Способ определения наркотических средств в ротовой жидкости человека методом иммунохроматографии



 


Владельцы патента RU 2442988:

Общество с ограниченной ответственностью "ДИАНАРК" (ООО "ДИАНАРК") (RU)

Изобретение относится к медицине и описывает способ латеральной проточной иммунохроматографии для определения наркотических средств в ротовой жидкости человека, при этом способ включает сбор ротовой жидкости коллектором с последующим нанесением ее на тест-полоску, содержащую последовательно расположенные зоны: конъюгат Ат-метки, содержащий специфические антитела к наркотику, меченные золотом; тестовую, содержащую иммобилизованные конъюгаты аналит: овальбумин; и контрольную, содержащую антивидовые антитела; с последующим определением действительности теста путем наблюдения присутствия окрашенной полосы в контрольной зоне, и определение присутствия наркотика в ротовой жидкости путем наблюдения появления окрашенной полосы в тестовой зоне, причем в качестве конъюгата использют аналит: белок, полученный карбодиимидным методом из макромолекулярного носителя овальбумина, в качестве аналита используют гаптены, являющиеся производными наркотических веществ (морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола), содержащие спейсер с карбоксильной группой при соотношении количества молей гаптена на молекулу белка, равному 12-15, а в качестве конъюгата Ат-метка используют моноклональные антитела к исследуемым антигенам наркотических веществ, полученные гибридомной технологией на основе конъюгированных антигенов, полученных из макромолекулярного носителя бычьего сывороточного альбумина и указанных выше гаптенов, производных наркотических веществ. Описана возможность проведения мультианалитического иммунохроматографического определения опиатов. Способ обеспечивает увеличение чувствительности, экспрессности и времени сохранения результатов анализов. 1 з.п. ф-лы, 12 пр., 8 табл.

 

Изобретение относится к области скрининговых методов анализа и позволит определять в динамике ситуацию, связанную со злоупотреблением конкретными видами наркотических средств, что обеспечит возможность оперативного контроля за наркоситуацией и своевременного целенаправленного воздействия на группы риска.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами (Ат), широко вошли в аналитическую практику и используются благодаря таким их особенностями, как высокая специфичность, чувствительность, воспроизводимость, экспрессность и относительная простота схемы анализа.

Метод конкурентного ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит:белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате Ат-метка. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом Ат-метка на мембране. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат аналит:белок-носитель. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту, и соответственно антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже является занятым аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате появление окрашенной полосы в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат Ат-метка связывается с конъюгатом Аг: белок-носитель, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат Ат-метка попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Известен способ определения тетрагидроканнабинола (ТГК) в жидких образцах, (US 2009/0017555, МКИ G01N 33/53, опубл. 9 мая 2008 г.), который включает: а) контакт образца с 1) конъюгатом 5-пентилрезорцинол/макромолекулярный носитель, где 5-пентилрезорцинол конъюгирован через гидроксильную группу или ее производное в бензольном кольце и 2) антителом, способным связать ТГК и вышеописанный конъюгат. И б) определение, уменьшается ли связывание антител с конъюгатом в присутствии образца.

Однако точность этого метода недостаточно удовлетворительна, т.к. он выявляет целый спектр метаболитов, а не основной метаболит ТГК-СООН.

Известен способ, принятый за прототип, (патент RU 2007142142, МКИ G01N 33/52, опубл. 27.06.2009) латеральной проточной иммунохроматографии для определения аналита в ротовой жидкости, включающий: сбор ротовой жидкости коллектором, и помещение ее в объем буфера для образцов с последующим помещением в получаемую смесь тест-полоски для латеральной проточной иммунохроматографии, и определении действительности теста путем наблюдения присутствия сигнала (окрашенной полосы) в контрольной зоне, в которой иммобилизованы антивидовые антитела, взаимодействующие с конъюгатом Ат-метка и дающие окрашенную полосу и определение присутствия аналита путем наблюдения сигнала (окрашенной полосы) в тестовой зоне, в которой иммобилизован реагент, который специфически связывается с целевым аналитом (конъюгат аналит: белок). Аналит, подлежащий тестированию, выбран из антител против антигенов инфекционного заболевания, гормонов, факторов роста, терапевтических лекарств, лекарств, допускающих злоупотребление, и продуктов метаболизма лекарств, допускающих злоупотребление. Внизу тест-полоски, которую помещают в буфер с образцом слюны, и где происходит реакция с аналитом, располагают конъюгат Ат-метка, представляющая собой частицы коллоидного золота. При этом буфер для образцов представляет собой буферный раствор фосфата калия с рН 7,2+/-0,2. Причем сигнал наблюдается в течение 20-45 минут через 15-60 мин от начала теста.

Однако чувствительность известного способа не удовлетворяет современным требованиям. Кроме того, время появления сигнала не удовлетворяет требованиям экспрессности, а время его сохранения достаточно мало.

Предлагаемое изобретение решает задачу увеличения чувствительности, экспрессности и времени сохранения результатов анализов, которые используется для диагностики потребления наркотиков.

Поставленная задача решается способом латеральной проточной иммунохроматографии для определения наркотических средств в ротовой жидкости человека, включающим: сбор ротовой жидкости коллектором с последующим нанесением ее на тест-полоску, содержащую последовательно расположенные зоны: конъюгат Ат-метки, содержащий специфические антитела к наркотику, меченные золотом; тестовую, содержащую иммобилизованные конъюгаты аналит: овальбумин; и контрольную, содержащую антивидовые антитела; с последующим определением действительности теста путем наблюдения присутствия окрашенной полосы в контрольной зоне, и определение присутствия наркотика в ротовой жидкости путем наблюдения появления окрашенной полосы в тестовой зоне, причем в качестве конъюгата используют аналит:белок, полученный карбодиимидным методом из макромолекулярного носителя овальбумина, в качестве аналита используют гаптены, являющиеся производными наркотических веществ (морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола), содержащие спейсер с карбоксильной группой при соотношении количества молей гаптена на молекулу белка, равному 12-15. В качестве конъюгата Ат-метка используют моноклональные антитела к исследуемым антигенам наркотических веществ, полученные гибридомной технологией на основе конъюгированных антигенов, полученных из макромолекулярного носителя бычьего сывороточного альбумина и указанных выше гаптенов, производных наркотических веществ.

Для мультианалитического иммунохроматографического определения опиатов, амфетаминов и каннабиноидов тестовая зона состоит из 3 частей, расстояние между центрами линий которых, а также центрами зон конъюгата Ат-метки и контрольный, составляет 3-4 см, а Результаты определения оптимальных разведений конъюгатов с коллоидным золотом для ИХА опиатов, амфетаминов и каннабиноидов составляют:

- разведение 1:4000-1:8000 для анти-Mop-Au (концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл Мор-Ова (ИХА опиатов);

- разведение анти-Амф-Au - 1:2000-1:6000, (концентрация Амф-Ова - от 0,5 до 2 мкг/мл (ИХА амфетаминов);

- разведение 1:3000-1:12000 для анти-Кан- Au и (концентрация от 0,25 до 3 мкг/мл для Кан-Ова (ИХА каннабиноидов),

при этом разведение антивидовых антител составило 1:2000-1:5000.

Конъюгат Ат-метка, представляющий собой специфические антитела к наркотику, меченные золотом, наносится внизу тест-полоски, связывается с аналитом (если присутствует наркотик), в виде иммунного комплекса поднимается по тест-полоске, доходит до тестовой зоны, там происходит конкуренция между нанесенным конъюгатом аналит:белок и аналитом(наркотиком), уже связавшимся с конъюгатом Ат-метка внизу. Если наркотика было много, то полоски не будет, места в антителах все заняты. Дальше вся эта конструкция движется в контрольную зону и обязательно всегда образует окрашенную полосу с антивидовыми антителами.

В таблице 1 приведены условия проведения иммобилизации антител и наночастиц коллоидного золота (НКЗ).

В таблице 2 приведены результаты определения предела обнаружения морфина в разработанной тест-системе ИХА опиатов (N=20).

В таблице 3 приведены результаты определения предела обнаружения амфетамина в разработанной тест-системе ИХА амфетамина (N=20).

В таблице 4 приведены результаты определения предела обнаружения кокаина в разработанной тест-системе ИХА кокаина (N=20).

В таблице 5 приведены результаты определения предела обнаружения Δ9 -ТГКК в разработанной тест-системе ИХА каннабиноидов (N=20).

В таблице 6 приведены результаты медицинских испытаний в МНПЦ Наркологии:

Сопоставление результатов тестирования жидкости ротовой полости с помощью предлагаемого изобретения с результатами подтверждающего метода ВЭЖХ и клиническими диагнозами.

В таблице 7 приведены результаты медицинских испытаний в НД №1:

Сопоставление результатов тестирования жидкости ротовой полости с помощью предлагаемого изобретения с результатами подтверждающего метода ВЭЖХ и клиническими диагнозами.

В таблице 8 приведены статистические характеристики метода ИХА опиатов, амфетамина, каннабиноидов и кокаина с помощью предлагаемого изобретения согласно медицинским испытаниям в МНПЦ Наркологии и НД №1.

Приведенные примеры подтверждает, но не ограничивает предлагаемое изобретение.

Вторичные антитела к моноклональным антителам мыши, использованные для сорбции в контрольной зоне тест-системы, получали на заказ в фирме «Биалекса», Россия.

Пример 1. Синтез конъюгированных антигенов морфина с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

Синтез конъюгированных антигенов морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола с овальбумином проводили с использованием карбодиимидного метода. Для этого гаптены 6-0-гемисукцинат морфина, d, 1-1-фенил-2-карбоксиаминопропан, бензоилэкгонин, дельта-9-тетрагидроканнабинол, модифицированный реакцией азосочетания с п-аминобензойной кислотой (6-0-гемисукцинат морфина) непосредственно вводили в реакцию с белком (овальбумин), используя в качестве конденсирующего агента водорастворимый карбодиимид, глутаровый альдегид, изобутилхлорформиат. В синтезированных конъюгатах определение количества молей гаптена, связавшихся с белком-носителем, проводили с помощью спектрального анализа в ультрафиолетовой и видимой областях.

Конъюгированные антигены исследуемых веществ с белком овальбумином использовали в качестве реагента для нанесения в тестовую зону полоски разрабатываемых тест-систем. Такие конъюгаты обладают наиболее оптимальными параметрами для связывания моноклональными специфическими антителами.

Раствор 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина в 5,0 мл дистиллированной воды смешивали с 2,0 мл ДМФА, содержащего 15, 0 мг (0,039 ммоль) 6-сукцинилморфина, и при охлаждении по каплям прибавляли раствор 15 мг (0,055 ммоль) водорастворимого карбодиимда в 3 мл дистиллированной воды. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 час при 4°С. Полученный конъюгат выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали.

Получено 25 мг конъюгата М-Ова, содержащего 5 молекул морфина на молекулу белка.

Пример 2. Синтез конъюгированных антигенов амфетамина с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

3.1 d,1-1-фенил-2-аминопропан (5 мг; 0,112 ммоль) и (10 мг; 0,00022 ммоль) овальбумина растворяли в 3,0 мл 0,1 М фосфатного буфера. По каплям при перемешивании к реакционной смеси добавляли (70 мкл; моль) раствора глутарового альдегида при комнатной температуре. Постепенно реакционная смесь приобретала характерную желтую окраску, свидетельствующую об окончании реакции. Для остановки реакции к смеси добавляли 40 мкл 1М раствора лизина и инкубировали в течение 1 часа. Полученный конъюгат диализовали против фосфатного буфера в течение ночи при температуре 4°C. Выделение конъюгата проводили гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-25 и лиофильно высушивали. Получено 25 мг конъюгата, содержащего 12 молекул амфетамина на молекулу белка.

Пример 3. Синтез конъюгированных антигенов кокаина с овальбумином для иммобилизации в тестовую зону.

Конъюгат Кок-ОВА получали по методике 1.1. из 50 мг (0,001 ммоль) овальбумина и 2,0 мг (0,005 ммоль) бензоилэкгонина.

Получено 29 мг конъюгата Кок-Ова, содержащего 14 молекул кокаина на молекулу белка.

Пример 4. Синтез конъюгированных антигенов тетрагидроканнабинола с овальбумином, для иммобилизации в тестовую зону.

К раствору 15 мг (3,3×10-3 ммоль) в 3 мл дистиллированной воды прибавили раствор 7,4 мг (0,02 ммоль) вещества дельта-9-тетрагидроканнабинол, модифицированного реакцией азосочетания с п-аминобензойной кислотой в 1 мл ДМФА, охладили реакционную смесь до 0°C и при перемешивании прибавили 5 мг водорастворимого карбодиимида. Реакционную смесь выдерживали в течение 12 час в холодильнике, выпавший осадок мочевины и выделили полученный конъюгат гель-хроматографией на Сефадексе G-25.

Получено 12 мг конъюгата Δ9-ТГК-Ова, содержащего 25 молекул гаптена на молекулу белка.

Пример 5. Синтез специфических (моноклональных) антител к наркотику, меченных золотом, для иммобилизации в зону конъюгат Ат-метки.

Для разработки иммунохроматографического метода анализа наркотических веществ в биологической жидкости человека (слюне) в целях обеспечения визуализации результата анализа были использованы специальные метки - частицы коллоидного золота. Преимущества этого красителя для электронной и оптической микроскопии обусловлены его уникальными оптическими свойствами, а также возможностью получать частицы определенного размера, что позволяет визуализировать объект при любых микроскопических условиях.

Синтезированные и охарактеризованные по количеству связавшегося с белковой матрицей гаптена конъюгированные антигены морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола с бычьим сывороточным альбумином (БСА) были использованы для наработки специфических антител. Для этой цели выбрана гибридомная технология получения моноклональных антител. Для наработки моноклональных антител к исследуемым антигенам были получены конъюгированные антигены Мор-БСА, Амф-БСА, Кок-БСА, Кан-БСА. В результате иммунизации получено по шесть образцов мышиных сывороток, содержащих моноклональные антитела к каждому исследуемому антигену (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан).

Для синтеза конъюгированных с коллоидным золотом моноклональных антител к исследуемому антигену (анти-Мор-Au, анти-Амф-Au, анти-Кок-Au и анти-Кан-Au), нами были использованы наночастицы коллоидного золота (НКЗ) различного диаметра производства компании "ЭКОС-Сибирь". Синтез конъюгатов антител с НКЗ проводили по стандартной технологии. Для этого антитела (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан) переводили в 10 мМ буфер со значением pH от 7,5 до 10,0. К НКЗ добавляли раствор антител, инкубировали при комнатной температуре и дополнительно стабилизировали раствором БСА. НКЗ с иммобилизованными молекулами антител (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан) отделяли от несвязавшихся молекул антител центрифугированием. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 50 мМ К-фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,1М раствором NaCl, содержащем 0,25% БСА и 0,25% Твин-20.

Для конъюгации с антителами было отобрано пять гомогенных (стандартное отклонение диаметра - до 22%) препаратов НКЗ со средним диаметром в диапазоне от 5 до 60 нм. Раствор коллоидного золота в этом диапазоне стабилен длительное время. Изменяя размер частиц, можно регулировать валентность конъюгата. Исходя из того, что одно антитело на поверхности НКЗ занимает 45 нм2, содержание антител в конъюгатах с отобранными препаратами НКЗ может варьировать от 2 до 250.

Пример 6. Выбор оптимальной концентрации конъюгированных антигенов для иммобилизации в тестовую зону.

Раствор конъюгатов Мор-Ова, Амф-Ова, Кок-Ова и Кан-Ова в 50 мМ К-фосфатном буфере, pH 7,4, в разных концентрациях (от 400 нг/мл до 0,2 нг/мл) в виде капель наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Затем полоски высушивали 15 мин в сушильном шкафу при 37°C, наносили на них блокирующий раствор овальбумина в фосфатном буфере, сушили вновь 2 часа в сушильном шкафу при 37°C. Затем полоски были помещены в раствор соответствующих конъюгатов моноклональных антител с коллоидным золотом анти-Мор-Аu, анти-Амф-Аu, анти-Кок-Аu и анти-Кан-Au (с разведениями 1:4000, 1:2000, 1:6000, 1:4000 соответственно). Полоски инкубировались 30 минут при комнатной температуре, а затем были промыты 3 раза ФБСТ. Каждое исследование связывания было выполнено в 3-х повторах. Минимально определяемая концентрация анти-Мор-Аu с помощью конъюгата анти-Мор-Аu составила 31 нг/мл. Концентрация, при которой пятно является ярким, составила 500 нг/мл. Дальнейший подбор оптимальной концентрации Мор-Ова следует проводить для концентрации, близкой к этому значению.

Минимально определяемая концентрация для ИХА амфетамина составила 62 нг/мл, для ИХА кокаина - 31 нг/мл, для ИХА каннабиноидов - 16 нг/мл, концентрации оптимальной яркости пятна - 1000, 500 и 250 нг/мл соответственно.

Пример 7. Проверка оптимальной концентрации конъюгированных антигенов для иммобилизации в тестовую зону в конкурентной реакции.

Далее для определения оптимальной концентрации конъюгатов Аг-Ова, где Аг-определяемые наркотики, а Ова-овальбумин, а именно (Мор-Ова, Амф-Ова, Кок-Ова и Кан-Ова) проводили эксперимент на тест-полосках. Мембраны для конъюгатов обрабатывали растворами конъюгатов анти-Мор-Аu, анти-Амф-Аu, анти-Кок-Аu и анти-Кан-Аu в фосфатном буфере с Ова в рабочих концентрациях. В зону контрольной линии наносили антивидовые антитела кролик-анти-мышь в разведении 1:2000. В тестовую зону полосок наносили линии конъюгатов Аг-Ова в концентрациях 500, 1000 и 2000 нг/мл. Затем тест-полоски помещали в растворы фосфатного буфера, содержащего различные концентрации морфина: 20, 40, 60, 100, 200 нг/мл. Результат определяли визуально по появлению линий бурого цвета в тестовой и контрольной зоне

Оптимальные концентрации для конъюгатов Аг-Ова составили: 1 мкг/мл для Мор-Ова, 2 мкг/мл - для Амф-Ова, 0,25 мкг/мл - для Кан-Ова и 1 мкг/мл - для Кок-Ова.

Пример 8. Оптимизация концентрации конъюгатов с коллоидным золотом. В тестовой зоне полосок наносились линии растворами указанных выше конъюгатов Аг-Ова в выбранных концентрациях. На нижнюю часть мембраны для конъюгата Ат-метка наносили растворы специфических моноклональных антител, меченных золотом (Ат-Аu): анти-Mop-Au, анти-Амф-Au, анти-Кан- Au, анти-Кок-Au, в 3-х разных разведениях для каждого вида ИХА. На данном этапе установили оптимальные разведения составляют: 1:4000 для анти-Мор-Аu (ИХА опиатов); анти-Амф-Аu 1:6000 (ИХА амфетаминов); 1:3000 для анти-Кан- Au (ИХА каннабиноидов; для анти-Кок-Аu разведение составило 1:2000 (ИХА кокаина). Разведение антивидовых антител составило 1:2000.

Пример 9. Создание мультианалитической иммунохроматографической полоски. ИХА для 3-х аналитов: опиатов, амфетаминов и каннабиноидов объединен в одну тест-полоску. Для этого раствор, содержащий 3 конъюгата анти-Мор-Аu, анти-Амф-Аu и анти-Кан-Аu в рабочих разведениях, диспергировали на мембрану для конъюгата. На хроматографическую мембрану в тестовой зоне наносили 3 полоски с растворами конъюгатов Амф-Ова, Мор-Ова и Кан-Ова в рабочих концентрациях. Расстояние между тестовыми линиями, а также между тестовой линией КАН (каннабиноиды) и контрольной линией было установлено равным 3,5 мм (расстояние между центрами линий).

При соединении 3-х видов ИХА на одной тест-полоске параметры анализа изменяются, т.к. мембрана для конъюгата оказывается «нагруженной» в 3 раза больше, чем при ИХА на один аналит. Через иммунохроматографическую мембрану проходит поток с большими концентрациями иммунореагентов, поэтому характеристики латерального потока изменяются. Результаты определения оптимальных разведений конъюгатов с коллоидным золотом для ИХА опиатов, амфетаминов и каннабиноидов составляют: разведение 1:4000 -1:8000 для анти-Мор-Аu (и концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл Мор-Ова (ИХА опиатов); анти-Амф-Аu - 1:2000-1:6000, Амф-Ова - от 0,5 до 2 мкг/мл (ИХА амфетаминов); 1:3000-1:12000 для анти-Кан- Au и от 0,25 до 3 мкг/мл для Кан-Ова (ИХА каннабиноидов). Разведение антивидовых антител составило 1:2000 -1:5000.

Пример 10. Иммобилизация в зону конъюгат Ат-метки специфических (моноклональных) антител к наркотику, меченных золотом.

Для каждого конъюгата (анти-Мор-Аи, анти-Амф-Аu, анти-Кок-Аu и анти-Кан-Аu) были подобраны условия иммобилизации, отличающиеся по концентрации антител и значениям pH. Концентрацию антител (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан) выбирали с учетом количества белка, необходимого для стабилизации поверхности НКЗ. Характер адсорбции антител на поверхности НКЗ обусловливает их ориентацию на поверхности частицы, возможность взаимодействия с антигенными детерминантами и соответственно аффинность конъюгата. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Поскольку для растворения реагентов исключено применение буферов высокой ионной силы, а также многих консервантов (содержащих атомы меди и ртути), т.к. они вызывают разрушение конъюгатов, рекомендуют использовать низкомолярные буферы. Поэтому в качестве консерванта в работе был использован 0,1% азид натрия.

Пример 11. Определение предела обнаружения исследуемых наркотических веществ с помощью разработанной тест-системы.

Для приготовления стандартных растворов наркотических и психотропных веществ в слюне человека были использованы калибраторы, контроли и мульти-контроли фирмы «Abbott» (США), используемые для калибровки и проверки работы (контроля качества) наборов реагентов к ТДх, FLx-анализатору данной фирмы.

Вторичные антитела к моноклональным антителам мыши, использованные для сорбции в контрольной зоне тест-системы, получали на заказ в фирме «Биалекса», Россия.

Компоненты для производства иммунохроматографических тестов (пробоотборники, емкости для сбора и хранения слюны и пластиковый корпус для тест-полосок) были закуплены в фирме Surescreen, Великобритания. После отбора пробы из ротовой полости слюна помещалась в емкости для сбора и хранения, из которых наносилась в количестве по три капли жидкости на тест-полоски, обработанные в соответствии с предлагаемым изобретением. Через 10 мин визуально оценивались результаты реакции.

ОТРИЦАТЕЛЬНО: Наличие по одной линии темно-розового цвета на уровне маркировок МАРИХ (каннабиноиды), ОПИЙ (опиаты), АМФ (амфетамины), и КОК(кокаин), а также линия темно-розового цвета на уровне маркировки К (контроль) каждой полоски. Линии могут быть яркими или бледными.

ПОЛОЖИТЕЛЬНО: Отсутствие линий темно-розового цвета на уровне маркировок МАРИХ, ОПИЙ, АМФ и КОК и наличие одной линии темно-розового цвета на уровне маркировки К (контроль) каждой полоски. Линия может быть яркой или бледной.

ОШИБКА: Отсутствие линии темно-розового цвета на уровне маркировки К через 10 мин после внесения образца. Анализ следует повторить с использованием другого планшета.

Для разработанного способа иммунохроматографических тест-систем проведено исследование основных аналитических характеристик - чувствительности и специфичности определения наркотических соединений.

При приготовлении стандартов наркотических и психотропных веществ для разведения использовалась слюна здоровых лиц. Концентрации определяемых веществ варьировали в широком диапазоне, от 0 нг/мл до 100 нг/мл.

Предел обнаружения устанавливали как минимальную концентрацию аналита, при которой он может быть достоверно обнаружен. Для каждого аналита готовили растворы определяемого вещества в ФБС (фосфатном буферном растворе) различных концентраций, близких к предполагаемому значению предела обнаружения. Каждый полученный стандартный раствор исследовали с помощью разработанного ИХА 20 раз. Для каждой концентрации определяли количество положительных и отрицательных результатов теста. Предел обнаружения определяли как концентрацию аналита, при которой процент положительных результатов теста равен или более 95%. Полученные результаты определения предела обнаружения морфина представлены в таблице 2, были использованы стандартные растворы в диапазоне концентраций от 10 до 100 нг/мл.

Результаты определения предела обнаружения амфетамина, кокаина и каннабиноидов представлены в таблицах 3-5.

Согласно полученным данным предел обнаружения наркотических веществ с помощью разработанного ИХА составляет: для опиатов - 40 нг/мл, для каннабиноидов - 4 нг/мл, для кокаина - 20 нг/мл и для амфетаминов - 50 нг/мл.

Пример 12. Определение кросс-реактивности синтезированных иммунореагентов для разработанной тест-системы.

Специфичность метода анализа, или его кросс-реактивность можно определить как степень влияния на результат исследования соединений, отличных по химической структуре от анализируемого вещества, используемого как калибратор или стандарт. Чувствительность и специфичность любого иммунохимического анализа зависит от чувствительности и специфичности используемых антител. Определение данных иммунохимических характеристик очень важно для оценки получаемых результатов иммунохимических исследований и соответствия их выполнению поставленных задач.

Определение кросс-реактивности синтезированных иммунореагентов проводили при добавлении в реакционную среду соединений, условно разделенных на 2 группы: вещества, являющиеся близкородственными к исследуемому веществу, и вещества, наиболее часто встречающиеся в наркологической практике. При этом было рассмотрено влияние различных концентраций исследуемых веществ в аналитах слюны при постоянной концентрации нанесенных на мембраны тест-системы реагентов.

Проведенные испытания показали, что антитела перекрестно реагируют с близкими по структуре соединениями. Вещества, отличающиеся по своей природе от исследуемых веществ, не ингибируют специфическую реакцию взаимодействия антител и антигена даже в высоких концентрациях.

Таким образом, апробация на модельных смесях биологических объектов разработанной тест-системы показала, что антитела обладают высокой специфичностью только для определяемых соединений (морфин, амфетамин, кокаин, каннабиноиды), поскольку не обнаружено перекрестной, реакции с наркотическими веществами других классов.

Апробация разработанных наборов реагентов и статистический анализ результатов

Медицинские испытания Наборов реагентов проводили согласно ГОСТ Р 15.013-94 в Московском Научно-практическом центре наркологии Департамента здравоохранения г.Москвы (МНПЦ Наркологии) и в Наркологическом диспансере №1 г.Москвы (НД №1). В соответствии со стандартом лабораторной практики в дальнейшем проводилась оценка достоверности результатов разработанного метода анализа. Для этого результаты, полученные при проведении анализа, сравнивались с результатами исследования референтным методом анализа - хромато-масс-спектрометрии, имеющего высокую аналитическую специфичность и надежность, что позволяет дать оценку отклонений получаемых результатов от наиболее вероятной величины.

В ходе испытаний в МНПЦ Наркологии Наборы реагентов были апробированы на 60 человеках, в том числе: на 50 пациентах, больных наркоманией, находящихся в состоянии наркотического опьянения и 10 здоровых донорах, не принимавших наркотики. Процедура анализа проходила согласно Инструкции. Затем собранные образцы жидкости ротовой полости анализировали с помощью подтверждающего метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ("Милихром А-02", Россия). Результаты испытаний показаны в Таблице 6.

Медицинские испытания Набора реагентов в Наркологическом диспансере №1 включали обследование 40 человек, из них 32 пациентов, больных наркоманией, находящихся в состоянии наркотического опьянения и 8 здоровых доноров, не принимавших наркотики. Результат обследования также сопоставляли с результатом подтверждающего метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ("Милихром А-02", Россия). Результаты испытаний представлены в Таблице 7.

В обоих случаях медицинские испытания прошли успешно. Согласно заключениям комиссий, Наборы реагентов соответствуют заявленным в Инструкции характеристикам; метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Сводные данные по количеству истинно положительных (ИП), истинно отрицательных (ИО), ложноположительных (ЛП) и ложноотрицательных (ЛО) результатов, а также данные по чувствительности (Ч) и специфичности (С) определения каждого класса наркотиков, приведены в Таблице 8. Характеристики метода рассчитывали по следующим формулам:

Чувствительность метода:

Специфичность метода:

Согласно результатам данного статистического анализа чувствительность определения наркотических веществ с помощью разработанного согласно изобретению Набора реагентов ОРАНАРК составляет 95-100%, специфичность определения - 98-100%.

Таким образом, разработан иммунохроматографический метод анализа исследуемых наркотических веществ в биологической жидкости человека (слюне) с высокой чувствительностью, специфичностью и надежностью, предназначенный для экспресс определения наркотических веществ. Время проведения анализа составляет 10 минут, результат анализа сохраняется в течение нескольких часов. Разработанный метод позволит не только эффективно решать вопросы аналитической диагностики, но значительно снизить затраты на лечение за счет снижения ежегодного прироста заболеваемости на 10% в год.

Таблица 1
Конъюгат антител с НКЗ pH Концентрация антител (анти-Мор, анти-Амф, анти-Кок и анти-Кан), нг/мл
анти-Мор-Au 9,0 65
анти-Амф-Au 8,8 80
анти-Кок-Au 8,6 75
анти-Кан-Au 9,1 50
Таблица 2
Концентрация морфина, нг/мл Число положительных результатов теста Число отрицательных результатов теста % положительных результатов теста
0 0 20 0
10 0 20 0
20 6 14 30
40 19 1 95
60 20 0 100
100 20 0 100
Таблица 3
Концентрация амфетамина, нг/мл Число положительных результатов теста Число отрицательных результатов теста % положительных результатов теста
0 0 20 0
10 0 20 0
30 4 16 20
50 20 0 100
70 20 0 100
100 20 0 100
Таблица 4
Концентрация кокаина, нг/мл Число положительных результатов теста Число отрицательных результатов теста % положительных результатов теста
0 0 20 0
5 0 20 0
10 5 15 25
20 19 1 95
50 20 0 100
100 20 0 100
Таблица 5
Концентрация Δ9-ТГКК, нг/мл Число положительных результатов теста Число отрицательных результатов теста % положительных результатов теста
0 0 20 0
2 0 20 0
4 5 15 25
10 19 1 95
20 20 0 100
50 20 0 100
Таблица 6
Обследо-
ванные
больные
Результат визуальной детекции Результат подтверждающего теста Клинический диагноз
МОР АМФ КАН КОК МОР АМФ КАН КОК
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
№1 + - - - + - - - Опийная наркомания
№2 + - - - + - - - Опийная наркомания
№4 + - - - + - - - Опийная наркомания
№7 + - - - + - - - Опийная наркомания
№9 + - - - + - - - Опийная наркомания
№10 + - - - + - - - Опийная наркомания
№13 + - - - + - - - Опийная наркомания
№15 + - - - + - - - Опийная наркомания
№19 - - - - + - - - Опийная наркомания
№24 + - - - + - - - Опийная наркомания
№27 + - - - + - - - Опийная наркомания
№31 + - - - + - - - Опийная наркомания
№33 + - - - + - - - Опийная наркомания
№39 + - - - + - - - Опийная наркомания
№41 + - - - + - - - Опийная наркомания
№42 + - - + + - - - Полинаркомания
№45 + - - - + - - - Полинаркомания
№47 + + - - + - - - Полинаркомания
№48 + - - - + - - - Полинаркомания
№49 + - - - + - - - Полинаркомания
№50 + - - - + - - - Полинаркомания
№11 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№14 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№18 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№20 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№23 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№29 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№35 - + + - - + - - Полинаркомания
№38 - + - - - + - - Полинаркомания
№43 - + - - - + - - Полинаркомания
№5 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№12 - - + - - - + - Гашишная наркомания
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
№16 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№17 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№22 - - - - - - + - Гашишная наркомания
№26 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№30 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№32 - - + + - - + - Гашишная наркомания
№36 - - + - - - + - Полинаркомания
№37 - - + - - - + - Полинаркомания
№44 - - + - - - + -. Полинаркомания
№46 - - + - - - + - Полинаркомания
№3 - - + - - - - + Кокаиновая наркомания
№6 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№8 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№21 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№25 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№28 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№34 - - - + - - - + Полинаркомания
№40 - - - + - - - + Полинаркомания
№51 - - - - - - - - Здоровый донор
№52 - - - - - - - - Здоровый донор
№53 - - - - - - - - Здоровый донор
№54 - - - - - - - - Здоровый донор
№55 - - - - - - - - Здоровый донор
№56 - - - - - - - - Здоровый донор
№57 - - - - - - - - Здоровый донор
№58 - - - - - - - - Здоровый донор
№59 - - - - - - - - Здоровый донор
№60 - - - - - - - - Здоровый донор
Таблица 7
Обследованные больные Результат метода ИХА Результат метода ВЭЖХ
МОР АМФ КАН КОК МОР АМФ КАН КОК Клинический диагноз
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
№1 + - - - + - - - Опийная наркомания
№3 + - - - + - - - Опийная наркомания
№4 + - - - + - - - Опийная наркомания
№5 + - + - + - + - Опийная наркомания
№8 + - - - + - - - Опийная наркомания
№11 + - - + + - - + Опийная наркомания
№13 + - - - + - - - Опийная наркомания
№17 + - - - + - - - Опийная наркомания
№21 - - - - + - - - Опийная наркомания
№25 + - - + + - - - Опийная наркомания
№26 + - + - + - + - Опийная наркомания
№29 + - - - + - - - Полинаркомания
№30 + + - - + + - - Полинаркомания
№32 + + - - + + - - Полинаркомания
№6 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№10 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№15 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№18 - + - + - + - + Амфетаминовая наркомания
№19 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№22 - + - - - + - - Амфетаминовая наркомания
№23 - + + - - + + - Полинаркомания
№27 - + - - - + - - Полинаркомания
№31 - + + - - + - - Полинаркомания
№2 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№7 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№12 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№20 - - + - - - + - Гашишная наркомания
№24 - + + - - - + - Гашишная наркомания
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
№9 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№14 - - + + - - + + Кокаиновая наркомания
№16 - - - + - - - + Кокаиновая наркомания
№28 - - - + - - - + Полинаркомания
№33 - - - - - - - - Здоровый донор
№34 - - - - - - - - Здоровый донор
№35 - - - - - - - - Здоровый донор
№36 - - - - - - - - Здоровый донор
№37 - - - - - - - - Здоровый донор
№38 - - - - - - - - Здоровый донор
№39 - - - - - - - - Здоровый донор
№40 - - - - - - - - Здоровый донор
Таблица 8
Определяемая группа веществ ИП ИО ЛП ЛО Ч, % С, %
опиаты 33 65 0 2 95 100
амфетамины 18 80 2 0 100 98
каннабиноиды 17 80 2 1 95 98
кокаин 11 86 3 0 100 97

1. Способ латеральной проточной иммунохроматографии для определения наркотических средств в ротовой жидкости человека, включающий: сбор ротовой жидкости коллектором с последующим нанесением ее на тест-полоску, содержащую последовательно расположенные зоны: конъюгат Ат-метки, содержащий специфические антитела к наркотику, меченные золотом; тестовую, содержащую иммобилизованные конъюгаты аналит: овальбумин; и контрольную, содержащую антивидовые антитела; с последующим определением действительности теста путем наблюдения присутствия окрашенной полосы в контрольной зоне, и определение присутствия наркотика в ротовой жидкости путем наблюдения появления окрашенной полосы в тестовой зоне, причем в качестве конъюгата использют аналит: белок, полученный карбодиимидным методом из макромолекулярного носителя овальбумина, в качестве аналита используют гаптены, являющиеся производными наркотических веществ (морфина, амфетамина, кокаина и тетрагидроканнабинола), содержащие спейсер с карбоксильной группой при соотношении количества молей гаптена на молекулу белка, равном 12-15, а в качестве конъюгата Ат-метка используют моноклональные антитела к исследуемым антигенам наркотических веществ, полученные гибридомной технологией на основе конъюгированных антигенов, полученных из макромолекулярного носителя бычьего сывороточного альбумина и указанных выше гаптенов, производных наркотических веществ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для мультианалитического иммунохроматографического определения опиатов, амфетаминов и каннабиноидов тестовая зона состоит из 3 частей, расстояние между центрами линий которых, а также центрами зон конъюгата Ат-метки и контрольный составляет 3-4 см, а результаты определения оптимальных разведений конъюгатов с коллоидным золотом для ИХА опиатов, амфетаминов и каннабиноидов составляют:
разведение 1:4000-1:8000 для анти-Мор-Аu (концентрация от 0,1 до 1 мкг/мл Мор-Ова (ИХА опиатов);
разведение анти-Амф-Аu - 1:2000-1:6000, (концентрация Амф-Ова - от 0,5 до 2 мкг/мл (ИХА амфетаминов);
разведение 1:3000-1:12000 для анти-Кан-Аu и (концентрация от 0,25 до 3 мкг/мл для Кан-Ова (ИХА каннабиноидов),
при этом разведение антивидовых антител составило 1:2000-1:5000.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, в частности паразитологии, и может быть использовано для диагностики описторхоза у больных циррозом печени. .

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и может быть использовано для оценки функционального состояния почек. .

Изобретение относится к области фармакологии и может быть использовано для определения дубильных веществ в растительном сырье. .
Изобретение относится к медицине, в частности к оториноларингологии и иммунологии. .
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к психоневрологии, и описывает способ прогнозирования восстановления неврологических функций у больных в остром периоде ишемического инсульта путем проведения клинических и биохимических исследований общей концентрации альбумина (ОКА) в сыворотке крови в г/л, где дополнительно на 5-7 день заболевания определяют эффективную концентрацию альбумина (ЭКА), рассчитывают резерв связывания альбумина (РСА) и при величине этого показателя менее единицы прогнозируют отрицательный результат восстановления неврологических функций у больных в остром периоде ишемического инсульта.
Изобретение относится к медицине, к биологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения развития злокачественного процесса при опухолях головного мозга после оперативного лечения.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и описывает способ оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии рака мочевого пузыря путем исследования пациента, при котором производят регистрацию максимальной интенсивности аутофлюоресценции опухолевых тканей в зеленой области спектра на этапе первичной диагностики и через 1 месяц после проведения предоперационной химиотерапии и при увеличении у пациента значений максимальной интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани на 15% от исходных и более эффективность лечения оценивают как частичную регрессию опухолевого процесса, при отсутствии изменений показателей интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани от исходных определяют стабилизацию процесса, при уменьшении показателей интенсивности аутофлюоресценции опухолевой ткани на 15% и более от исходных отмечают прогрессирование опухолевого процесса.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации фторхинолоновых антибиотиков, конкретно флюмеквина, в мышечных тканях, сыворотке крови и пищевых продуктах флуориметрическим методом, позволяющее понизить предел обнаружения с целью регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний, исследовании фармакокинетики и фармакодинамики.
Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, хирургии, реаниматологии

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска снижения уровня резистентности организма к острым респираторным заболеваниям у детей в возрасте 3-7 лет по степени гемолиза эритроцитов капиллярной крови

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска снижения уровня резистентности организма к острым респираторным заболеваниям у детей в возрасте 3-7 лет
Изобретение относится к области медицины

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа
Изобретение относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использовано для дифференцированного прогноза течения пограничных психических расстройств
Изобретение относится к медицине, может быть использовано в кардиологии и терапии и описывает способ оценки эффективности лечения липидемии путем исследования сыворотки крови до и после лечения, где дополнительно перед исследованием проводят трехкратное замораживание и оттаивание сыворотки крови по 20 минут и 10 минут соответственно, а затем определяют аполипопротеин В, липопротеин (а), их соотношение, общий холестерол и при увеличении отношения аполипопротеина В к липопротеину (а) на 50% и более и снижении общего холестерола на 30% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают лечение липидемии как эффективное
Изобретение относится к медицине и описывает способ прогнозирования степени тяжести перинатального гипоксического поражения центральной нервной системы у новорожденных путем изучения биохимического анализа плазмы крови, где в плазме пуповинной крови определяют уровень пероксинитрита и при его значениях 133,6-258 нмоль/л прогнозируют среднюю степень тяжести поражения ЦНС, а при 259 нмоль/л и выше - тяжелую степень
Наверх