Штамм "ас-21/07" вируса ауески для изготовления вакцинных и диагностических препаратов
Владельцы патента RU 2439150:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Штамм "АС-21/07" вируса болезни Ауески депонирован в коллекции ВГНКИ под регистрационным номером «AC-21/07»-ДЕП. Штамм получен из исходного штамма МК-25 путем селекции. В культуре клеток ПСГК-60 и ПСГК-60С вирус 19-21 пассажа накапливается до 8,0-8,5 lg ТЦД50/см3. Штамм является аттенуированным для свиней, овец и кроликов и обладает высокими биологической, антигенной и иммуногенной активностями в нативном виде и после инактивации. 2 ил., 3 табл.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики болезни Ауески.
Болезнь Ауески (БА) или псевдобешенство вызывает ДНК-содержащий вирус семейства Herpesviridae рода Varicellavirus. Болеют все виды сельскохозяйственных животных, пушные звери и грызуны. Наряду с признаками поражения головного мозга у больных животных, за исключением свиней, наблюдаются сильный зуд и расчесы. В России болезнь Ауески была установлена в начале 20 столетия (в 1909 г.) и с этого времени регистрируется на ее территории в форме спорадических случаев.
У свиней болезнь может протекать в острой, подострой, хронической и латентной формах. К вирусу БА восприимчивы все возрастные группы свиней, особенно новорожденные поросята, гибель которых может достигать 100%.
Вакцинопрофилактика болезни Ауески занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для ее профилактики применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные из вируса, репродуцированного в различных культурах клеток [1-6]. Получен ряд вакцинных штаммов, используемых для приготовления профилактических препаратов, таких как БУК 622, БУК 900, ВГНКИ, МК-25 и др., которые различаются по своим иммунобиологическим свойствам, а также технологическим приемам их культивирования.
Для производства вакцин используют аттенуированные штаммы вирусов различного происхождения. Их получали серийным пассированием в первичных и перевиваемых культурах при различных температурах (37,0 и 28,0)°C или в присутствии мутагенов. Полученные аттенуированные штаммы различаются между собой многими признаками, и в том числе патогенностью для лабораторных животных. Все используемые вакцинные штаммы авирулентны для свиней различного возраста, однако различаются по патогенности для овец, кроликов, морских свинок, пушных зверей.
В нашей стране наиболее широкое применение нашла вирусвакцина из аттенуированного штамма ВГНКИ, полученная путем длительного пассирования на куриных эмбрионах и в культуре клеток куриных фибробластов (227 пассажей). Многолетнее применение этой вакцины, а также живой вирусвакцины из штамма БУК-628 (ВНИВИ), позволило стабилизировать эпизоотическую обстановку в России и значительно снизить количество вспышек заболевания. Однако проведенные в конце 80-х годов исследования вирусвакцин из штаммов БУК-628 и ВГНКИ показали, что вирулентный штамм ВБА приживляется и персистирует в организме у 100% вакцинированных поросят [5]. Во ВНИИЗЖ была разработана инактивированная вакцина против болезни Ауески из штамма УНИИЭВ-18ВС, культивируемого в суспензии перевиваемой линии клеток ВНК 21/2-17.
Наиболее высокое накопление шт.БУК-628, Женевский, УНИИЭВ-18ВС, МК-25. Высокая цитопатическая активность штаммов в первичной линии клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, ВНК-21, наименьшая активность MDVK и ППК. Все исследуемые штаммы термолабильны. Для изготовления живых вакцин хотя и используются аттенуированные штаммы, тем не менее они способны вызывать осложнения на иммунном фоне у животных. Это может произойти вследствие реактивации или рекомбинации вакцинного вируса с полевым. Эпизоотичекие штаммы используют при изготовлении инактивированных вакцин, но они в случае неполной инактивации вирусного сырья могут вызвать вспышки заболевания.
Аттенуированный вакцинный штамм МК-25, используемый для производства живых и инактивированных вакцин, обладает рядом преимуществ: он технологичен, обеспечивает накопление вируса в титрах 6,75-8,00 lg ТЦД50/см3 и менее патогенен для кроликов и морских свинок [7].
Целью настоящего изобретения явилось получение нового безопасного (аттенуированного) производственного вакцинного штамма вируса БА, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющего свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодного для изготовления высокоиммуногенных вакцинных препаратов.
Технический результат от использования изобретения заключается в расширении арсенала безопасных (аттенуированных) штаммов вируса БА, обладающих высокой биологической антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных препаратов.
Данный технический результат достигнут получением штамма «АС-21/07» вируса БА. Штамм «АС-21/07»является новым ранее неизвестным. Исходный вирус штамма МК-25 использовали для получения штамма «АС-21/07» путем селекции по признаку максимального накопления и высокой иммуногенности в процессе многократных пассажей на чувствительной клеточной системе.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 14 мая 2010 года под регистрационным шифром «АС-21/07»-ДЕП.
Штамм «АС-21/07» вируса БА отличается от прототипа однородностью популяции и более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления средств диагностики и профилактики БА.
Штамм «АС-21/07» обеспечивает проведение серологической диагностики БА и производство эффективной инактивированной вакцины против БА, создающей надежную защиту животных (свиней, овец, кроликов) от указанного возбудителя заболевания, а также производство ассоциированной инактивированной вакцины против болезни Ауески и Тешена.
Штамм «АС-21/07» вируса БА характеризуется следующими признаками и свойствами.
Таксономичекая характеристика заключается в том, что штамм «АС-21/07» имеет форму и размеры, типичные для герпесвирусов. видовой принадлежности штамма «АС-21/07» вируса болезни Ауески с помощью реакции нейтрализации (РН) и методом флуоресцирующих антител (МФА). В серологических реакциях (РН, РСК, ИФА и др.) выявляются антигены, общие для всех штаммов ВБА. Основные маркерные характеристики штамма «АС-21/07» вируса БА приведены в таблице.
| Основные свойства, характеризующие штамм «АС-21/07» вируса БА | ||
| 1. | Таксономия | Herpesviridae |
| 2. | Тип нуклеиновой кислоты | Линейная двуспиральная ДНК, обладает инфекционостью |
| 3. | Наличие внешней оболочки, число капсомеров | Двухслойная оболочка, содержащая липиды и более 40% белков вириона. Число капсомеров - 162 |
| 4. | Размер вириона | 150-180 нм |
| 5. | Симметрия вириона | икосаэдрическая |
| 6. | Физико-химические свойства вириона | Плавучая плотность вирионов в хлориде цезия 1Б731 г/см3, константа седиментации 54 S |
| 7. | Генетический маркер | Маркированный по делеции генома в К-фрагменте. Делеция выявляется рестрикцией генома по Ваm-Н1 или ПЦР с праймерами, фланкирующими K-фрагмент |
| 8. | Преобладающий тропизм штамма | Пантропный, с преобладанием в нервной ткани паренхиматозных органах (печень, селезенка, легкие, почки) |
| 9. | Патогенность для лабораторных, с.-х. животных | Вызывает гибель кроликов при внутримышечном заражении |
| 10. | Чувствительность культур клеток | КФ, ППК-666, ВНК-21/13, ПСГК-60 и др. с проявлением ЦПД. Накопление вируса до 7,5-8,5 lg ТЦД50/см3 |
| 11. | Серологические свойства | Индуцирует образование комплементсвязывающих, преципитирующих и вируснейтрализующих антител. |
| 12. | Безвредность | безвреден |
| 13. | Стабильность генетических и иммунологических признаков | Стабильность генетических и иммунологических признаков штамма сохранялись при его пассировании в культуре клеток, чувствительных к вирусу БА, в течение не менее 20 пассажей (срок наблюдения) |
| 14. | Применяемый способ стабилизации и хранения | Лиофилизированный вируссодержащий материал aa пептоно-лактозо-желатиновый стабилизатор; 1 см3/амп., при минус 40°C |
| 15. | Периодичность освежения штамма | Один раз в 5 лет, при активности выше 4,0 lg ТЦД50/см3, срок хранения продлевается |
| 16. | В каком виде выдается штамм, рекомендации по транспортировке» | В лиофилизированном виде в ампулах, запаянных под вакуумом. Транспортировать с соблюдением правил СП 1.2.036.95 «Порядок учета, хранения, передачи транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности при температуре ниже нуля в термосе или термосумке с любым хладогентом» |
| 17. | Дополнительные сведения | Свободен от бактериальной, грибковой, микоплазменной микрофлоры |
Сущность предлагаемого изобретения поясняется примерами его исполнения.
ПРИМЕР 1. Учитывая, что производство инактивированной вакцины, как правило, связано с использованием значительного количества вирусного сырья, обладающего высокой инфекционной активностью, а также то, что у вируса болезни Ауески отсутствует типовая гетерогенность, выбор штамма, пригодного для конструирования инактивированной вакцины, проводили по признаку максимального накопления в клеточных культурах. С этой целью имеющиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ штаммы Бук-622, М-Врация, ВГНКИ и МК-25 вируса БА, инфекционная активность которых составляла 5,5-6,5 lg ТЦД50/см3, культивировали в различных клеточных субстратах: ПТП, ППК-Д, ВНК-21/13, ПСГК-60, ПСГК-60С и КФ.
В каждой культуре клеток проводили не менее 5 последовательных пассажей указанных штаммов. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в культуре клеток ПСГК-60 и ППК-Д с использованием поддерживающей среды Игла -MEM без сыворотки.
В результате проведенных экспериментов было показано (табл.1), что на уровне 5-го пассажа в этих культурах клеток с большей инфекционной активностью накапливался штамм МК-25 вируса БА. При этом в более высоких титрах (до 7,50 lg ТЦД50/ см3) он размножался в перевиваемых культурах клеток ПСГК-60 и ППК. Наряду с этим штамм МК-25 хорошо размножался и в суспензионной культуре ПСГК-60С, что позволяло получать одномоментно, в зависимости от емкости реактора, большие объемы вирусного сырья, необходимые при производстве инактивированных вакцин. Учитывая эти данные, штамм МК-25 был выбран для проведения селективных пассажей вируса в перевиваемой культуре клеток ПСГК-60 с целью повышения инфекционной активности и его иммуногенности. На уровне 19-21 пассажей его накопление в культуре клеток ПСГК-60 и ПСГК-60С достигало до 8,0-8,5 lg ТЦД50/ см3. Вирус 21 пассажа в культуре клеток ПСГК-60 был обозначен и паспортизирован как производственный штамм «АС-21/07» вируса БА. В течение следующих 10 пассажей штамм «АС-21/07» вируса БА накапливался в пределах 8,00-8.75 lg ТЦД50/ см3 (срок наблюдения).
| Таблица 1 | |||||
| Вирусрепродуцирующая активность культур клеток в отношении различных штаммов вируса БА | |||||
| n=3 | |||||
| Культура клеток | Накопление вируса болезни Ауески | ||||
| АС-21/07 | МК-25 | Бук-622 | М-Врация | ВГНКИ | |
| ПСГК-60 | 8,0-8,5 | 6,75-7,5 | 6,5-7,0 | 6,0-6,5 | 6,0-6,5 |
| ПСГК-60С | 8,0-8,5 | 7,5 | 6,0-6,33 | 6,0 | 6,0-6,5 |
| ПТП | 7,23-7,5 | 6,5 | 6,0 | н.и. | н.и. |
| ППК-Д | н.и. | 7,0-7,5 | 6,5-7,5 | 7,0-7,25 | н.и. |
| ВНК-21/13 | 8,0-8,23 | 6,5-7,0 | 6,5-7,0 | 7,0 | н.и. |
| КФ | 8,0 | 7,5-8,0 | н.и. | н.и. | 6,25-7,25 |
Для получения результатов молекулярно-генетической характеристики штамма «АС-21/07» вируса БА проведен рестрикционный анализ вирионной ДНК, выделенной из очищенных, после селекции, препаратов. На основании полученных данных сделано заключение, что штамм является маркированным по делеции генома в K-фрагменте. Делеция выявляется рестрикцией генома по Ваm-Н1 или ПЦР с праймерами, фланкирующими К-фрагмент.
Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 2 пассажа после лиофилизации заложен на хранение при минус 60°C в качестве производственного с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД50/мл. Полученному штамму вируса БА присвоено авторское наименование «АС-21/07».
ПРИМЕР 2
Изучена патогенность этого штамма для наиболее чувствительных к вирусу БА животных - кроликах. В качестве контроля кроликов также заражали вирулентным штаммом П (эпизоотический) и вакцинным штаммом МК-25. Указанные штаммы инокулировали кроликам массой 2,5-3,0 кг внутримышечно в дозе 105 ТЦД50.
Результаты этих опытов приведены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Патогенность различных штаммов ВБА для кроликов при внутримышечном инфицировании | ||||
| № п/п | Штаммы ВБА | Количество кроликов | Сроки гибели (сутки) | Результаты опыта |
| 1 | П (эпизоотический) | 3 | 3 | 3/3 |
| 2 | МК-25 | 3 | 5-6 | 3/3 |
| 3 | АС-21/07 | 3 | 6-8 | 3/3 |
| Примечание: в числителе - количество кроликов в опыте, в знаменателе - количество павших кроликов. |
В процессе наблюдения отмечали гибель кроликов от штамма П и МК-25 на 3 и 5-6 сутки соответственно, в то время как гибель животных, зараженных штаммом АС-21/07, отмечалась на 6-8 сутки.
Полученные данные свидетельствовали о том, что наименее патогенным штаммом для кроликов и, вероятно, наиболее аттенуированным, является штамм АС-21/07 ВБА.
ПРИМЕР 4
Изучение безвредности и иммуногенности штамма
При внутримышечном введении вируса подсвинкам (2 головы) в дозе 10-7 ТЦД50 у них не наблюдали повышения температуры тела и животные оставались здоровыми в течение всего срока наблюдения (30 дней).
При инокуляции овцам (4 головы) вируса в дозе 106 ТЦД50 животные также оставались клинически здоровыми на протяжении 30 дней (срок наблюдения).
Иммунизация подсвинков (3 головы) 2-3-месячного возраста штаммом АС-21/07 ВБА вызывала образование через 21 сутки в сыворотках крови ВН-антител в титре 1:8-1:16. Штамм АС-21/07 является безвредным для подсвинков и взрослых овец при их внутримышечном инфицировании.
ПРИМЕР 5
Определена стабильность аттенуации (отсутствие реверсии) образцов штамма «АС-21/07» вируса болезни Ауески, депонируемого в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» на целевых животных - поросятах 4-недельного возраста. 5 ампул лиофильно высушенного штамма «АС-21/07» вируса болезни Ауески развели средой Игла MEM с рН 7,0 до исходного объема, объединили в общую пробу, развели таким образом, что в конечном разведении содержалось 106,0 ТЦД50/см3 и ввели интраназально по 1,0 см3 в каждую ноздрю двум поросятам живой массой 8-10 кг (1 пассаж). На 7 сутки после инокуляции из носовой полости поросят отбирали стерильным зондом с хлопковым тампоном длиной 150 мм, образцы носового секрета (слизи) на глубине 10 см. Зонд помещали в пробирку, в которую вносили 1,0 см3 среды Игла MEM. Пробирки замораживали при температуре минус 40°C, после чего проводили цикл оттаивания при температуре (37±0,5)°C. Полученный материал осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин, отбирали надосадочную жидкость, которую объединяли и разводили средой Игла MEM 1:10. Полученный материал вводили по 1,0 см3 в каждую ноздрю двум поросятам живой массой 8-10 кг (2 пассаж). Было проведено 5 пассажей in vivo на поросятах. Между 2 и 3 пассажами in vivo, проводили 1 пассаж in vitro в культуре клеток ПСГК. Надосадочную жидкость после центрифугирования разводили средой Игла MEM 1:10 и вносили в 2 одноразовых стерильных пластиковых флакона для культуры клеток (фирма «GRAINER», площадь 75 см2), с полностью сформировавшимся монослоем клеток ПСГК, предварительно удалив ростовую среду. Инфицированную культуру клеток инкубировали в течение 1 ч при (37±0,5)°C, а затем монослой отмыли 3 раза средой Игла MEM, после чего во флаконы внесли по 10,0 см3 свежей среды Игла MEM с 2% фетальной сыворотки КРС и комплексом антибиотиков. Флаконы инкубировали при (37±0,5)°C. Инкубируемую культуру клеток ежедневно просматривали под микроскопом на наличие деструктивных изменений в виде цитопатического действия. На 3 сутки наблюдали начало проявления цитопатогенного действия вируса. На 4 сутки ЦПД составило 80-90%. Флаконы замораживали при температуре минус 40°C, после чего проводили цикл оттаивания при температуре (37±0,5)°C. Полученный материал осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин, отбирали надосадочную жидкость, которую объединяли и разводили средой Игла MEM 1:10. Полученный материал вводили по 1,0 см3 в каждую ноздрю двум поросятам живой массой 8-10 кг (3 пассаж in vivo).
Установлено, что у поросят, инокулированных интраназально штаммом «АС-21/07» ВБА, на протяжении 5 пассажей температура оставалась в пределах физиологической нормы. В течение всего периода наблюдения все животные оставались клинически здоровыми, характерных признаков болезни Ауески не наблюдали. Это говорит о том, что штамм «АС-21/07» ВБА стабильно аттенуирован.
Приготовление ассоциированной инактивированной вакцины против болезни Тешена и болезни Ауески и изучение ее иммуногенности.
На основе этого штамма «АС-21/07» был изготовлен образец инактивированной ассоциированной вакцины против болезней Тешена и Ауески.
Иммуногенность ассоциированной инактивированной вакцины изучали на 6-ти кроликах и 4-х подсвинках живой массой 20-25 кг. Препарат вводили животным внутримышечно двукратно, кроликам по 1,0 см3, свиньям по 2,0 см3. У привитых животных после первой (на 21 сутки) и второй (на 14 сутки) иммунизации отбирали пробы крови для исследования сывороток на наличие ВН-антител. Наблюдение за животными вели в течение 60 суток после иммунизации.
Установлено, что иммунизация кроликов ассоциированной вакциной вызывала образование ВН-антител в титре 6,5 log2 против вирусов БА и БТ. После второй иммунизации уровень ВН-антител составлял 6,5 log2 против ВБА и 8,3 log2 против ВБТ (фиг.1).
При иммунизации ассоциированной инактивированной вакциной подсвинков титр ВН-антител в их сыворотках крови после первой прививки против ВБА составлял 6,0 log2 и против ВБТ 8,5 log2, после повторного введения препарата - 7,8 log2 против ВБА и 8,3 log2 против ВБТ (фиг.2).
Таким образом, штамм АС-21/07 вируса БА в высоких титрах накапливается в перевиваемых культурах клеток при стационарном и роллерном методах культивирования; является безвредным, иммуногенным для свиней, может быть рекомендован для производства вакцинных и диагностических препаратов.
Источники информации
1. Антигенная активность инактивированного вируса псевдобешенства на различных видах животных / Г.Х.Ильясова, Р.Х.Юсупов, А.И.Цибулькин [и др.] // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Мат. Междунар. симпозиума. / - Казань, 28-30 ноября 2005 г. (часть II), - с.175-181.
2. Баборенко Е.П. Иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески: автореф. дис.… канд. биол. наук. - Владимир, 1996. - 23 с.
3. Инактивированная вакцина против болезни Ауески для иммунизации сельскохозяйственных животных и пушных зверей. / В.А.Мищенко, В.М.Захаров, А.И.Дудников [и др.] // Вирусные и микробные болезни животных: сборник научных трудов. - Владимир, 1995. - С.191-201.
4. Малярец П.В. Болезнь Ауески (обзор литературы). / П.В.Малярец, Е.В.Гусева, Т.А.Ануфриева. - Владимир, 1995. - 72 с.
5. Сергеев В.А. Вирусы и вирусные вакцины. / Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. М.: «Библионика», 2007. - 524 с.
6. Оценка вирусвакцины для профилактики болезни Ауески свиней. / А.А.Коломыцев, В.А.Бабаян, И.Ф.Вишняков [и др.]. // Ветеринария, - 1991. - №1. - С.31-33.
7. Шишкова А.А. Разработка технологии изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против болезни Ауески и энтеровирусного энцефаломиелита свиней: автореф. дис.… канд. ветер. наук. - Покров, 2008. - 23 с.
8. Вирусные болезни животных. / В.Н.Сюрин и др. - М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.
9. Вирусы и вирусные вакцины. Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. / М.: «Библионика», 2007. - 524 с.
Штамм вируса болезни Ауески, семейство Herpesviridae, род Varicello, подтип Herpesvirus bovis 1, коллекция ВГНКИ, регистрационное наименование «AC-21/07»-ДЕП, для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.
