Чипы на основе антител для определения множественных трансдукторов сигналов в редких циркулирующих клетках

Настоящее изобретение относится к медицине и биотехнологии и предоставляет чипы на основе антител для определения активированности и/или суммарного количества множества молекул-трансдукторов сигнала в редких циркулирующих клетках и способа их использования для облегчения диагностики и прогноза раковых заболеваний и разработки индивидуализированного направленного лечения. Изобретение обеспечивает специфичность, чувствительность и возможность быстрого одновременного анализа многих аналитов в одном образце, связанных с использованием микрочипов. 31 з.п. ф-лы, 19 ил.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Способ осуществления мультиплексного высокопроизводительного иммуноанализа с особо широким динамическим диапазоном, включающий:
(a) инкубацию экстракта клеток с множеством серийных разведений первичных антител, иммобилизованных на твердой подложке и специфичных в отношении одного или более аналитов в экстракте клеток, с образованием множества связанных аналитов;
(b) инкубацию множества связанных аналитов с вторичными антителами, специфичными в отношении соответствующих аналитов, с образованием множества детектируемых связанных аналитов; детекция включает:
(1) множество не зависимых от активированности антител, меченных вспомогательным компонентом, и
(2) множество зависимых от активированности антител, меченных первым членом пары усиления сигнала,
причем вспомогательный компонент дает окисляющий агент, который достигает первого члена пары усиления сигнала и взаимодействует с ним;
(c) инкубацию множества детектируемых связанных аналитов с вторым членом пары амплификации сигнала с образованием усиленного сигнала и
(d) детекцию усиленного сигнала, созданного первым и вторым членами усиливающей сигнал пары.

2. Способ по п.1, в котором экстракт клеток включает экстракт циркулирующих клеток солидной опухоли.

3. Способ по п.2, в котором клетки выделяют из образца взятого у пациента материала путем иммуномагнитной сепарации.

4. Способ по п.3, в котором взятый у пациента образец выбирают из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюны, мочи, мокроты, промывной жидкости бронхиального лаважа, слезной жидкости, аспирата из соска, лимфы, тонкоигольного пунктата и их комбинаций.

5. Способ по п.3, в котором выделенные клетки выбирают из группы, состоящей из циркулирующих опухолевых клеток, раковых стволовых клеток циркулирующих эндотелиальных клеток, циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и их комбинаций.

6. Способ по п.3, в котором выделенные клетки стимулировали in vitro факторами роста.

7. Способ по п.6, в котором выделенные клетки перед стимуляцией факторами роста инкубировали с противораковым лекарством.

8. Способ по п.7, в котором противораковое лекарство выбирают из группы, состоящей из моноклональных антител, ингибиторов тирозинкиназы, иммуносупрессивных агентов и их комбинаций.

9. Способ по п.6, в котором выделенные клетки после стимуляции факторами роста лизировали, чтобы получить экстракт клеток.

10. Способ по п.1, в котором один или более аналитов содержат множество молекул-трансдукторов сигналов.

11. Способ по п.1, в котором твердую подложку выбирают из группы, состоящей из стекла, пластика, металлических пластин, стержней, фильтров, гранул, бумаги, мембран, пучков волокон и их комбинаций.

12. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела также содержат детектируемый компонент.

13. Способ по п.12, в котором детектируемый компонент является флуорофором.

14. Способ по п.12, в котором количество детектируемого компонента коррелирует количеством одного или более аналитов.

15. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела непосредственно мечены компонентом, опосредующим передачу сигнала.

16. Способ по п.1, в котором не зависимые от активированности антитела мечены компонентом, опосредующим передачу сигнала, посредством гибридизации олигонуклеотида, конъюгированного с не зависимым от активированности антителом, с комплементарным олигонуклеотидом, конъюгированным с компонентом, опосредующим передачу сигнала.

17. Способ по п.1, в котором зависимые от активированности антитела непосредственно мечены первым членом пары усиления сигнала.

18. Способ по п.1, в котором зависимые от активированности антитела мечены первым членом пары усиления сигнала посредством связывания первого члена аффинной пары, конъюгированного с зависимым от активированности антителом, с вторым членом аффинной пары, конъюгированным с первым членом пары усиления сигнала.

19. Способ по п.18, в котором первый член аффинной пары является биотином.

20. Способ по п.18, в котором второй член аффинной пары является стрептавидином.

21. Способ по п.1, в котором компонент, опосредующий передачу сигнала, является глюкозоокидазой.

22. Способ по п.21, в котором окисляющий агент является перекисью водорода (Н₂O₂).

23. Способ по п.22, в котором первый член пары усиления сигнала является пероксидазой.

24. Способ по п.23, в котором пероксидаза является пероксидазой хрена (HRP).

25. Способ по п.23, в котором второй член пары усиления сигнала является тирамидным реагентом.

26. Способ по п.25, в котором тирамидный реагент представляет собой биотин-тирамид.

27. Способ по п.26, в котором усиленный сигнал создается пероксидазным окислением биотин-тирамида с образованием активированного тирамида.

28. Способ по п.27, в котором активированный тирамид определяется непосредственно.

29. Способ по п.27, в котором активированный тирамид определяется после добавления реагента, детектирующего сигнал.

30. Способ по п.29, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является флуорофор, меченный стрептавидином.

31. Способ по п.29, в котором реагентом, детектирующим сигнал, является комбинация пероксидазы, меченной стрептавидином, и хромогенного реагента.

32. Способ по п.31, в котором хромогенным реагентом является 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (ТМВ).