Способ биоиндикации радиационного воздействия на щитовидную железу
Владельцы патента RU 2442161:
Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова" МЧС России (RU)
Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека" (BY)
Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины. Предложен способ выявления факта воздействия мутагенных и, в первую очередь, радиационных факторов на щитовидную железу. В качестве исследуемого материала используют тироциты из пунктата щитовидной железы. В качестве критерия хромосомных аберраций регистрируют аномалии ядер, проявляющиеся в виде межъядерных хромосомных мостов длиной от 5 мкм и более в клеточных кластерах пунктата. При наличии аномалий ядер устанавливают факт наличия предшествующего воздействия радиоактивного излучения на щитовидную железу пациента. 4 табл., 2 ил.
Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к медицине, а точнее к способам выявления факта воздействия мутагенных и, в первую очередь, радиационных факторов на щитовидную железу.
Для целей определения фактов радиационного воздействия используются способы биологической индикации. К способам биоиндикации относятся микроядерный тест, методы определения частоты хромосомных аберраций в клетках. Суть методов сводится к выявлению специфических маркеров, возникающих в биологических объектах под действием ионизирующего излучения.
Известен способ определения факта радиационного воздействия, суть которого заключается в определении частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови. Данный метод принят МАГАТЭ в 1986 г. в качестве официального метода биологической дозиметрии. Основой радиационной биодозиметрии по аберрациям хромосом является количественная зависимость образования аберраций в лимфоцитах периферической крови и костном мозге от дозы излучений. Из всех видов аберраций хромосом для целей диагностики радиационных поражений чаще всего используется подсчет дицентриков, ацентрических фрагментов и центрических колец в культуре клеток периферической крови или костного мозга пациента [1].
Недостатками способа являются:
- возможность использовать метод только по прошествии короткого промежутка времени после радиационного воздействия, так как аберрантные клетки с течением времени постепенно элиминируются из циркулирующей крови;
- сложность в проведении цитогенетического теста, так как он требует культивирования клеток in vitro.
Наиболее близким является способ экспресс-выявления облученных пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций, включающий в себя определение хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, при этом в качестве исследуемого материала используют мазки крови in vivo, а в качестве критерия хромосомных аберраций регистрируют лимфоциты с аномалиями ядер типа "хвостов" и по повышенной частоте встречаемости таких лимфоцитов (от 0,8% и выше) выявляют пациентов с повышенными частотами хромосомных аберраций в популяциях лимфоцитов периферической крови [2].
Недостатком известного способа является:
- биоиндикацию воздействия радиации проводят в популяциях лимфоцитов периферической крови, характеризующуюся высоким пролиферативным потенциалом. По прошествии ряда клеточных делений лимфоциты с хромосомными аберрациями элиминируются и по этой причине частота встречаемости аномальных ядер, манифестирующих радиационное воздействие, снижается. Информативность известного метода адекватна лишь на протяжении определенного (до 6 лет) периода после лучевых воздействий;
- популяции лимфоцитов различаются по продолжительности нахождения в организме. Поэтому показатель «частота встречаемости лимфоцитов с аномальными ядрами» со временем претерпевает изменения, как правило, в сторону снижения, что затрудняет интерпретацию данных тестовых исследований;
- популяции лимфоцитов, в которых проводят биоиндикацию радиационных воздействий известным способом, являются одноядерными клетками. Поэтому наличие «хвостатых» ядер в качестве маркера дицентрических хромосом имеет косвенный характер;
- по частоте встречаемости лимфоцитов с «хвостатыми» ядрами нельзя судить о локальности характера облучения организма человека радиоактивным излучениям.
Задачей предлагаемого изобретения является выявление факта облучения щитовидной железы организма человека, возникающего преимущественно после радиационных воздействий изотопами йода.
Задача решается за счет того, что способ биоиндикации радиационного воздействия на щитовидную железу пациентов, подвергшихся воздействию радиоактивного облучения (радиоактивные изотопы йода), включающий определение хромосомных аберраций в исследуемом материале, когда в качестве критерия хромосомных аберраций регистрируют аномалия ядер и по повышенной частоте встречаемости выявляют пациентов с повышенным содержанием хромосомных аберраций в популяциях клеток, причем в качестве исследуемого материала используют тироциты из пунктата щитовидной железы, аномалии ядер выявляют в виде «межъядерных хромосомных мостов» длиной от 5 мкм и более в клеточных кластерах пунктата, при наличии аномалий ядер устанавливают факт наличия предшествующего воздействия радиоактивного излучения на щитовидную железу пациента.
Известно, что истинным маркером радиационного воздействия на клетки организма является образование дицентрических и кольцевых хромосом, которые выявляют при помощи классического цитогенетического метода. В процессе деления центромеры дицентрических хромосом ориентируются к оппозитным полюсам, а затем расходятся к ним, в результате чего и формируются хромосомные мосты. Внешне межъядерные хромосомные мосты могут выглядеть по-разному.
На фиг.1 представлены хромосомные мосты различных морфологических видов. Наиболее вероятные цитогенетические механизмы возникновения хромосомных мостов представлены на фиг.2, где 1 - метафаза, 2 - ана-телофаза, 3 - интерфаза.
После завершения митоза мосты могут сохраняться в интерфазных клетках. В ряде случаев ана- и телофазные мосты приводят к задержке цитотомии, что сопровождается возникновением двуядерных клеток с мостом. В других случаях, после завершения цитотомии формируются две одноядерные клетки, удерживаемые рядом посредством моста [3].
Пример 1: Больной А., 40 лет, место жительства Российская Федерация, Ленинградская область, факт радиационного воздействия не установлен. Клинический диагноз: многоузловой зоб. Пациенту под контролем ультразвукового исследования проведена тонкоигольная аспирационная биопсия узловых образований правой доли щитовидной железы. По традиционной методике подготовлены цитологические препараты, окрашены по Романовскому-Гимзе. Цитологическое заключение: многоузловой зоб с умеренно выраженной пролиферацией тироцитов. Аномалии ядер в виде межъядерных хромосомных мостов выявлены не были. Принимая во внимание отсутствие аномалий ядер, факт радиационного воздействия исключен.
Пример 2: Больная Н., 42 года, место жительства Российская Федерация, Ленинградская область, факт радиационного воздействия не установлен. Клинический диагноз: подозрение на рак щитовидной железы. Пациентке под контролем ультразвукового исследования проведена тонкоигольная аспирационная биопсия узлового образования правой доли щитовидной железы. По традиционной методике подготовлены цитологические препараты, окрашены по Романовскому-Гимзе. Цитологическое заключение: папиллярный рак щитовидной железы с наличием внутриядерных вакуолей, инклюзий и единичных псаммомных телец. Цитологическое заключение подтверждено гистологически. Выявлены аномалии ядер в виде межъядерных хромосомных мостов в количестве 2 на 1000 клеток. Длина хромосомных мостов составила 2 и 4 мкм. Так как длина межъядерных хромосомных мостов не превышает 5 мкм, то факт радиационного воздействия в анамнезе исключен.
Пример 3: Больной К., 39 лет, место жительства Республика Беларусь, Гомельская область. В 1986 году после аварии на ЧАЭС проведено измерение мощности экспозиционной дозы над щитовидной железой, расчетная поглощенная доза облучения составила 1,2 Гр. Клинический диагноз: одноузловой зоб. Пациенту под контролем ультразвукового исследования проведена тонкоигольная аспирационная биопсия узлового образования левой доли щитовидной железы. По традиционной методике подготовлены цитологические препараты, окрашены по Романовскому-Гимзе. Цитологическое заключение: одноузловой зоб со слабовыраженной пролиферацией тироцитов. Выявлены аномалии ядер в виде межъядерных хромосомных мостов в количестве 6 на 1000 клеток. Длина хромосомных мостов варьировала в пределах от 15 до 41 мкм. Наличие аномалий ядер в виде межъядерных хромосомных мостов с длиной более 5 мкм свидетельствовала о наличии факта радиационного воздействия.
Пример 4: Больной Р., 41 год, место жительства Республика Беларусь, Гомельская область. В 1986 году после аварии на ЧАЭС проведено прямое измерение мощности экспозиционной дозы над щитовидной железой, расчетная поглощенная доза облучения составила 1,7 Гр. Клинический диагноз: подозрение на рак щитовидной железы. Пациенту под контролем ультразвукового исследования проведена тонкоигольная аспирационная биопсия узлового образования правой доли щитовидной железы. По традиционной методике подготовлены цитологические препараты, окрашены по Романовскому-Гимзе. Цитологическое заключение: фолликулярный вариант папиллярного рака щитовидной железы. Цитологическое заключение подтверждено гистологически. Выявлены аномалии ядер в виде межъядерных хромосомных мостов в количестве 8 на 1000 клеток. Длина хромосомных мостов варьировала в пределах от 7 до 46 мкм. Наличие аномалий ядер в виде межъядерных хромосомных мостов с длиной более 5 мкм подтверждает факт радиационного воздействия.
Предложенным способом было обследовано 35 пациентов с диагнозом узловой зоб щитовидной железы, 30 пациентов с диагнозом папиллярный рак щитовидной железы, проживающих в Ленинградской области Российской Федерации (факт радиационного воздействия в анамнезе отсутствовал), 29 пациентов с диагнозом узловой зоб щитовидной железы и 31 пациент с диагнозом папиллярный рак щитовидной железы, проживающих в Гомельской области Республики Беларусь. Всем больным из Гомельской области в апреле-мае 1986 года после аварии на ЧАЭС проведены прямые измерения мощности экспозиционной дозы над щитовидной железой, средняя поглощенная доза составила 1,13±0,25 Гр (min 0,2 - max 2,2 Гр).
В таблицах 1 и 2 представлены данные о наличии признака (межъядерные хромосомные мосты) в зависимости от места проживания для узлового зоба и папиллярного рака щитовидной железы соответственно.
| Таблица 1 | |||
| Показатели встречаемости аномалий ядер (межъядерные хромосомные мосты) в тироцитах щитовидной железы при узловом зобе в зависимости от места проживания | |||
| Признак | Область проживания | χ2 (р) | |
| Гомельская | Ленинградская | ||
| Наличие мостов | 26 | 6 | 33,36 (0,0…01) |
| Отсутствие мостов | 3 | 29 |
| Таблица 2 | |||
| Показатели встречаемости аномалий ядер (межъядерные хромосомные мосты) в тироцитах щитовидной железы при папиллярном раке в зависимости от места проживания | |||
| Признак | Область проживания | χ2 (р) | |
| Гомельская | Ленинградская | ||
| Наличие мостов | 27 | 17 | 7,02 (0,008) |
| Отсутствие мостов | 4 | 13 |
При сопоставлении частот с использованием критерия χ2 установлено, что в Гомельской области частота признака «наличие мостов» при зобе и при раке статистически значимо (р<0,001 и р=0,008 соответственно) превышало аналогичный признак в Ленинградской области.
В таблице 3 представлены средние значения частоты встречаемости тироцитов с межъядерными хромосомными мостами (‰) в зависимости от места проживания и нозологической формы патологии щитовидной железы.
| Таблица 3 | |||
| Частота выявления аномалий ядер (межъядерные хромосомные мосты) в тироцитах щитовидной железы при различных нозологических формах патологии в зависимости от места проживания | |||
| Нозологическая форма | Область проживания | Уровень значимости (р) | |
| Гомельская, M±m | Ленинградская, M±m | ||
| Узловой зоб | 5,25±0,97 | 1,12±0,28 | 0,0…01 |
| Папиллярный рак | 4,69±0,69 | 1,10±0,23 | 0,0…01 |
При сравнении частот встречаемости тироцитов с межъядерными хромосомными мостами с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни определено статистически значимое превышение данного показателя как при узловом зобе, так и при раке щитовидной железы (р<0,001).
При определении длины хромосомных мостов были отмечены аномально длинные мосты (более 5 мкм) у всех обследованных пациентов, проживающих на территории Гомельской области, вне зависимости от нозологической формы патологии щитовидной железы. Как видно из таблицы 4, где представлены показатели признака «наличие/отсутствие» аномалий ядер (межъядерные хромосомные мосты) длиной 5 мкм и более в тироцитах щитовидной железы при различных нозологических формах патологии в зависимости от места проживания, у пациентов из Ленинградской области аномально длинных мостов, как при зобе, так и при раке щитовидной железы выявлено не было.
| Таблица 4 | |||
| Показатели признака «наличие/отсутствие» аномалий ядер (межъядерные хромосомные мосты) длиной 5 мкм и более в тироцитах щитовидной железы при различных нозологических формах патологии в зависимости от места проживания | |||
| Признак | Область проживания | χ2 (p) | |
| Гомельская | Ленинградская | ||
| Наличие мостов ≥5 мкм | 53 | 0 | 7,02 (0,008) |
| Отсутствие мостов ≥5 мкм | 0 | 23 |
Таким образом, показателем наличия факта радиационного воздействия в анамнезе явились два параметра:
- частота встречаемости аномалий ядер в виде межъядерных хромосомных мостов, превышающая 2‰;
- наличие аномалий ядер в виде межъядерных хромосомных мостов длиной 5 мкм и более.
Способ биоиндикации радиационного воздействия на щитовидную железу легко воспроизводим в клинико-диагностических лабораториях не только научно-исследовательских центров, но и малооснащенных лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Способ позволяет без дополнительных материальных и временных затрат дать достоверную оценку наличия или отсутствия в анамнезе факта радиационного воздействия на отдельно взятую ткань или орган, как инкорпорированными радионуклидами (радиоизотопы йода, стронция, цезия и др.), так и внешним излучением. Преимуществом способа является использование не только свежеприготовленных цитологических препаратов, но и архивного материала для установления факта радиационного воздействия. Предлагаемый способ может быть рекомендован экспертным советам для установления причинной связи заболевания с фактом радиационного воздействия. Заявляемый способ также может быть использован в экспериментальной медицине для разработки моделей радиочувствительности органов и тканей.
Источники информации
1. Биологическая дозиметрия: теоретические и практические аспекты / С.Б.Мельнов. - Мн.: Белорусский комитет «Дзецi Чарнобыля», 2002. - С.28-39.
2. RU 2141658, C1.
3. D.Gisselsson Chromosomal instability and genomic amplification in bone and soft tissue tumours. - Lund university. - 2000. 280 p.
Способ биоиндикации радиационного воздействия на щитовидную железу, согласно которому определяют хромосомные аберрации в исследуемом материале, в качестве критерия хромосомных аберраций регистрируют аномалии ядер и по повышенной частоте встречаемости выявляют пациентов с повышенным содержанием хромосомных аберраций в популяциях клеток, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют тироциты из пунктата щитовидной железы, и при наличии аномалий ядер в виде межъядерных хромосомных мостов длиной от 5 мкм и более в клеточных кластерах пунктата устанавливают факт наличия предшествующего воздействия радиоактивного излучения на щитовидную железу пациента.
