5 | - | 1111446 | 3.49 | 41 | 159 | 260 |
| 3 | 73.0 | 26.1 | 1.09 | - | 1501622 | 2.27 | 50 | 176 | 272 |
| 4 | 60.5 | 33.0 | 6.5 | - | 1200451 | 2.67 | 40 | 167 | 276 |
| 5 | 37.8 | 26.0 | 36.2 | - | 986912 | 2.86 | 32 | 166 | 277 |
| 6 | 33.9 | 30.1 | 36.0 | - | 812892 | 2.64 | 36 | 169 | 281 |
| 7 | 43.7 | 0.1 | 56.2 | - | 1240854 | 3.12 | 30 | 167 | 280 |
| 8 | 70.1 | 1.4 | 0.6 | 12.0 | 844256 | 2.31 | 38 | 170 | 278 |
| 9 | 55.4 | 36.6 | сл. | 8.0 | 1113866 | 2.32 | 43 | 168 | 278 |
| 10 | 34.8 | 46.6 | 0.6 | 18.0 | 965401 | 2.59 | 25 | 166 | 274 |
| 11 | 70.3 | 0.8 | 0.4 | 28.5 | 568412 | 1.91 | 12 | 167 | 272 |
| 12 | 49.3 | 0.8 | 28.4 | 21.5 | 1349215 | 2.98 | 45 | 171 | 283 |
| 13 | 36.3 | 26.8 | 20.4 | 16.5 | 1216090 | 2.67 | 46 | 177 | 278 |
| 14 | 46.1 | 53.0 | 0.9 | - | 1230218 | 2.46 | 44 | 164 | 267 |
| 15 | 42.8 | 36.0 | 20.9 | - | 1109216 | 2.89 | 50 | 176 | 280 |
| Примечание: | |||||||||
| * - в качестве примера приведен гомополимерный поли 3-гидроксибутират, имеющий высокую степень кристалличности 3-ГБ-3 гидроксибутират; 3-ГВ-3 гидроксивалерат; 3-ГГ-3 гидроксигексаноат; 4-ГБ-4 гидроксибутират; | |||||||||
| Mв - молекулярная масса, Да - дальтон; ПД (n) - полидисперсность; Сх, % - степень кристалличности; Tпл.°C - температура плавления; Тдегр.°C - температура термической деградации. |
1. Штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646 - продуцент полигидроксиалканоатов.
2. Способ получения полигидроксиалканоатов, заключающийся в культивировании штамма-продуцента в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей ростовой субстрат с дополнительным источником углерода, при лимите азота, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм бактерий Cupriavidus eutrophus ВКПМ В-10646, в качестве ростового субстрата используют глюкозу или фруктозу, или 3-масляную кислоту, или газовую смесь водород, кислород и двуокись углерода, или синтез-газ в смеси с кислородом, а в качестве дополнительного источника углерода используют раствор 3-валерата калия, или растворы 3-валерата калия и 3-гексаноата калия, или растворы 3-валерата калия, 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-гексаноата калия и акрилата, или растворы 3-масляной кислоты и 4-буторолактона, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона и 3-валерата калия, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона и 3-гексаноата калия, или растворы 3-масляной кислоты, 4-буторолактона, 3-валерата калия и 3-гексаноата калия.
