Способ получения субстанции рекомбинантной l-аспарагиназы erwinia carotovora

Изобретение относится к области фармацевтики и биотехнологии. Предложен способ получения субстанции рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, согласно которому осуществляют ковалентную модификацию полиэтиленгликолем рекомбинантной L-аспарагиназы, выделенной из микробной массы генно-инженерного штамма-продуцента Escherichia coli BL(DE3)/pACYS-LANS(KM), у которого в плазмиде p/ACYS-LANS делетирован ген резистентности к ампициллину, модификацию осуществляют путем присоединения N-гидроксисукцинимидного эфира монометоксиполиэтиленгликоль-гемисукцината (mPEG-suc-NHS) к аминогруппам лизина аспарагиназы, полученный конъюгат подвергают хроматографической очистке и лиофилизации. Способ также предусматривает стабилизацию модифицированного и очищенного продукта. Изобретение обеспечивает получение новой эффективной субстанции ПЭГилированной аспарагиназы на основе фермента из Erwinia carotovora, которая может быть использована в качестве противоопухолевого средства. 3 з.п. ф-лы, 5 ил, 5 табл.

 

Изобретение относится в области фармацевтики и биотехнологии и может быть использовано для получения противоопухолевого химиотерапевтического лекарственного препарата L-аспарагиназы Ervinia carotovora.

Бактериальные аспарагиназы 2-го класса (К.Ф. 3.5.1.1) относятся к периплазматическим ферментам, осуществляющим гидролиз L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и аммония. Аспарагиназы катализируют также гидролиз L-глутамина, но с меньшей скоростью по сравнению с L-аспарагином. Бактериальные аспарагиназы применяются в качестве противоопухолевых препаратов при комбинированной химиотерапии острого лимфобластного лейкоза, миелобластной лейкемии, болезни Ходжкина и не-Ходжкинской лимфомы, меланосаркомы и множественной миеломы. В лейкозных клетках активность аспарагинсинтазы снижена или полностью отсутствует. В этом случае синтез белка и, соответственно, рост клеток опухоли зависит от уровня экзогенного аспарагина. Введение препарата аспарагиназы приводит к уменьшению уровня аспарагина в крови и тканях и, как следствие, к избирательному ингибированию пролиферации опухолевых клеток. Использование препаратов аспарагиназы в противоопухолевой терапии ограничено различными побочными эффектами. Одной из установленных причин токсичности аспарагиназы является L-глутаминазная активность фермента. Поэтому поиск новых бактериальных аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является важной задачей современной медицинской биотехнологии.

В настоящее время два наименее токсичных фермента, а именно нативный препарат L-аспарагиназы из Escherichia coli (EcA), а также модифицированный полиэтиленгликолем «пегилированный» («Oncaspar») и нативный фермент (ErA) Erw. chrysanthemi, нашли применение в онкотерапии (Umesh K.Narta, Shamsher S.Kanwar and Wamik Azmi, Pharmacological and clinical evaluation of l-asparaginase in the treatment of leukemia. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2007, 61(3):208-221).

Наименее токсичными признаны препараты, полученные из Erw. chrysanthemi, что указывает на важность исследования аспарагиназ рода Erwinia. Тем не менее, даже аспарагиназы штаммов Erwinia вызывают развитие иммунологической гиперчувствительности к L-аспарагиназе, проявляющееся в диапазоне от слабых аллергических реакций до анафилактического шока.

Известны способы очистки нативных аспарагиназ из штаммов Erwinia, включающих экстракцию фермента либо из микробных клеток при pH от 11,3 до 11,5 с последующим подкислением экстракта до pH 4,8, либо из ацетонового порошка с последующей хроматографической очисткой на различных сорбентах (например, US 5310670, 10.05.1994).

К недостаткам подобных способов выделения аспарагиназ Erwinia следует отнести трудности обработки больших объемов фракций на начальных стадиях очистки (щелочной лизис, получение ацетонового порошка), многостадийность процесса очистки и относительно невысокий выход очищенного целевого продукта.

Ранее нами был разработан генно-инженерный продуцент аспарагиназы Erwinia carotovora - (ECAR-LANS), продуцируемый штаммом Escherichia coli BL(DE3)/pACYS_LANS и разработан способ выделения и очистки фермента (RU 2224797, 27.02.2004).

Однако процесс выделения и очистки занимает значительное время, при этом выход целевого продукта следует признать недостаточно высоким, что приводит в высокой стоимости продукта.

Следует также отметить, что эффективность применения аспарагиназ в противоопухолевой терапии ограничена быстрой протеолитической деградацией фермента в крови. В связи с этим актуальным является получение модифицированных форм аспарагиназ штаммов Erwinia, устойчивых к протеолитической деградации в крови, обладающих низкой иммуногенностью при сохранении высокой ферментативной активности.

Известен препарат ПЭГ-L-аспарагиназы Escherichia coli, в котором аспарагиназа ковалентно связана с моно-метокси-ПЭГ (Keating M.J., Holmes R., Lerner S. Но D.H. (1993) Leuk. Lymphoma 10 Suppl. 153-157).

В сравнении с нативной аспарагиназой Е.coli ПЭГ-L-аспарагиназа обладает более низкой иммуногенностью и в 5 раза более длительным временем полувыведения из организма.

Однако в литературе отсутствуют данные о применении для химиотерапии острых лейкозов ПЭГилированной аспарагиназы, полученной на основе фермента из штаммов Erwinia.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения субстанции ПЭГилированной аспарагиназы (ПЭГ-аспарагиназы) на основе фермента из Erwinia carotovora, который пригоден для промышленного масштабирования, а полученный продукт может быть использован для химиотерапии лейкозов.

Поставленная задача решается описываемым способом получения субстанции рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, который включает модифицикацию L-аспарагиназы полиэтиленгликолем, при этом модифицикации подвергают рекомбинантную L-аспарагиназу, выделенную из микробной массы генно-инженерного штамма-продуцента Escherichia coli BL(DE3)/pACYS_LANS(KM), у которого в плазмиде p/ACYS_LANS делетирован ген резистентности к ампициллину, модификацию осуществляют путем присоединения N-гидроксисукцинимидного эфира монометоксиполиэтиленгликоль-гемисукцината (mPEG-suc-NHS) к аминогруппам лизина аспарагиназы, после модификации проводят хроматографическую очистку полученного конъюгата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с полиэтиленгликолем (ПЭГ-аспарагиназы) и его лиофилизацию.

Предпочтительно очищенную ПЭГ-аспарагиназу подвергают стабилизации с использованием в качестве стабилизатора соединения, выбранного из ряда: белки, аминокислоты, поливинилпирролидоны, поли- или моносахариды, полиалкиленоксиды, аминосахара, соли.

Способ предусматривает использование в качестве источника L-аспарагиназы микробной массы штамма, депонированного в ВКМП под коллекционным номером №В-10370, при этом выделение L-аспарагиназы осуществляют путем разрушения клеток на Френч-Прессе с последующим высаливанием целевого продукта сернокислым аммонием и хроматографической очисткой.

В предложенном способе используют рекомбинантную L-аспарагиназу Erwinia carotovora, нуклеотидная последовательность гена которой lanS, a также аминокислотная последовательность L-аспарагиназы представлены на фиг.1.

Использование для модификации рекомбинантной L-аспарагиназы, полученной с помощью штамма-продуцента Escherichia coli BL(DE3)/pACYS_LANS(XM), обеспечивает получение микробной массы штамма-продуцента, в клетках которого содержание аспарагиназы достигает 20% от тотального белка, что позволяет далее использовать высокоэффективные приемы разрушения клеток на Френч-Прессе с высаливанием целевого продукта из бесклеточного экстракта, что, в свою очередь, интенсифицирует процесс выделения и дальнейшей очистки L-аспарагиназы. Все эти приемы позволяют повысить выход фермента и удешевить стоимость полученной субстанции аспарагиназы.

Что касается выбора метода ковалентной модификации, то он основан на следующем.

Как известно, для модификации молекул белков наиболее подходящим и часто используемым производным полиэтиленгликоля является монометиловый эфир полиэтиленгликоля (мПЭГ), который может быть использован как в виде линейной молекулы с предпочтительной молекулярной массой от 2000 до 5000, так и в виде разветвленной молекулы большого молекулярного веса (см., например, Ton G.N., Fineb J.P., Kwonc G.S. Methoxypoly(ethylene glycol)-conjugated carboxypeptidase A for solid tumor targeting Part I: Synthesis and characterization. Journal of Controlled Release 2005, vol.104, pp.129-139, или Alexandre Learth Scares, Gledson Manso Guimarães, Bronislaw Polakiewicz, Ronaldo Nogueira de Moraes Pitombo and Jose Abrahão-Neto. Effects of polyethylene glycol attachment on physicochemical and biological stability of E.coli L-asparaginase International Journal of Pharmaceutics, 2002, vol.237(1-2), pp.163-170). Использование для получения ПЭГ-аспарагиназы импортных коммерческих препаратов монометокси-ПЭГ-п-нитрофенилкарбамата (mPEG-NPh) не представляется возможным ввиду их дороговизны.

Нами предложен другой подход к получению ПЭГ-аспарагиназы. Предварительно проводят синтез N-гидроксисукцинимидного эфира монометоксиполиэтиленгликоль-гемисукцината (mPEG-suc-NHS), а затем осуществляют его присоединение к аминогруппам аспарагиназы. Данный реагент выгодно отличается от монометилового эфира полиэтиленгликоль-п-нитрометилкарбамата тем, что сложноэфирная связь, соединяющая янтарный ангидрид и полиэтилгликоль, более стабильна, чем уреидильная связь, соединяющая карбоксильную группу и полиэтиленоксид в mPEG-NPh.

Перечень чертежей, иллюстрирующих изобретение:

на фиг.1 - нуклеотидная последовательность гена lanS и аминокислотная последовательность L-аспарагиназы Erwinia carotovora;

на фиг.2 - электрофоретический анализ образцов аспарагиназы в редуцирующих условиях после окрашивания геля красителем Кумасси - 250;

на фиг.3 - электрофоретический анализ образцов аспарагиназы в редуцирующих условиях после окрашивания геля серебром при нагрузке на лунку 5 мкг белка;

на фиг.4 - хроматограмма продуктов реакции пегилирования;

на фиг.5 (а, б, в) - противоопухолевая цитотоксическая активность субстанций L-аспарагиназ.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие осуществление изобретения и технический результат, достигаемый при его использовании.

Пример 1.

Стадия 1 - Выращивание продуцента Escherichia coli BL(DE3)/pACYS_LANS(KM) в 300-литровом ферментере

Штамм продуцент получают путем трансформации компетентных клеток реципиентного штамма E.coli BL21(DE3), («Novagen», Cat. №69387-3) плазмидой pACYC_LANS(KM).

Для создания банка клеток используют отдельные клоны трансформантов E.coli BL21(DE3)/pACYC_LANS(ICM), полученные на LB-агаре с канамицином. Для закладки на хранение колонию продуцента выращивают в LB-бульоне до середины логарифмической фазы роста и полученную суспензию вносят в криовиалы, содержащие 30%-ный раствор глицерина, в соотношении 1:1. Смесь тщательно перемешивают и быстро замораживают при температуре -70°С.

Для отработки методики приготовления посевного материала для ферментации в 300-литровом ферментере используется схема, обеспечивающая оптимальные временные характеристики ведения процесса культивирования в сочетании с минимальным количеством пассажей продуцента на этапе масштабирования. В качестве исходного материала для ферментации используют ночную культуру продуцента, выращенную на среде с глюкозой и канамицином, которую после пересева в свежую питательную среду выращивают до середины экспоненциальной фазы роста и вносят в 30-литровый инокулятор, после культивирования в котором продуцент поступает в 300-литровый ферментер. Культивирование осуществляют в питательной среде на основе LB-M9 бульона, при температуре 37°С, pH 7,0, при аэрации воздухом с расходом 150-70 л/мин. По окончании культивирования культуральную жидкость охлаждают до температуры 14-15°С проточной водопроводной водой, концентрируют в течение 3-х часов на мембранной установке (размер пор у мембран 0,25 мкм) до объема 30 л и сепарируют на сепараторе АСГ-3М при 9000 об/мин для получения влажной биомассы. Уровень активности аспарагиназы определяют методом прямой несслеризации.

В таблице 1 приведены результаты выращивания штамма-продуцента на колбах.

Таблица 1
Условия выращивания продуцента на колбах
Время индукции ОП 560 нм Активность МЕ/мг *(%) аспарагиназы в клетке
Вариант №1 40 мл LB, 180 об/мин
5 час 4,8 6,7 7,4
21 час 4,2 1,7 6,6
Вариант №2 160 мл LB, 90 об/мин
5 час 2,7 6,5 9,0
21 час 4,0 35,0 20,3
25 час 3,8 25,0 18,2
*содержание аспарагиназы в клетке (% от суммарного белка)

В таблице 2 приведены результаты культивирования штамма в 300-литровом ферментере.

Таблица 2
Результаты культивирования штамма в 300-литровом ферментере
Объем культуральной среды (л) Выход биомассы (г) Уровень активности аспарагиназы (МЕ/мл)
260 2500 140
260 1900 150

Стадия 2 - Очистка rec-ECAR_LANS из выращенной в ферментере биомассы и характеристика фермента

Вначале проводят получение бесклеточного экстракта.

Разрушение биомассы проводят на Френч-Прессе в лизирующем буфере (10 мМ ЭДТА, pH 9,5) при соотношении клеток и лизирующего буфера 1:4 и рабочем давлении 1580-1600 бар. Выход активности фермента на стадии бесклеточного экстракта составляет 80-93%.

Стадия 3 - Фракционирование сульфатом аммония и обессоливание

Процесс солевого фракционирования проводят при температуре +4°С. При насыщении бесклеточного экстракта сульфатом аммония до 20% удается избавиться центрифугированием от части балластных белков, при дальнейшем насыщении сульфатом аммония надосадочной жидкости в интервале от 20 до 60% образуется осадок, который содержит почти всю аспарагиназную активность.

Для обессоливания используют колонку с Sephadex G-50 (coarse) объемом 5,5 л (14,0×35,5 см) в 20 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 1 мМ глицина и 1 мМ ЭДТА, pH 5,6. Обессоливание проводят при скоростях потока около 30 мл/мин.

Стадия 4 - Ионообменная хроматография на CM-Sepharose FF

Обессоленную фракцию сульфат-аммонийного осадка разбавляют этим же буфером вдвое и наносят на колонку с CM-Sepharose FF (10×3,2 см), уравновешенную 20 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим 1 мМ глицина и 1 мМ ЭДТА, pH 5,6 со скоростью около 400 мл/час. Проскок контролируют, определяя ферментативную активность качественно (микрометодом) с использованием реактива Несслера. После нанесения образца колонку промывают 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 6,3 с целью удаления балластных белков. Элюцию целевого вещества проводят 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7,0 и 7,6. Завершающий этап хроматографической очистки полуфабриката аспарагиназы представляет собой стадию концентрирования образца, одновременно сопровождающуюся более глубокой степенью его очистки.

Стадия 5 - Подготовка препарата к лиофилизации

Концентрирование проводят на колонке с CM-Sepharose FF (2,5×10,0 см), уравновешенной 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 6,3. В качестве предколонки используют колонку с DEAE-сорбентом CnC-DEAE-Био (5×6 см). Колонки с DEAE-сорбентом также уравновешивают 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 6,3.

Целевую фракцию, полученную с 250-миллилитровой колонки с CM-Sepharose FF, разбавляют равным объемом 20 мМ KH2PO4, при этом pH фракции снижается с 7,0 до 6,3-6,4. Нанесение образца осуществляют через предколонку с DEAE-сорбентом на основную колонку с CM-Sepharose FF со скоростью потока 8 мл/мин. После нанесения образца колонку тщательно отмывают 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 6,3 до базовой линии, а затем элюируют белок 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7,6.

Выход целевого вещества на этой стадии составляет 95-97%.

В качестве стабилизирующей добавки используют глюкозу, которую добавляют в препарат перед лиофилизацией до конечной концентрации 0,5%.

Стадия 6 - лиофилизация.

Лиофилизацию проводят на лиофильной сушке Alpha ("Christ", Switzerland). В одних опытах концентраты, содержащие 0,5% глюкозы, лиофилизируют на полке при -10°С в течение 2 суток, затем полку нагревают до температуры 30°С. В других лиофилизацию проводят в колбах при комнатной температуре. Потери аспарагиназной активности при лиофилизации в обоих случаях составляют от 5 до 10%.

Таким образом, получен полупродукт - субстанция аспарагизазы, не подвергнутая модификации полиэтиленгликолем.

Характеристики полученной субстанции аспарагиназы

Протокол выделения образца субстанции представлен в таблице 3.

Таблица 3
Протокол выделения аспарагиназы
Этап очистки Белок общий Активность аспарагиназы Выход, %
Общая (ME) Удельная (МЕ/мг белка)
Суспензия клеток - 971 960 - 100
Бесклеточный экстракт - 894 800 - 92
Сульфат-аммонийная фракция (20-60%) + Обессоливание (103 г сульф. осадка) 7437 855 324 115 88
Хроматография на СМ-Sepharose 1339 641 493 479 66
Концентрирование на СМ-Sepharose при pH 6,3 1308 612 334 468 63
Лиофилизация 1277,6 544 297 426 56
*Количество биомассы - 128 г (984 718 ME). Лизирующий буфер 10 мМ ЭДТА, pH 9,5 Соотношение биомасса: лизирующий буфер 1:4 Рабочее давление 1580-1600 бар

Выход фермента на конечном этапе очистки составил 56%, что примерно на 20% ниже, чем при использовании лабораторной методики, что связано с масштабированием процесса выделения целевого продукта и увеличением количества этапов очистки.

Определение чистоты, гомогенности и молекулярной массы препарата рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora

- По данными электрофореза в SDS-PAGE при нагрузке белка 10 или 40 мкг на лунку и окраске геля красителем Кумасси R-250 препараты аспарагиназы представлены в основном одной полосой (фиг.2). В случае окраски геля серебром при нагрузке белка 5 мкг на лунку также выявляется одна основная полоса с молекулярной массой 34-35 кДа и несколько минорных полос с меньшим молекулярным весом (от 15 до 30 кДа) (фиг.3), а также в растворе аспарагиназы E.coli производства немецкой фирмы «Medac». Эти низкомолекулярные компоненты, количество которых возрастает при хранении фермента, являются, по-видимому, продуктами деградации аспарагиназы.

- В денатурирующих условиях по результатам электрофореза в SDS-PAGE аспарагиназа представлена мономером с молекулярной массой 34±2 кДа.

- В нативных условиях по данным гель-фильтрации на колонке с "SuperoseR 12" аспарагиназа имеет молекулярную массу 67,6±3 кДа.

Очищенная субстанция rec-ECAR-LANS полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим рекомбинантным препаратам (содержание примесных бактериальных белков E.coli и эндотоксинов) (см. таблицу 4).

Таблица 4
Характеристика полуфабриката L-аспарагиназы
Параметры Значения
Концентрация (мг/мл) 36,8
Содержание мономера по данным SDS-ЭФ (%) 92
Гомогенность L-аспарагиназы в нативных условиях по данным гель-фильтрационной хроматографии 98,10
Содержание эндотоксинов (еЭ/мг) 1,63
Содержание белков Е.coli (нг/мг) 58
Специфическая удельная активность (МЕ/мг белка) 386,9

Rec-ECAR-LANS получена в близком к гомогенному состоянии, с удельной активностью, соответствующей бактериальной аспарагиназе Erwinia carotovora. L-глутаминазная активность rec-ECAR-LANS составляет примерно 5% от L-аспарагиназной, что позволит минимизировать побочные токсические эффекты при использовании субстанции, связанные с гидролизом L-глутамина.

Стадия 7 - Получение исходных реагентов для синтеза ПЭГилированной формы rec-ECAR_LANS

1) Синтез монометокси-ПЭГ5000-гемисукцината. Для получения ПЭГ-гемисукцината 50 г монометокси-ПЭГ (мПЭГ) растворяют в абсолютном бензоле и тщательно упаривают бензол в вакууме водоструйного насоса. Благодаря способности бензола образовывать азеотропную смесь с водой при этом происходит удаление следов воды из полимера. Эту процедуру повторяют трижды, после чего полимер растворяют в абсолютном хлороформе и добавляют 10-кратный молярный избыток янтарного ангидрида и абсолютного триэтиламина. Реакционную смесь выдерживают в течение 3-х суток при 60°С, после чего фильтруют через стеклянный фильтр и упаривают хлороформ на роторном испарителе. Далее полученный карбоксилированный мПЭГ растворяют в 30 мл 1 М соляной кислоты, промывают диэтиловым эфиром и экстрагируют модифицированный мПЭГ в хлороформ (300 мл). Хлороформный слой промывают несколько раз 1 М HCl для удаления янтарной кислоты. Затем хлороформный раствор полимера сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе. На последней стадии полученный продукт растворяют в воде и диализуют против воды, используя бензоилированные мембраны, не пропускающие вещества с молекулярным весом более 2 кДа. Полученный раствор лиофильно высушивают. Полученный продукт представляет собой белый порошок без запаха. Выход продукта составляет 50%.

2) Для получения N-гидроксисукцинимидного эфира ПЭГ-гемисукцината 50 г препарата полиэтиленгликоль-гемисукцината растворяют в 100 мл абсолютного бензола и упаривают в вакууме. Процедуру повторяют трижды для удаления следов воды в препарате ПЭГ. Далее полученный препарат растворяют в 200 мл свежеперегнанного хлористого тионила, кипятят 4 часа с обратным холодильником, выдерживают еще 20 часов при комнатной температуре, после чего хлоритый тионил отгоняют на роторном испарителе. Получившийся продукт представляет собой хлорангидрид mPEG-suc, mPEG-suc-Cl, который сразу же пускают в синтез N-гидроксисукцинимидного эфира. Препарат растворяют в 300 мл абсолютного хлористого метилена и помещают в капельную воронку, присоединенную к трехгорлой колбе. В колбу помещают раствор 1,5 г (8,7 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 1 мл (7 ммоль, 0,7 г) абсолютированного триэтиламина в хлористом метилене и охлаждают в ледово-солевой бане до -10°С. Раствор mPEG-suc-Cl осторожно прибавляют к раствору N-гидроксисукцинимида при интенсивном перемешивании, следя за тем, чтобы температура не поднималась выше -5°С. После прибавления всего хлорангидрида реакционную смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре еще на 18 часов, после чего продукт высаживают гексаном и осадок выделяют на центрифуге. Далее продукт промывают трижды гексаном и высушивают в вакуум-эксикаторе в вакууме водоструйного насоса над щелочью. Продукт хранят в эксикаторе над щелочью во избежание контакта с парами воды.

Стадия 8 - Получение ПЭГилированной формы аспарагиназы

Сухой лиофилизованный порошок препарата аспарагиназы помещают в сосуд, снабженный магнитной мешалкой. К препарату фермента с концентрацией 35 мг/мл в 20 мМ K2PO4 добавляют 0.5 М борат pH 9.5 (1/5 по объему) для доведения pH среды до 8,5 (оптимально для модификации N-гидроксисукцинимидными эфирами), после чего раствор фермента прибавляют к сухому mPEG-suc-NHS. Раствор интенсивно перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре до полного растворения препарата, после чего охлаждают до +4°С и продолжают инкубацию на холоду при постоянном перемешивании в течение 4 час. После этого фермент отделяют от ПЭГ с помощью гель-хроматографии на колонке с Sephadex G-50.

Стадия 9 - Удаление компонентов реакционной смеси с получением очищенной ПЭГ-аспарагиназы

Очистку ПЭГ-аспарагиназы проводят в три этапа: реакционную смесь после реакции пегилирования подвергают диализу через мембраны с исключенной молекулярной массой 100 кДа против калий-фосфатного буфера, pH 7,2, в течение суток, после чего полученный препарат подвергают двухстадийной хроматографической очистке на колонке с DEAE-Sepharose FF и на колонке с Диасфером СТ-150.

Хроматография на колонке с DEAE-Sepharose FF: пробу после диализа объемом 41 мл, содержащую около 500 мг ПЭГ-аспарагиназы, наносят на колонку размером 25×20 мм (объем 10 мл), уравновешенную 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7,2. Скорость потока 1 мл/мин. После пропускания пробы элюцию ПЭГ-аспарагиназы проводят тем же буфером. Целевое вещество определяется в проскоке и составляет фракцию объемом 46 мл.

Хроматография на колонке с Диасфером СТ-150: пробу объемом 42 мл наносят на колонку размером 25×70 мм (объем 37 мл), уравновешенную 20 мМ калий-фосфатным буфером, pH 7,2. Скорость потока 3 мл/мин. После нанесения пробы элюцию осуществляют тем же буфером. Целевое вещество определяется в проскоке и составляет фракцию объемом 38 мл с концентрацией белка 6,8 мг/мл и удельной активностью ПЭГ-аспарагиназы 350 МЕ/мг.

Таким образом, выход целевого вещества после стадии хроматографической очистки составляет около 50%.

Пример 2 - Стабилизация очищенной ПЭГ-аспарагиназы с использование различных стабилизаторов

Объединенные фракции, содержащие очищенную ПЭГ-аспарагиназу, диализуют против 20 объемов 20 мМ натрий фосфатного буфера, pH 7,2 при температуре 6±3°С. Полученный диализат помещают в пластиковые или стеклянные флаконы с силиконизированной поверхностью, добавляют твин-80 или твин-20 до конечной концентрации 0,002% и стабилизаторы.

В качестве стабилизаторов опробованы белки, аминокислоты, поливинилпироллидоны, полисахариды, полиалкиленоксиды, моносахариды, аминосахара, соли (данные сведены в табл.5).

В конкретных примерах использованы следующие вещества. В качестве поливинилпиролидона используют поливинилпирролидон-12000 в концентрации 3-6%, в качестве белка - человеческий сывороточный альбумин в концентрации 1%, в качестве аминокислоты используют L-аргинин в концентрации 2-6%, в качестве полиалкиленоксида используют полиэтиленгликоль 1500 в концентрации 2-5%, в качестве полисахарида используют декстран-60 в концентрации 3-6%, в качестве моносахарида используют маннит в концентрации 4-7%, в качестве аминосахаров используют глюкозамин в концентрации 6-10%, в качестве соли используют натрий хлористый в концентрации 0,9%.

Стабильность полученных композиций исследована методом ускоренного хранения при температуре (36±2)°С в течение 2 недель. Через 2 недели отбирают аликвоты и анализируют биологическую активность ПЭГ-аспарагиназы. Длительность хранения при температуре (36±2)°С пересчитывают на длительность хранения при температуре (6±2)°С по формуле

Tx=TexpxA(texp-tk)/10,

где Tx - ориентировочный срок хранения (недели) при температуре (6±2)°С;

Texp - срок хранения в эксперименте (36±2)°С;

texp - температура хранения в эксперименте (36±2)°С;

tk - температура хранения (6±2)°С;

А - константа, равная 3.

Из формулы следует, что 2 недели хранения при температуре (36±2)°С соответствуют 54 неделям (около года) хранения при температуре (6±2)°С.

В таблице 5 приведены данные по хранению препаратов стабилизированной ПЭГ-аспарагиназы разными стабилизаторами.

Таблица 5
Влияние различных веществ на стабильность препарата ПЭГ-аспарагиназы в 20 мМ Na-фосфатном буфере, содержащем 0,002% Твина-80 при хранении в течение 2 недель при температуре (36±2)°С.
Исходная активность ПЭГ-аспарагиназы, серия 251109 (МЕ/мг) Добавляемое вещество Концентрация (%) (W/V) Активность после хранения (%)
320 NaCl 0,9 350
Декстран 60 3-6 400
Полиэтиленгликоль 1500 2-5 293
Поливинилпирролидон 12000 3-6 376
Маннитол 4-7 370
Глюкозамин 6-10 239
Человеческий сывороточный альбумин 1-2 260
L-аргинин 2-6 320

Полученный нами целевой продукт был исследован на возможность его применения для химиотерапии.

Проведена оценка противоопухолевой цитотоксической активности субстанции ПЭГилированной рекомбинантной аспарагиназы в отношении эукариотических клеток.

В экспериментах использованы линии лейкозных клеток человека К-562 (хронический миелоидный лейкоз), Jurkat и Molt-4 (острый лимфобластный лейкоз). При определении противоопухолевой активности препарата ПЭГ-аспарагиназы и L-аспарагиназы Erwima carotovora препаратом сравнения служит L-аспарагиназа E.coli («Medac», Германия).

В опытах использована ПЭГ-аспарагиназа, полученная при молярном соотношении ПЭГ/белок, равным 1:25, очищенная на колонке с Sephadex G-50. Удельная активность субстанции 314 МЕ/мг белка. Концентрация белка 1,38 мг/мл.

Противоопухолевую активность L-аспарагиназ определяют через 72 часа инкубации клеток К-562, Jurkat и Molt-4 с субстанцией аспарагиназ. Результаты, представленные на фиг.5 (а, б, в), показывают, что противоопухолевая активность ПЭГ-аспарагиназы несколько ниже, чем противоопухолевая активность других L-аспарагиназ. Значительное снижение числа жизнеспособных клеток К-562 и Jurkat наблюдается уже при концентрации ферментов Erwinia carotovora и E.coli 0,5 МЕ/мл, тогда как ПЭГ-аспарагиназы вызывает аналогичное подавление роста клеток при концентрации 5,0 МЕ/мл для линии клеток К-562 и 2,0 МЕ/мл для Jurkat. Линия клеток Molt-4 оказалась менее чувствительной к действию препарата ПЭГ-аспарагиназы по сравнению с К-562 и Jurkat.

Из представленных данных следует, что полученная заявленным способом ПЭГ-аспарагиназа Erwinia carotovora обладает противоопухолевой цитотоксической активностью в отношении исследованных линий лейкозных клеток человека.

Эффективность субстанции, полученной заявленным способом, позволяет рекомендовать ее в качестве основы для создания противоопухолевых лекарственных средств, при этом разработанный нами способ является простым и пригодным для промышленного масштабирования.

1. Способ получения субстанции рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora, заключающийся в том, что осуществляют ковалентную модификацию L-аспарагиназы полиэтиленгликолем, причем модификации подвергают рекомбинантную L-аспарагиназу, выделенную из микробной массы генно-инженерного штамма-продуцента Escherichia coli BL(DE3)/pACYS-LANS(KM), у которого в плазмиде p/ACYS-LANS делетирован ген резистентности к ампициллину, модификацию осуществляют путем присоединения N-гидроксисукцинимидного эфира монометоксиполиэтиленгликоль-гемисукцината (mPEG-suc-NHS) к аминогруппам лизина аспарагиназы, проводят хроматографическую очистку полученного конъюгата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora с полиэтиленгликолем (ПЭГ-аспарагиназы) и лиофилизацию.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищенную ПЭГ-аспарагиназу дополнительно подвергают стабилизации с использованием в качестве стабилизатора соединения, выбранного из ряда: белки, аминокислоты, поливинилпирролидоны, поли- или моносахариды, полиалкиленоксиды, аминосахара, соли.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника L-аспарагиназы используют микробную массу штамма, депонированного в ВКМП под коллекционным номером №В-10370, при этом выделение L-аспарагиназы осуществляют путем разрушения клеток на Френч-Прессе с последующим высаливанием целевого продукта сернокислым аммонием и хроматографической очисткой.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ковалентной модификации полиэтиленгликолем подвергают рекомбинантную L-аспарагиназу Erwinia carotovora, нуклеотидная последовательность гена которой lanS и аминокислотная последовательность L-аспарагиназы представлены на фиг.1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для повышения эффективности лабораторной селекции микроорганизмов-продуцентов L-аспарагиназ и найти применение при разработке новых лекарственных противоопухолевых ферментных препаратов.

Изобретение относится к генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицинской практике. .

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантные варианты рекомбинантной L-аспарагиназы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes, в которой аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток серина либо аминокислотный остаток валина в положении 23 заменен на остаток глутамина, а аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток треонина. Изобретение позволяет получить варианты L-аспарагиназы с улучшенной устойчивостью к протеолизу под действием трипсина по сравнению с немодифицированным рекомбинантным белком и различным уровнем глутаминазной активности при полном сохранении аспарагиназной активности, что делает их привлекательными объектами для разработки на их основе новых противоопухолевых терапевтических препаратов. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 11 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к применению аспарагиназы и способу приготовления пищевого продукта с использованием данной аспарагиназы. Аспарагиназу, аминокислотная последовательность которой имеет по крайней мере 90% гомологию с аминокислотной последовательностью <SEQ ID NO:2>, остаточная активность которой после инкубации продолжительностью 5 минут при температуре в диапазоне от 70°C до 100°C составляет 200 ед./мг, применяют для приготовления пищевого продукта, который содержит аспарагин. Способ приготовления пищевого продукта включает инкубирование пищевых продуктов с указанной аспарагиназой при температуре инкубации, составляющей по крайней мере 50°C. В случае необходимости, нагревают пищевые продукты до температуры, лежащей по крайней мере на 10°C выше температуры инкубации. При необходимости, выделяют аспарагиназу из пищевых продуктов или инактивируют амидогидролазу. В случае необходимости, повторяют применение аспарагиназы. Предложенное изобретение позволяет снизить содержание аспарагина или акриламида в пищевых продуктах, содержащих аспарагин. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 11 табл., 4 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый фермент аспарагиназу, полученную из Basidiomycete. Изобретение относится также к способу гидролиза одного из L-аспарагина или L-глутамина, включающего обработку субстрата, содержащего одно из L-аспарагина или L-глутамина, ферментом аспарагиназой. Изобретение относится также к способу уменьшения образования акриламида в пищевом веществе, содержащем L-аспарагин, включающему нанесение на пищевое вещество, содержащее L-аспарагин фермента аспарагиназы и нагревание вещества, содержащего L-аспарагин. Изобретение позволяет расширить арсенал ферментов, относящихся к аспарагиназам, а также уменьшить образование канцерогенного акриламида в термически обработанной пище. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой гибридный белок на основе мутантной рекомбинантной L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes с пониженной глутаминазной активностью и повышенной устойчивостью к действию трипсина, слитой с N-концевой аминокислотной последовательностью гепарин-связывающего пептида. Изобретение относится также к штаммам-продуцентам и к способу получения этого гибридного белка. Изобретение позволяет расширить ассортимент гибридных белков на основе аспарагиназы, обладающих противоопухолевой активностью. 4 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 27 пр.

Изобретение относится к дрожжам для снижения акриламида или аспарагина в пищевом продукте. Дрожжи трансформированы по меньшей мере двумя из следующих модификаций: а) делеция или инактивация гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или введение молекулы нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии; b) введение молекулы нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и c) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Предложены также варианты способа снижения количества аспарагина или акриламида в пищевых продуктах и пищевые продукты, обладающие сниженным содержанием акриламида, полученные с использованием указанных дрожжей. Изобретение обеспечивает улучшенную способность снижать концентрацию акриламида в пищевых продуктах, приготовленных посредством нагревания. 7 н. и 26 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области фармацевтики и биотехнологии

Наверх