Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита
Владельцы патента RU 2439566:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для прогнозирования длительности антигенемии вируса клещевого энцефалита. Для этого до введения противоклещевого иммуноглобулина у инфицированных лиц определяют уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов IFN-γ и IL-4. При уровне спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пг/мл, а индуцированной - выше 122,2 пг/мл и уровне спонтанной продукции IL-4 ниже 23,5 пг/мл, а индуцированной - ниже 25,3 пг/мл прогнозируют быструю элиминацию антигена. Изобретение позволяет определить длительность периода антигенемии в начальный период инфицирования вирусом, что способствует выбору правильной тактики лечения пациента. 3 табл., 1 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может использоваться для диагностики вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).
Проблема прогнозирования в медицине и в частности при инфекционных заболеваниях в первые дни после инфицирования ВКЭ является актуальной.
Особенности формирования и течения патологического процесса при клещевом энцефалите обусловлены как вирулентными свойствами возбудителя, так и состоянием иммунной системы организма. От адекватности ее функционирования зависят характер течения и исход заболевания. Важнейшую роль в дезрегуляции функционирования иммунной системы при развитии инфекционного процесса играют нарушения межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток, которые являются основными продуцентами цитокинов, регулирующих запуск, направление и реализацию противовирусного иммунного ответа (Ратникова Л.И., Тер-Багдасарян Л.В., Миронов И.Л. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита. // Эпидемиология и инфекц. болезни. - 2002. - №5. - С.41-46, Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа. // Иммунология. - 1999. - №1. - С.17-24). По современным представлениям, характер иммунного ответа, в том числе при вирусных инфекциях, во многом зависит от доминирующего участия Th1 и Th2-субпопуляций лимфоцитов, которые различаются по спектру продуцируемых ими цитокинов (Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета // Иммунология. - 2002. - №2. - С.77-79). Так, Th1-лимфоциты, продуцируя IL-2, IFN-γ и ряд других цитокинов, усиливают клеточный иммунный ответ, который играет существенную роль в регуляции противовирусного иммунитета (Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях // Цитокины и воспаление. - 2004. - №1. - С.3-6).
Формирование иммунного ответа по гуморальному типу, с которым связаны определенные механизмы хронизации инфекционного процесса (Жукова О.Б., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Вирусная персистенция: иммунологические и молекулярно-генетические аспекты патогенеза // Бюлл. Сибирской медицины. - 2003. - №4. - С.113-120), происходит при доминирующем влиянии Th2-цитокинов - IL-4, IL-6, IL-10. Дисбаланс цитокинового профиля, ориентированный на Th1 или Th2-тип иммунного ответа, оказывает важное влияние как на элиминацию вируса и выздоровление больного, так и на возможность развития персистентной вирусной инфекции. Проведенное нами изучение про- и противовоспалительных цитокинов при КЭ показало, что для прогнозирования исхода заболевания наиболее важным будет являться исследование в ранние сроки развития инфекции уровня продукции IFN-γ и соотношения IFN-γ/IL-4. До настоящего времени роль цитокинов у лиц после укуса клеща в первую волну вирусемии (2-4 день) не изучена и взаимоотношения между этими цитокинами не определены.
Известно использование лейкоцитарной массы для выделения вирусов при инаппаратных, острых и хронических формах флавирусных инфекций (патент РФ, МКИ5 C12N 7/00, 1836422 A3, от 23.04.91). При этом в пробу крови добавляют раствор гепарина, отстаивают ее в течение 45 мин при комнатной температуре, отбирают лейкоцитарную взвесь, осаждают ее с помощью центрифугирования и исследуют ее на наличие арбовирусных инфекций на модели клеточной культуры СПЭВ.
Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость диагностики арбовирусных инфекций, а также ее низкая достоверность.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является способ определения количества цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита, у лиц после укуса клеща, включающий исследование уровня цитокинов IFN-γ и IL-4 в периферической крови (Крылова и др. Динамика цитокинов при антигенемии вируса клещевого энцефалита у лиц после укуса клеща. // Цитокины и восполение, 2008, т.7, №1, с 35-39) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест - системы ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск).
Недостатком данного технического решения является то, что данным способом возможно лишь изучать динамику продукции цитокинов, вырабатываемых на фоне антигенемии вируса КЭ у лиц после укуса клеща, но не определять прогноз тяжести и длительности антигенемии.
Задачей данного изобретения является определение тяжести и длительности антигенемии, путем оценки комплекса иммунологических показателей у инфицированного лица вначале инфицирования вирусом.
Задача изобретения решается тем, что в предлагаемом способе прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита, включающем исследование в периферической крови уровня цитокинов IFN-γ и IL-4, согласно изобретению до введения противоклещевого иммуноглобулина у инфицированных лиц определяют уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов и при уровне спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пг/мл, а индуцированной - выше 122,2 пг/мл и уровне спонтанной продукции IL-4 ниже 23,5, а индуцированной ниже 25,3 пг/мл прогнозируют быструю элиминацию антигена.
Способ осуществляют следующим образом.
Для определения значения пороговых величин продукции цитокинов IFN-γ и IL-4 предварительно было проведено исследование периферической крови у 108 человек в возрасте от 19 до 57 лет с жалобами на укус клеща, у которых на 2-4 сутки в крови был выявлен антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Повторное обследование этих лиц через 1 месяц выявило, что у 78 пациентов антиген не обнаруживался (1-я группа - кратковременная антигенемия), у 30 пациентов антиген выявлялся через 1, 6 и более месяцев (2-я группа - длительная антигенемия).
Забор крови для определения концентрации цитокинов у инфицированных лиц проводили до введения противоклещевого иммуноглобулина. Все антигенположительные пациенты получили противоклещевой иммуноглобулин согласно СП 3.1.3.23-52-08 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита».
Периферическую кровь пациента забирали шприцем из локтевой вены в объеме 5 мл в стерильную пробирку, содержащую гепарин (25 ЕД/мл), и тщательно перемешивали. Затем 1 мл цельной гепаринизированной крови смешивали с 4 мл стерильной среды RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 0,3 мг/мл L-глутамина (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина, т.е. кровь разводили в 5 раз. Подготовленные таким образом образцы крови (по 1 мл) культивировали в круглодонных, стерильных пробирках в присутствии конканавалина А (КонА, Sigma, в конечной концентрации 10 мкг/мл), а также в отсутствие митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 48 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты. Содержание цитокинов IFN-γ и IL-4 в супернатантах оценивали с помощью иммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программных пакетов STATISTICA и EXCEL. Проверка нормальности распределения количественных признаков в выборке с помощью W-критерия Шапиро-Уилка, определение значимости различий между группами - t-критерий Стьюдента. Определялись параметры нормальных распределений, соответствующих выборкам: M1 и М2 - средние значения для 1-й и 2-й групп соответственно, а так же σ1 и σ2 - стандартные отклонения соответственно.
На основании проведенных исследований были определены пороговые величины (Кр) отдельно для каждого типа продукции цитокинов. Кр - это значение концентрации цитокина (пг/мл), при котором одинакова вероятность принадлежности продукции цитокина к одной из сравниваемых групп (с кратковременной и длительной антигенемией). Кр определялась как точка пересечения графиков нормальных распределений продукции цитокинов этих групп. На чертеже представлено определение пороговых величин Кр1, Кр2, Кр3, Кр4, построенных с использованием пакета «Statistica-6» (Вуколов Э.А. «Основы статистического анализа. Практикум по статистическим методам и исследованию операций с использованием пакетов STATISTICA и EXCEL». - М.: ФОРУМ: ИНФРА-М, 2004, - 464 с.). Результаты статистического анализа представлены в табл.1.
| Табл.1 | |||||
| Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов клетками периферической крови лиц, инфицированных вирусом КЭ | |||||
| Цитоки- ны |
Тип продукции | Группы | М±σ, пкг/мл | р | Кр, пг/мл |
| IFN-γ | спонтанная | 1 | 79,9±18,6 | <0,01 | Кр1=59,7 |
| 2 | 42,3±12,2 | ||||
| 3 | 52,6±17,5 | ||||
| индуцированная | 1 | 210,8±69,6 | <0,01 | Кр2=122,2 | |
| 2 | 80,6±20,7 | ||||
| 3 | 103,0±35,4 | ||||
| IL-4 | спонтанная | 1 | 17,3±4,2 | 0,016 | Кр3=23,5 |
| 2 | 30,8±6,4 | ||||
| 3 | 15,7±4,3 | ||||
| индуцированная | 1 | 19,0±4,7 | 0,020 | Кр4=25,3 | |
| 2 | 32,3±6,7 | ||||
| 3 | 17,4±4,4 | ||||
| Примечания: | |||||
| 1-я группа - пациенты с кратковременной антигенемией ВКЭ, 2-я группа - пациенты с длительной антигенемией ВКЭ, 3-я группа - условно здоровые люди; | |||||
| р - уровень значимости различий между 1-й и 2-й группами (при р<0,05 - различия между группами достоверны). |
Иллюстрации определения пороговой величины Кр для спонтанной продукции IFN-γ у лиц 1-й и 2-й групп представлены на чертеже.
Анализ полученных данных позволил разделить всех инфицированных пациентов на две группы: с кратковременной и длительной антигенемией. В 1-й группе (78 человек) при повторном обследовании (через 1 месяц) антиген ВКЭ не выявляли. Во 2-ю группу вошли 30 человек, у которых при повторных исследованиях через 1, 6 и более месяцев в крови продолжали выявлять антиген ВКЭ.
Предложенный способ прогнозирования длительности антигенемии ВКЭ основан на оценке комплекса пороговых величин уровней продукции IFN-γ и IL-4, выявляемых на 2-4 сутки после инфицирования. При уровнях продукции IFN-γ, превышающих Кр (для спонтанной продукции выше 59,7 пг/мл, индуцированной выше 122,2 пг/мл), и уровнях продукции IL-4 меньше Кр (для спонтанной продукции ниже 23,5 пг/мл, индуцированной - ниже 25,3 пг/мл) прогнозируют быструю элиминацию антигена. При уровнях продукции IFN-γ ниже Кр, а при выработке IL-4, превышающей Кр, прогнозируют длительный период элиминации антигена.
Таким образом, впервые предлагается способ прогнозирования периода антигенемии, который основан на оценке комплекса иммунологических показателей, выявленных в самом начале инфицирования вирусом КЭ, отражающих индивидуальный тип иммунного ответа пациента и показывающих уже после 2-4 дня инфекции дальнейший ход развития болезни. Впервые установлены уровни спонтанной и индуцированной продукции IFN-γ и IL-4, позволяющие оценить функциональный резерв иммунной системы конкретного лица, при которых можно прогнозировать длительность периода антигенемии ВКЭ уже на ранних стадиях инфицирования. Высокие уровни спонтанной и индуцированной КонА продукции IFN-γ при нормальном уровне продукции IL-4 в первую волну вирусемии свидетельствуют об адекватном Th1-ответе на инфекцию и прогнозируют быструю элиминацию антигена ВКЭ. Тогда как слабая продукция IFN-γ при, напротив, повышенном уровне IL-4 на 2-4 день инфицирования служит маркером иммунного ответа Th-2 типа и прогнозируют длительный период элиминации антигена ВКЭ. В зависимости от полученных результатов определяется тактика лечения пациента.
Способ прогнозирования длительности антигенемии ВКЭ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Пациент Л., 38 лет, не вакцинирован против КЭ, обратился через 3 дня после укуса клеща. В крови пациента в ИФА обнаружен антиген вируса КЭ.
Исследование крови, взятой при первом обращении и через 1 месяц (2-я проба), выявило следующие результаты (табл.2).
| Табл.2 | |||||
| Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов в крови пациента Л. | |||||
| Исследования крови | IFN-γ | IL-4 | |||
| Спонтан. | Индуцир. | Спонтан. | Индуцир. | ||
| пациент | 1-я проба | 72,2 | 165,9 | 20,9 | 23,8 |
| 2-я проба | 47,0 | 114,5 | 17,5 | 21,6 | |
| Контроль | 52,6±17,5 | 103,0±35,4 | 15,7±4,3 | 17,4±4,4 |
По данным продукции цитокинов, определенных на ранних сроках инфицирования у пациента Л. в сравнении с пороговыми величинами (см. табл.1), а именно по уровню спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пкг/мл, индуцированной продукции IFN-γ выше 122,2 пкг/мл, спонтанной и индуцированной продукции IL-4 ниже 24 пкг/мл, мы можем прогнозировать быструю элиминацию вируса. Это подтвердилось в дальнейшем, т.е. при повторном обращении (через месяц) в крови пациента Л. антиген вируса КЭ не обнаружен.
Пример 2. Пациентка О., 50 лет, не вакцинирована против КЭ, обратилась через 2 дня после укуса клеща. В крови пациента в ИФА обнаружен антиген ВКЭ. Исследование крови, взятой на 2-е сутки (1-я проба), через 1 месяц (2-я проба) и через 6 месяцев (3-я проба), показало следующие результаты (табл.3).
| Табл.3 | |||||
| Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов в крови пациентки О. | |||||
| Исследования крови | IFN-γ | IL-4 | |||
| Спонтан. | Индуцир. | Спонтан. | Индуцир. | ||
| пациент | 1-я проба | 50,6 | 96,4 | 27,5 | 29 |
| 2-я проба | 48,1 | 76,9 | 29,8 | 32,8 | |
| 3-я проба | 41,6 | 62,4 | 35 | 38,5 | |
| контроль | 52,6±17,5 | 103,0±35,4 | 15,7±4,3 | 17,4±4,4 |
По данным продукции цитокинов, определенных на ранних сроках инфицирования, а именно по уровню спонтанной продукции IFN-γ ниже 59,7 пкг/мл, индуцированной продукции IFN-γ ниже 122,2 пкг/мл и спонтанной и индуцированной продукции IL-4 выше 24 пкг/мл, можно прогнозировать длительный период элиминации вируса КЭ. Это подтвердилось в дальнейшем, т.е. в крови пациентки О. при повторных посещениях через 1 и 6 месяцев обнаружен антиген вируса КЭ.
Способ прогнозирования длительности антигенемии вируса клещевого энцефалита, включающий исследование в периферической крови уровня цитокинов IFN-γ и IL-4, отличающийся тем, что до введения противоклещевого иммуноглобулина у инфицированных лиц определяют уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов и при уровне спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пг/мл, а индуцированной - выше 122,2 пг/мл и уровне спонтанной продукции IL-4 ниже 23,5 пг/мл, а индуцированной - ниже 25,3 пг/мл прогнозируют быструю элиминацию антигена.
