Способ оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора адф p2y12 на тромбоцитарных мембранах, на состояния тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты указанной группы

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике. Сущность способа оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов на организм человека состоит в том, что исследуют тромбоциты крови с помощью проточной цитометрии, проводимой не ранее чем на 5 сутки после начала приема антиагрегантного препарата. Определяют количественные значения рецепторов тромбоцитов в цельной крови GP IIb-IIIa и Р-селектина до и после добавления индуктора активации тромбоцитов 10 мкМ АДФ. Изменения количества рецепторов тромбоцитов для фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa, K1, а также изменения экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов в цельной крови, K2, определяют по разработанным формулам. При значении K1≤10% и K2≤50% оценивают эффективное действие антиагрегантного препарата на состояние тромбоцитов крови пациентов. Использование заявленного способа позволяет повысить чувствительность и точность оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах на состояния тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты, а также упростить способ и сократить время его проведения.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может использоваться для оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах на состояние тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты указанных групп.

В клинической лабораторной диагностике для оценки агрегационного состояния тромбоцитов крови человека используется доступный и общеизвестный метод стандартной агрегатометрии.

Стандартная агрегатометрия - измерение индуцированной агрегации - измеряется изменение светопропускания богатой тромбоцитами плазмы после добавления индуктора агрегации АДФ, коллагена и других (O'Brien D.K., Heywood J.B., Heady J.A. The quantitation of platelet aggregation induced by four compounds: A study relation to myocardial infarction. Thromb Haemorrh 1966; 16: 725-767).

Недостатки - низкая чувствительность и воспроизводимость, необходимость приготовления богатой тромбоцитами плазмы, возможна преждевременная активация тромбоцитов на преаналитическом этапе, искажающая результаты анализа, метод пригоден для выявления функциональной недостаточности, но не выявляет гиперфункцию, метод не стандартизован, в силу существующих недостатков применение метода для оценки эффективности антиагрегантной терапии ограничено.

Известен способ оценки агрегационного состояния тромбоцитов крови человека, заключающийся в измерении экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов при фиксировании клеток в смеси формальдегид + глиоксал (Okano K. et al., Development of an improved assay system for activated platelet counts and evaluation by aspirin monitoring. Trans Res 2010; 155 (2): 89-96).

Недостатки - трудоемкая пробоподготовка, используются не нативные, а фиксированные тромбоциты, то есть нельзя с уверенностью утверждать, что результаты анализа в полной мере отражают процессы, происходящие in vivo.

Известен также способ оценки агрегационного состояния тромбоцитов крови человека, заключающийся в измерении количества растворимого Р-селектина, как маркера активации тромбоцитов (Мазуров А.В. Мембранные гликопротеиды в реакциях адгезии и агрегации тромбоцитов. Автореф. дис. на соискание ученой степ.д.м.н., Москва, 1998; Muller О. et al., Relation of endothelial function to residual platelet reactivity after clopidogrel in patients with stable angina pectoris undergoing percutaneous coronary intervention. Am J Cardiol 2010; 105 (3): 333-338).

Недостатки - растворимый Р-селектин выделяется не только тромбоцитами, но и эндотелиальными клетками, что может искажать данные о функциональном состоянии тромбоцитарного гемостаза и затруднять интерпретацию исследований эффективности антиагрегантных препаратов.

В последнее время с внедрением в практическое здравоохранение новых лабораторных технологий оценку агрегационного состояния тромбоцитов крови человека возможно проводить с помощью проточного цитометра и с использованием моноклональных антител к тромбоцитарным рецепторам до и после активации индуктором АДФ.

Измерение количества рецепторов тромбоцитов для фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa и экспрессию Р-селектина на поверхности клеток методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентно меченых антител (Chen М.-С. et al., Left atrial platelet activity with rheumatic mitral stenosis: correlation study of severity and platelet P-selectin expression by flow cytometry. Chest 2003; 124: 1663-1669).

Измерение количества GP IIb-IIIa и экспрессии Р-селектина без использования активации тромбоцитов индуктором (10 мкМ АДФ) не отражает способности тромбоцитов к активации, нет установленных пределов нормальных значений, нет одновременного с анализом экспрессии Р-селектина определения количества GP IIb-IIIa, нет активации тромбоцитов индуктором. Такой подход позволяет только констатировать состояние тромбоцитов на данный конкретный момент, но невозможно определить способность тромбоцитов крови к их дальнейшей реакции на антиагрегантные препараты.

Измерение экспрессии Р-селектина на поверхности клеток до и после добавления индуктора - АДФ (концентрация индуктора не указана) (Storey R.F. et al. Inhibition of ADP-indused P-selectin expression and platelet-leukocyte conjugate formation by clopidogrel and the P2Y12 receptor antagonist AR-C6993MX but not aspirin. Thromb Haemost 2002; 88: 488-494).

Измерение Р-селектина до и после активации АДФ проводилось на здоровых добровольцах in vitro (антиагрегантные препараты добавляли в пробирку), т.е. не были проведены эксперименты с пациентами, принимающими антиагрегантные препараты. Не установлены концентрации индуктора, сроки проведения исследования, пределы значений измеряемых параметров у здоровых лиц и пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, принимающих антиагрегантные препараты.

Известен также способ, описанный в работе авторов Сироткиной О.В., Боганьковой Н.А., Вавиловой Т.В. «Новые подходы к оценке функциональной активности тромбоцитов с использованием проточной цитометрии» / Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2009, 8(6), приложение 1, с.330. Данный способ - способ определения рецепторов GP IIb-IIIa и Р-селектина методом проточной цитометрии на тромбоцитах доноров с активацией АДФ. Методом проточной цитометрии измеряют количество рецепторов тромбоцитов для фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa и экспрессию Р-селектина на поверхности клеток до и после активации индуктором активации тромбоцитов (АДФ) в концентрации 10 мкМ. Для анализа использовали богатую тромбоцитами плазму, приготовленную центрифугированием венозной крови, стабилизованной цитратом натрия в течение 15 минут при 1500 об/мин. В работе указывается, что определяются количественные значения рецептора тромбоцитов для фибриногена гликопротеину GP IIb-IIIa по уровню средней интенсивности флуоресценции (MFI) и уровень экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов как количество клеток (в %), меченых антителами к Р-селектину до и после активации индуктором в цельной крови. В работе используются тромбоциты цельной крови 33 доноров (15 женщин и 18 мужчин) и сравниваются полученные результаты с агрегацией тромбоцитов, полученной другим методом - по Born (стандартная агрегатометрия).

Недостатками данного способа являются:

1) Это пилотное исследование у добровольцев, которые не принимали каких-либо антиагрегантных препаратов.

2) Не выведена формула расчета изменения количества рецепторов для фибриногена GP IIb-IIIa и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов до и после активации 10 мкМ АДФ.

3) Не приведены данные о больных, принимающих антиагрегантные препараты, не указаны сроки, в которые следует анализировать эффективность антиагрегантных препаратов.

По наиболее близкой технической сущности в качестве прототипа нами выбран способ оценки эффективности антиагрегантной терапии, заключающийся в оценке агрегационного состояния тромбоцитов методом стандартной агрегатометрии (O'Brien D.K., Heywood J.B., Heady J.A. The quantitation of platelet aggregation induced by four compounds: A study relation to myocardial infarction. Thromb Haemorrh 1966; 16: 725-767).

Метод стандартной агрегатометрии, то есть измерение индуцированной агрегации, заключается в измерении изменения светопропускания богатой тромбоцитами плазмы после добавления к ней индуктора агрегации АДФ, или коллагена, или других индукторов.

Способ осуществляют следующим образом.

Венозную кровь для исследования берут утром натощак пункцией иглой локтевой вены в вакуумные пробирки с антикоагулянтом - 3,8% цитрат натрия, соотношение 1:9. Для отделения богатой тромбоцитами плазмы (БТП) кровь центрифугируют на малых оборотах при 1500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. БПТ используют для анализа агрегации тромбоцитов. Путем центрифугирования части БТП при 3000 об/мин в течение 15 мин получают обедненную тромбоцитами плазму (ОТП), которую используют для разведения БПТ до 300 тыс. клеток/мкл, и если это необходимо, для калибровки агрегометра (ОТП используется для калибровки агрегометра на уровень светопропускания 100%) на уровень Т=100%. Все манипуляции проводят в течение 1-2 часов с момента забора крови. В качестве индуктора агрегации тромбоцитов используют раствор коллагена и АДФ в концентрациях 10 мкМ, 5 мкМ, 2,5 мкМ. При анализе агрегатограмм результат оценивают по изменению степени светопропускания (Т, %) в точке максимума (т.е. максимальная степень агрегации тромбоцитов), а также по скорости агрегации (V, %/мин) через 30 секунд после добавления индуктора.

Недостатки прототипа:

Низкая чувствительность и воспроизводимость, необходимость приготовления богатой тромбоцитами плазмы, возможна преждевременная активация тромбоцитов на преаналитическом этапе, искажающая результаты анализа, метод пригоден для выявления функциональной недостаточности, но не выявляет гиперфункцию, метод не стандартизован.

Не обозначены оптимальные концентрации индуктора. В прототипе не указаны и не обоснованы сроки проведения оценки действия антиагрегантных препаратов.

Нет описания расчета формулы для подсчета изменения способности тромбоцитов реагировать на антиагрегантые препараты.

Не указаны конкретные количественные показатели результатов расчетов, указывающих на эффективность проводимой антиагрегантной терапии.

Продолжительность анализа одного образца в способе прототипе 50 минут.

В силу существующих недостатков применение метода для оценки эффективности антиагрегантной терапии ограничено.

Техническим результатом изобретения является повышение чувствительности и точности оценки способа эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах, на состояние тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты данных групп, а также сокращение времени проведения способа и его упрощение за счет исключения этапа приготовления богатой тромбоцитами плазмы.

Технический результат достигается тем, что оценивают состояния тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты, влияющие на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах. Оценку состояния тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты указанных групп, проводят с помощью проточной цитометрии, проводимой не ранее чем на 5 сутки после начала приема антиагрегантного препарата с последующими определениями количественных значений рецепторов тромбоцитов в цельной крови GP IIb-IIIa и Р-селектина до и после добавления индуктора активации тромбоцитов 10 мкМ АДФ, определениями изменения количества рецепторов тромбоцитов для фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa, К 1, а также изменения экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов в цельной крови, К 2, по формулам:

К1=(MFI^АДФ+-MFI^АДФ-)/MFI^АДФ+×100%,

где MFI^АДФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FLTC после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ), MFI^АДФ- - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FLTC до инкубации с индуктором и

К2=(%CD62P-РЕклеток^АДФ+-%CD62P-РЕклеток^АДФ-)/%CD62P-РЕклеток^АДФ+×100%),

где % CD62P-PE клеток ^АДФ+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ); % CD62P-PE клеток ^АДФ- - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE до инкубации с индуктором. При значении К 1≤10% и К 2≤50% оценивают эффективное действие антиагрегантных препаратов указанных групп на состояния тромбоцитов крови пациента, то есть подавляющее действие на функциональную активность тромбоцитов.

Способ осуществляется следующим образом.

Содержание GP IIb-IIIa и Р-селектина на поверхности тромбоцитов определяют методом проточной цитометрии не ранее чем на 5 сутки после начала приема антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах с использованием флуоресцентно-меченых моноклональных антител CD61-FITC и CD62P-PE соответственно (Beckman Coulter, US), на проточном цитометре CY-TOMICS FC 500 (Beckman Coulter, US). Цитометрическое исследование проводят в цельной венозной крови, разведенной в 50 раз однократным фосфатным буфером (1×PBS). Для окрашивания флуоресцентно-мечеными антителами 40 мкл разведенной крови инкубируют с 5 мкл CD61-FITC или CD62P-PE в течение 15 минут при комнатной температуре. Данную процедуру проводят в двух пробирках. Для активации тромбоцитов одновременно с антителами в одну из пробирок добавляют 10 мМ АДФ, в другую АДФ не добавляют. В качестве отрицательного контроля используют антитела к мышиному иммуноглобулину, меченые FITC и РЕ. Реакцию останавливают добавлением в пробирки 455 мкл 1×PBS и образцы анализируют на проточном цитометре. Количество GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов до и после индукции 10 мкМ АДФ оценивают как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), экспрессию Р-селектина на поверхности тромбоцитов оценивают как процент клеток, меченых CD62P-PE до и после индукции 10 мкМ АДФ.

Чувствительность к антиагрегантным препаратам указанных групп определяют по рассчитанным показателям К 1 и К 2.

Рассчитанные параметры К 1 и К 2 показывают увеличение в % количества GP IIb-IIIa и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов после индукции АДФ. Параметр К 1 рассчитывают по формуле:

К 1=(MFI^АДФ+-MFI^АДФ-)/MFI^АДФ+×100%,

где MFI^АДФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FITC после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ), MFI^АДФ- - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FITC в отсутствие индуктора.

Параметр К 2 рассчитывают по формуле:

К 2=(%CD62P-РЕклеток^АДФ+-%CD62P-РЕклеток^АДФ-)/%CD62P-РЕклеток^АДФ+×100%),

где % CD62P-PE клеток ^АДФ+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ); % CD62P-PE клеток ^АДФ- - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE в отсутствие индуктора.

При значении К 1≤10% и К 2≤50% оценивают эффективное действие антиагрегантных препаратов указанных групп на состояния тромбоцитов крови пациента, то есть подавляющее действие на функциональную активность тромбоцитов.

Значения К 1≤10% и К 2≤50% можно считать маркерами высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии препаратов указанных групп или неэффективности действия антиагрегантных препаратов указанных групп на состояния тромбоцитов крови пациента.

Отличительными существенными признаками заявляемого способа являются:

- Указание сроков проведения оценки действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах, то есть не ранее чем на 5 сутки.

- Определение количественных значений рецепторов тромбоцитов в цельной крови GP IIb-IIIa и Р-селектина до и после добавления индуктора активации тромбоцитов.

- Определение изменения количества рецепторов тромбоцитов для фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa, К 1, а также изменения экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов в цельной крови, К 2, по формулам

К1=(MFI^АДФ+-MFI^АДФ-)/MFI^АДФ+×100%,

где MFI^АДФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FITC после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ), MFI^АДФ- - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FLTC до инкубации с индуктором.

К2=(%CD62P-РЕклеток^АДФ+-%CD62P-РЕклеток^АДФ-)/%CD62P-РЕклеток^АДФ+×100%),

где % CD62P-PE клеток ^АДФ+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ); % CD62P-PE клеток ^АДФ- - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE до инкубации с индуктором.

- При значении К 1≤10% и К 2≤50% оценивают эффективное действие антиоксидантных препаратов указанных групп на состояния тромбоцитов крови пациента, то есть подавляющее действие на функциональную активность тромбоцитов.

Причинно-следственная связь между отличительными существенными признаками и достигаемым результатом:

- Исследования у пациентов, принимающих антиагрегантные препараты целесообразно проводить не ранее чем на 5 сутки. Оптимальность данного срока была апробирована у 10 пациентов, принимающих двойную антиагрегантную терапию - клопидогрел + аспирин.

Снижение показателя К1 и К2 после активации происходило на 5 день приема антиагрегантных препаратов (до приема препаратов К1=11,3±1,7%, К2=72,1±10,2%, через 5 дней антиагрегантной терапии К1=6,8±1,0%, К2=58,7±13,5%), тогда как в способе-прототипе максимальная степень агрегации (Т,%) достоверно снижается не ранее чем на 10 день, а скорость агрегации тромбоцитов (V, %/мин) практически не изменяется:

до терапии - Т(2,5 мкМ АДФ) = 43,1±5,1%, Т(5 мкМ АДФ) = 55,2±6,5%, Т(10 мкМ АДФ) = 69,4±3,9%, через 5 дней терапии - Т(2,5 мкМ АДФ) = 30,5±3,3%, Т(5 мкМ АДФ) = 46,0±4,0%, Т(10 мкМ АДФ) = 49,9±3,4% (различия не достоверны), через 10 дней терапии - Т(2,5 мкМ АДФ) = 25,2±3,9%, Т(5 мкМ АДФ) = 32,8±3,7%, Т(10 мкМ АДФ)=48,7±5,3% (р<0,05)).

Таким образом, чувствительность заявляемого способа выше по сравнению с прототипом.

- Количественные значения рецепторов тромбоцитов в цельной крови GP IIb-IIIa и Р-селектина определяют до и после добавления индуктора активации тромбоцитов с целью определения физиологических изменений тромбоцитарных рецепторов на клеточном уровне на фоне приема антиагрегантных препаратов, что повысит точность оценки эффективности антиагрегантной терапии.

- Значения К1 и К2 у больных, принимающих антиагреганты, сопоставимые с показателями контрольной группы без антиагрегантов, можно считать маркерами высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. Для оценки предела показателей К1 и К2 проводились исследования у контрольной группы доноров, которые не принимали антиагрегационные препараты. У доноров полученные результаты принимаются за нормальные значения (среднее±ошибка среднего):

1) Контрольная группа доноров, значения принимаются за норму

MFI^АДФ- - 15,09±0,86

MFI^АДФ+ - 17,06±1,09

К1=13,48±1,99%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 1,84±0,54

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 17,94±3,13

К2=73,89±5,17%

После установления значений у здоровых лиц, не принимающих антиагрегантные препараты, оценивали эффективность действия аспирина на агрегационную функцию тромбоцитов у пациентов с сердечнососудистой патологией, принимающих аспирин.

2) Пациенты с сердечно-сосудистой патологией и принимающие аспирин.

MFI^АДФ- - 13,77±2,24

MFI^АДФ+ - 17,02±3,08

К1=16,30±3,85%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 3,24±0,84

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 15,98±3,71

К2=64,39±8,80%

Значения К1 и К2 статистически не различаются у доноров и пациентов, принимающих аспирин, следовательно, аспирин не обеспечивает подавление функциональной активности тромбоцитов, остается риск повторных сердечно-сосудистых эпизодов, терапия антиагрегантом не эффективна.

3) Пациенты с сердечно-сосудистой патологией и принимающие комбинацию препаратов клопидогрел+аспирин.

MFI^АДФ- - 12,24±0,77

MFI^АДФ+ - 13,46±0,96

К1=8,45±2,14%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 3,35±1,08

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 4,51±1,04

К2=39,02±7,69%

Значения К1 и К2 достоверно снижены у пациентов, принимающих клопидогрел + аспирин, по сравнению с донорами и пациентами, принимающими только аспирин (р=0,007 и р=0,002, соответственно). Вывод - двойная антиагрегантная терапия препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах, эффективна, обеспечивает подавление функциональной активности тромбоцитов и их способности к агрегации.

На основании исследования 66 добровольцев, из них 32 донора без сердечно-сосудистых заболеваний, не принимающие антиагрегантные препараты, 12 пациентов с инфарктом миокарда в анамнезе, перенесенным не менее 6 месяцев назад, принимающие аспирин, 22 пациента с острым инфарктом миокарда, принимающие клопидогрел + аспирин, были установлены следующие значения для анализируемых показателей:

- К1≤10% и К2≤50% - антиагрегантная терапия эффективна, К1>10% и К2>50% - на фоне антиагрегантной терапии способность тромбоцитов к активации остается высокой, эффективность указанных антиагрегантных препаратов снижена.

Отсутствие сложного преаналитического этапа, заключающегося в приготовлении богатой тромбоцитами плазмы, то есть цетрифугирование, которое включает в себя способ-прототип, позволяет повысить чувствительность и точность способа, так как предотвращает активацию и разрушение тромбоцитов на преаналитическом этапе, а также позволяет сократить время проведения способа на 20 мин.

Совокупность существенных отличительных признаков является новой и позволяет повысить чувствительность и точность способа оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах, на состояние тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты указанных групп, а также сократить время проведения способа и упростить его за счет исключения этапа приготовления богатой тромбоцитами плазмы.

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1.

Донор Г. Цитометрическое исследование №00000677.

Не принимает антиагрегантные препараты, сердечно-сосудистые и тромбоэмболические заболевания в анамнезе отсутствуют.

MFI^АДФ- - 16,9

MFI^АДФ+ - 20,6

К1 - 18%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 1,6

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 27,4

К2 - 94,2%

Вывод - способность нормально функционирующих тромбоцитов к активации в отсутствие антиагрегантной терапии.

Пример 2.

Донор Д. Цитометрическое исследование №00000779.

Не принимает антиагрегантные препараты, сердечно-сосудистые и тромбоэмболические заболевания в анамнезе отсутствуют.

MFI^АДФ- - 16,3

MFI^АДФ- - 19,4

К1 - 16%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 1,14

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 5,62

К2 - 79,7%

Вывод - способность нормально функционирующих тромбоцитов к активации в отсутствие антиагрегантной терапии.

Пример 3.

Пациент С. Цитометрическое исследование №00000978.

В анамнезе инфаркт миокарда, принимает аспирин.

MFI^АДФ- - 10,7

MFI^АДФ+ - 12,4

К1 - 13,7%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 0,55

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 1,29

К2 - 57,4%

Вывод - сохраняется высокая способность тромбоцитов к активации и агрегации, необходима коррекция антиагрегантной терапии, аспирин не эффективен в подавлении функциональной активности тромбоцитов.

Пример 4.

Пациент 3. Цитометрическое исследование №00003282.

В анамнезе инфаркт миокарда, принимает аспирин.

MFI^АДФ- - 7,02

MFI^АДФ+ - 8,19

К1 - 14,3%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 1,33

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 19,06

К2 - 93%

Вывод - сохраняется высокая способность тромбоцитов к активации и агрегации, необходима коррекция антиагрегантной терапии, аспирин не эффективен в подавлении функциональной активности тромбоцитов.

Пример 5.

Пациент 3. Цитометрическое исследование №00003442.

Госпитализирован с острым инфарктом миокарда, принимает клопидогрел + аспирин.

MFI^АДФ- - 13,0

MFI^АДФ+ - 13,8

К1 - 5,8%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 0,2

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 0,38

К2 - 47,4%

Вывод - антиагрегантная терапия эффективно подавляет функциональную активность тромбоцитов.

Пример 6.

Пациент Д. Цитометрическое исследование №00001511.

Госпитализирован с острым инфарктом миокарда, принимает клопидогрел + аспирин.

MFI^АДФ- - 6,7

MFI^АДФ+ - 8,47

К1 -21,2%

%CD62P-PE клеток ^АДФ- - 0,47

%CD62P-PE клеток ^АДФ+ - 3,77

К2 - 87,5%

Вывод - сохраняется высокая способность тромбоцитов к активации и агрегации, терапия клопидогрел+аспирин не эффективна.

Заявляемый способ, в отличие от способа, выбранного нами в качестве прототипа:

- Повышает чувствительность способа, так как в заявляемом способе снижение показателей К1 и К2 после активации происходило на 5 день приема антиагрегантных препаратов указанных групп (до приема препаратов К1=11,3±1,7%, К2=72,1±10,2%, через 5 дней антиагрегантной терапии К1=6,8±1,0%, К2=58,7±13,5%), тогда как в способе-прототипе максимальная степень агрегации (Т, %) достоверно снижается не ранее чем на 10 день, а скорость агрегации тромбоцитов (V, %/мин) практически не изменяется. Чувствительность заявляемого способа повышается за счет определения физиологических изменений тромбоцитарных рецепторов на клеточном и молекулярном уровне на фоне приема антиагрегантных препаратов указанных групп.

- Повышает точность способа, так как через две недели наблюдения за пациентами, принимающими антиагрегантные препараты указанных групп, по результатам заявляемого способа было обнаружено, что у всех 10 человек (100%) снижена активность тромбоцитов, тогда как по результатам способа прототипа у 4 человек (40%) не фиксировалось снижение агрегационной активности тромбоцитов.

- Упрощение способа - исключение этапа приготовления богатой тромбоцитами плазмы в заявляемом способе по сравнению со способом-прототипом упрощает преаналитический этап, уменьшает время анализа на 20 минут, позволяет сократить количество используемого оборудования за счет исключения из работы центрифуги.

Способ оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов, влияющих на метаболизм арахидоновой кислоты путем ингибирования циклооксигеназы-1 как в отдельности, так и совместно с антагонистом рецептора АДФ P2Y₁₂ на тромбоцитарных мембранах, на состояния тромбоцитов крови пациента, принимающего антиагрегантные препараты данных групп, заключающийся в проточной цитометрии, проводимой не ранее чем на 5-е сутки после начала приема антиагрегантных препаратов с последующими определениями количественных значений рецепторов тромбоцитов в цельной крови GP IIb-IIIa и Р-селектина до и после добавления индуктора активации тромбоцитов 10 мкМ АДФ, определении изменения количества рецепторов тромбоцитов для фибриногена гликопротеинов GP IIb-IIIa, K1, а также изменения экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов в цельной крови, K2, по формулам
K1=(MFI^АДФ+-MFI^АДФ-)/MFI^АДФ+×100%,
где MFI^АДФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FITC после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ), MFI^АДФ- - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb-IIIa CD61-FITC до инкубации с индуктором и
K2=(%CD62P-РЕклеток^АДФ+-%CD62P-РЕклеток^АДФ-)/%CD62P-РЕклеток^АДФ+×100%,
где % CD62P-PEклеток^АДФ+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE после инкубации с индуктором (10 мкМ АДФ);
% CD62P-PEклеток^АДФ- - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину CD62P-PE до инкубации с индуктором,
и при значении K1≤10% и K2≤50% оценивают эффективное действие антиагрегантных препаратов указанных групп на состояния тромбоцитов крови пациента, то есть подавляющее действие на функциональную активность тромбоцитов.