Регулирование характеристик аромата и свежести фруктового сока

Способ включает регулирование в соке концентрации соединения, выбранного из группы, состоящей из лимонина, изолимонина, номилина и их смесей, до концентрации уровня горького вкуса указанного соединения. В способе может быть дополнительно осуществлено регулирование в соке соотношения Брикс/кислота для снижения концентрации соединения или регулирование в соке концентрации полиметоксилированных флавонов до уровня ниже порогового уровня их горького вкуса. Фруктовый сок или обработанный сок, имеющие менее горький вкус, чем необработанный фруктовый сок, каждый из которых содержит соединение, выбранный из группы, состоящей из лимонина, изолимонина, номилина и их смесей, в концентрации ниже порогового уровня горького вкуса указанного соединения. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.

 

Настоящее изобретение имеет приоритет заявки США серийный №60/978515 от 9 октября 2007 года, под названием «Регулирование характеристик аромата и свежести фруктового сока», включенной в данное описание полностью путем ссылки.

Данное изобретение относится к регулированию характеристик аромата и свежести фруктового сока. В частности, данное изобретение относится к регулированию характеристик аромата и свежести цитрусового фруктового сока и, в частности апельсинового сока.

Цитрусовые фрукты давно известны как ценный источник важных питательных веществ. Позднее, цитрусовые в качестве источника, полезного для здоровья или пригодного для профилактики и лечения заболеваний, были официально признаны как обладающие благоприятными и полезными свойствами при употреблении в пищу. Соответственно, имеется общее мнение, что увеличение потребления пищи цитрусового происхождения является полезной и важной задачей в общей схеме здоровья человека. Многие потребители получают также удовольствие от цитрусовых фруктов просто потому, что они являются вкусными.

Одним из удобных способов употребления цитрусовых продуктов является употребление в виде их сока. Сок можно легко получать и транспортировать, и он удобен в употреблении. Свежий, или «не из концентрата», сок является лидером по вкусу и качеству. Сок также можно концентрировать и затем восстанавливать его влагосодержание для удобства потребителя. Концентрированный сок также доставляют от источника к потребителю эффективным и недорогим способом. Также сок более легко, по сравнению с фруктами, потребляют те люди, которые имеют проблемы с употреблением твердых фруктов.

Однако некоторые потребители не любят такие свойства цитрусовых соков, как горечь, кислый вкус, неприятные привкусы, терпкость, золотисто-коричневый цвет и густая консистенция. Все цитрусовые фрукты, включая грейпфруты, апельсины, мандарины, лаймы и лимоны, могут иметь к этому отношение. Некоторые потребители предпочитают соки, имеющие низкий уровень сладости, тогда как другие предпочитают очень сладкий продукт. Кроме того, часто трудно достичь постоянства вкусовых свойств, например, начиная с начала сезона и до его окончания.

Горечь часто представляет собой главный вопрос для потребителя. Низкий уровень горечи может обеспечивать желаемый вклад в органолептические свойства и характеристики сока для многих потребителей. Такие потребители получают удовольствие от пикантной вкусовой ноты на низком уровне горечи. Однако большинство потребителей также соглашается с тем, что избыточная горечь неблагоприятно влияет на органолептические свойства и характеристики сока, делая его неприятным для потребителя. Потребители также часто связывают горечь с недостаточной свежестью, концентрированным соком и/или соком низкого качества.

Соединения, придающие горький вкус, присутствуют в любом виде цитрусовых фруктов в различающихся количествах. Различие в концентрациях соединений, придающих такой вкус, имеется между сортами культурного растения одного и того же фрукта и между фруктами одного и того же культурного растения от начала и до окончания сезона. Следовательно, источник фруктов, время сезона и другие переменные оказывают влияние на концентрации соединений, придающих горький вкус.

Терпкость является характеристикой соков, в частности, цитрусовых соков, которую потребители часто находят нежелательной. В частности, терпкость цитрусового сока часто характеризуется как бархатистое, покрывающее ротовую полость ощущение. Такое ощущение во рту рассматривается как неприятное многими потребителями.

Потребителей также беспокоит кислый вкус фруктового сока. Потребители часто полагают, что цитрусовые соки являются кислыми. Потребители часто связывают кислый вкус не только с неприятно резким вкусом, но также с ощущениями расстройства или дискомфорта в желудке и отрыжкой.

До настоящего времени предпринимались лишь ограниченные попытки для уменьшения горечи, кислого вкуса и других нежелательных органолептических свойств и характеристик, обычно путем удаления некоторых соединений. Одним из таких соединений является лимонин. В других способах из источника сока исключалась часть фруктов, такая как семена и кожура для минимизирования концентрации соединения с горьким вкусом.

Желательной характеристикой для потребителя также является свежесть. Часто сок из концентрата рассматривается как имеющий более низкое качество, чем свежий сок. Известны различные способы обработки замороженных соков и концентратов соков. Однако до настоящего времени сок из концентрата страдает неблагоприятным действием на вкус, и полностью удовлетворяющий пожеланиям сок, либо свежий, либо замороженный, не стал коммерчески доступным.

Таким образом, существует потребность в соке, горький вкус в котором регулировался бы в границах, которые потребители обычно находят приятными, но не избыточно горькими. Также существует потребность в соке со свежим вкусом.

Существо изобретения

Первый вариант изобретения относится к регулированию горечи фруктового сока, в частности, цитрусового сока.

Второй вариант изобретения относится к регулированию горечи и свежести цитрусового сока путем регулирования концентраций ключевых горьких соединений, придающих вкус.

Третий вариант изобретения относится к регулированию терпкости фруктового сока, в частности апельсинового сока.

Четвертый вариант изобретения относится к регулированию кислого вкуса фруктового сока, в частности апельсинового сока.

Пятый вариант изобретения относится к регулированию сладости фруктового сока, в частности апельсинового сока.

На прилагаемых чертежах

Фиг.1 - схема реакций, демонстрирующая ферментативное разложение лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (1) через лимоноат А-кольцевой лактон (2) с получением лимонина (3), имеющего горький вкус.

Фиг.2 - график влияния значения рН на время-зависимое образование лимонина (3) в водном растворе лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (1), хранящегося при 20°С.

Фиг.3 - график влияния температуры на время-зависимое образование лимонина (3) в водном растворе лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (1), при рН 3,0.

Фиг.4 - RP-ВЭЖХ-МС/МС-хроматограмма, полученная для водного раствора (рН 3,0) лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (1), выдержанного в течение десяти недель при 30°С и демонстрирующего пики лимонина (3) и неизвестного продукта (4) гидролиза.

Фиг.5 - ¹Н-ЯМР-спектр (400 МГц) очищенного С₁₇-эпилимонина (4).

Фиг.6 - последовательность реакций, показывающая гидролитическое разложение лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (1) с образованием лимонина (3) и С₁₇-эпилимонина (4) через фурфурилиден-карбокатион в качестве ключевого промежуточного соединения.

Фиг.7 - разложение лимонина (А) и С₁₇-эпилимонина (В) при хранении апельсинового сока при 20°С как функция времени.

Фиг.8 - образование лимонина и С₁₇-эпилимонина (А) и соотношение (В) С₁₇-эпилимонина/лимонина при термической обработке апельсинового сока в зависимости от времени.

Настоящее изобретение относится к регулированию органолептических свойств фруктового сока. В частности, варианты данного изобретения относятся к регулированию горечи в цитрусовом соке посредством регулирования концентраций ключевых соединений, придающих горький вкус, регулирования терпкости посредством регулирования причины ключевых терпких свойств, регулирования кислого вкуса посредством регулирования концентраций и относительных пропорций кислот и регулирования сладости посредством регулирования концентраций и относительных пропорций сахаров.

Изобретение также относится к приданию соку свежего вкуса. В частности, варианты данного изобретения относятся к регулированию компонента во фруктовом соке для получения свежего вкуса сока.

Квалифицированные специалисты отдают себе отчет, что концентрация придающего вкус компонента в пищевом продукте должна превысить пороговый уровень вкуса прежде, чем потребитель будет способен ощутить вкус данного придающего вкус компонента. Пороговые уровни ощущения различных вкусовых характеристик, таких как терпкость и горечь, являются разными. Следовательно, проводимые до настоящего времени работы по идентификации соединений, которые вносят свой вклад во вкусовые характеристики, относились к тем соединениям, которые присутствуют в концентрациях, которые превышают значимый пороговый уровень вкуса.

Авторы настоящего изобретения установили, что горький вкус сока цитрусовых фруктов, в частности апельсинового сока, вызван, по крайней мере частично, взаимодействием трех групп горьких веществ, и на него оказывает влияние концентрация сахара в соке. Такое открытие синергизма между данными тремя группами горьких веществ и сахаром образует основу возможности регулирования горечи цитрусового сока. До настоящего времени квалифицированным специалистам не было известно, что три группы горьких веществ и сахар регулируют ощущение горечи апельсинового сока.

Лимонин - вещество, которое, как известно квалифицированным специалистам, вызывает горечь в апельсиновом соке, само по себе полностью не несет ответственности за горечь апельсинового сока. Скорее, горечь в апельсиновом соке вызвана взаимодействием следующих трех групп горьких веществ:

(1) лимонин, изолимонин и, в минимальной степени, номилин;

(2) полиметоксилированные флавоны (ПМФ); и

(3) лимоноидные β-D-глюкопиранозиды.

Таким образом, регулирование в соке соответствующих концентраций данных соединений вместе с регулированием концентрации сахара будет приводить к регулированию чувства горечи в соке.

Концентрации членов данных групп горьких веществ изменяются как функция от сорта культурного растения, времени роста и сезона сбора урожая (т.е. в зависимости от начала, середины или конца сезона) и условий переработки. Например, установлено, что лимонин образуется в большей степени в соке, полученном из апельсинов, собранных в начале и середине сезона, чем в том случае, когда сок получают из апельсинов, собранных в конце сезона. При понимании взаимоотношения между тремя группами горьких веществ и сахара горечь апельсинового сока и цитрусовых соков, включающих данные компоненты, можно будет регулировать.

Вкусовые пороговые уровни членов данных групп горьких веществ приведены в следующей таблице 1.

Таблица 1
Компонент	Пороговый уровень горького вкуса, мкмоль/л
Лимонин	4
Номилин	13
ПМФ	>130
5,7,8,3',4'-пентаметоксифлавон	32,3
3,5,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон	>250
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавон	56
3,5,6,7,3',4'-гексаметоксифлавон	19
5,7,8,4'-тетраметоксифлавон	>120
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон	103
Лимоноид-β-D-глюкопиранозиды	>130
5,6,7,4'-тетраметоксифлавон	44
3,5,6,7,8,3',4'-гептаметоксифлавон	24-31
5,6,7,8,4'-пентаметоксифлавон	93
4'-гидрокси-3',5,6,7,8-пентаметоксифлавон	25
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон-3-O-β-D-глюкопиранозид	78
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавон-3-O-β-D-глюкопиранозид	61
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавонглюкозид	61
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавонглюкозид	78
5,7,8,3',4'-пентаметоксифлавон	32
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавон	56
3,5,6,7,3',4'-гексаметоксифлавон	19
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон	103
5,6,7,4'-тетраметоксифлавон	150
7,3',4'-триметоксифлавон	>400
7,8,3',4'-тетраметоксифлавон	>400
Лимонин-17-β-D-глюкопиранозид	106
17-β-D-глюкопиранозид деацетилномилиновой кислоты	68
17-β-D-глюкопиранозид эпиизобакуноевой кислоты	42
β-glpc номилиновой кислоты	>800
Номилин-β-glpc	>700
Обакунон-β-glpc	49
Деацетилномилин	>106

Как можно видеть из структурных формул данных соединений, члены данных групп горьких веществ обладают общими структурными отличительными признаками.

Авторы настоящего изобретения установили, что предпороговые концентрации ПМФ и, в меньшей степени, номилина, усиливают вызванную лимонином горечь в продуктах из апельсинов, таких как сок. Такой эффект является неожиданным, поскольку квалифицированный специалист не мог бы ожидать, что соединение, которое присутствует до содержания ниже вкусового порогового уровня, вносит вклад в ощущение горечи.

Номилин присутствует в концентрации, близкой к пороговой, в апельсиновом соке сорта Хэмлин и может достигать пороговой концентрации в начале сезона. Лимоноидные β-D-глюкопиранозиды присутствуют примерно на пороговом уровне в апельсиновом соке сортов Хэмлин и Валенсия.

Данные члены этих групп горьких веществ являются очень горькими. В частности, они существенно более горькие, чем соединения, обычно находящиеся в газированных безалкогольных напитках и чае. Например, лимонин является примерно в 200 раз более горьким, чем кофеин и в 150 раз более горьким, чем катехин. Номилин является примерно в 150 раз более горьким, чем кофеин и в 45 раз более горьким, чем катехин.

В то время, как каждый член групп горьких веществ имеет вкусовой порог, горечь не является линейно связанной с концентрацией. Например, удвоение концентрации компонентов не приводит к удвоению горького вкуса. Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что концентрация соединения не должна достигать вкусового порога для того, чтобы соединение вносило свой вклад в горький вкус. Скорее, соединения действуют синергетически, приводя к более горькому вкусу, чем можно было бы ожидать, исходя из суммы индивидуальных частей.

Сахар измеряют в градусах Брикс (Brix). Авторы настоящего изобретения установили, что ощущаемая (воспринимаемая) горечь снижается по мере увеличения Брикса и, в частности, по мере увеличения соотношения Брикс/кислота.

Таким образом, с использованием приведенных в настоящем описании указаний квалифицированный специалист может регулировать горечь цитрусового сока путем регулирования Брикса, в частности соотношения Брикс/кислота, и концентраций данных членов этих групп горьких веществ в продукте сока. Например, концентрация данных соединений может быть снижена с использованием подходящей переработки, такой как ионный обмен, перегонка или обратный осмос. Аналогично, различные соки, имеющие разные концентрации каждого из соединений, могут быть смешаны с получением сока, который имеет более низкие концентрации, чем те концентрации, которые приводят к горькому вкусу.

Авторы настоящего изобретения установили, что лимонин образуется различными путями. Обычно лимонин не присутствует в цельном фрукте при концентрации выше порогового уровня вкуса. Однако лимонин образуется посредством лактонизации, ускоряемой ферментами.

На фиг.1 проиллюстрирован данный путь. Лимонин-17-β-D-глюкопиранозид 1 превращается под действием 17-β-D-глюкопиранозилглюкозидазы с образованием лимонат-А-кольцевой лактозы 2. Данная лактоза восстанавливается в присутствии лимонин-D-кольцевой лактонгидролазы в кислых условиях (рН<6,5) с образованием лимонина 3. Поскольку А-кольцевой лактон преобразуется в лимонин-17-β-D-глюкопиранозид по мере созревания фрукта, концентрация глюкозида может достигать примерно 200 вес.ч. н.м.

Также предполагается, что лимонин может образовываться в соке за счет кислотного гидролиза. Такой кислотный гидролиз ускоряется при понижении рН и увеличении температуры и времени. Таким образом, другие способы регулирования лимонина в соке заключаются в отсутствии нагревания, хранении сока в течение ограниченного времени при низкой температуре и/или в увеличении рН сока.

Концентрация каждого члена группы горьких веществ может быть определена с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Однако более определенное измерение мог бы обеспечить анализ методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХМС) или анализ методом ЖХМС/МС. Квалифицированному специалисту понятны данные и другие методы измерения концентраций членов групп горьких веществ.

Авторы настоящего изобретения установили, что, как и в случае с горечью, множество соединений, присутствующих в апельсиновом соке в концентрации ниже порогового уровня терпкости, вносит свой вклад в вяжущее ощущение во рту. Вкусовые пороговые уровни для данных терпких соединений индивидуально приведены ниже в следующей таблице 2.

Таблица 2
Компонент	Пороговый уровень терпкого вкуса, мкмоль/л
5,7,8,3',4'-пентаметоксифлавон	13,3
3,5,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон	125
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавон	24
3,5,6,7,3',4'-гексаметоксифлавон	9
5,7,8,4'-тетраметоксифлавон	44
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон	51
5,6,7,4'-тетраметоксифлавон	21
3,5,6,7,8,3',4'-гептаметоксифлавон	4-5
5,6,7,8,4'-пентаметоксифлавон	19
4'-гидрокси-3',5,6,7,8-пентаметоксифлавон	6
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон-3-О-β-D-глюкопиранозид	20
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавон-3-О-β-D-глюкопиранозид	21
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавонглюкозид	21
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавонглюкозид	20
5,7,8,3',4'-пентаметоксифлавон	13
5,6,7,3',4'-пентаметоксифлавон	24
3,5,6,7,3',4'-гексаметоксифлавон	9
5,6,7,8,3',4'-гексаметоксифлавон	51
5,6,7,4'-тетраметоксифлавон	31
7,3',4'-триметоксифлавон	15
7,8,3',4'-тетраметоксифлавон	44
Лимонин-17-β-D-глюкопиранозид	17
17-β-D-глюкопиранозид деацетилномилиновой кислоты	27
17-β-D-глюкопиранозид эпиизобакуноевой кислоты	16
Деацетилномилин	13,2
Лимонин	4
Изолимонин	10 мг/л

Авторы настоящего изобретения установили, что воспринимаемая сладость относится к относительным концентрациям по крайней мере сахаров глюкозы, фруктозы и сахарозы. Концентрации и относительные пропорции данных сахаров влияют на ощущение сладости.

Пороговые уровни сладкого вкуса глюкозы, фруктозы и сахарозы известны в данной области. Относительные пропорции данных сахаров переменны для соков различных сортов культурных растений и времени сезона. Однако с помощью указаний, обеспеченных в данном изобретении, квалифицированный специалист сможет регулировать сладость цитрусового сока путем регулирования концентраций данных сахаров в продукте сока. Например, концентрация данных сахаров может быть уменьшена с помощью подходящей переработки, такой как ионный обмен, перегонка или обратный осмос. Аналогично, различные соки, имеющие разные концентрации каждого из соединений, могут быть смешаны с получением сока, который имеет более низкие концентрации данных соединений, чем концентрации, которые приводят к кислому вкусу.

Авторы настоящего изобретения также установили, что присутствии изолимонина, соединения, образующегося из одного из данных лимоноидных β-D-глюкопиранозидов, является показателем свежести. Изолимонин также известен как С₁₇-эпилимонин. Изолимонин образуется путем кислотного гидролиза лимонина после пастеризации. Изолимонин также образуется неферментативным путем из лимонин-17-β-D-глюкопиранозида. Концентрация изолимонина в замороженном концентрате апельсинового сока примерно в два раза выше концентрации в свежем апельсиновом соке, указывая на то, что «условия стресса» для сока также вносят вклад в образование изолимонина. Таким образом, присутствие изолимонина в концентрации, более высокой чем концентрация в свежем продукте, указывает на то, что продукт может быть не свежим (поскольку изолимонин образуется с течением времени) или был заморожен.

Примеры

Следующие примеры иллюстрируют различные аспекты, относящиеся к изобретению. Пример 1 относится к выделению лимонин-17-β-D-глюкопиранозида из апельсиновых косточек. В примере 2 суммированы результаты исследований при различных температурах и значениях рН для определения скорости, с которой лимонин будет образовываться в растворах. Идентификация лимонина и изолимонина методами ЖХВД и ЖХ-МС и ЯМР представлены в примере 3.

Пример 4 относится к количественной оценке содержания лимонина и изолимонина в апельсиновом соке. Пример 5 относится к органолептическому анализу.

Для данных примеров следующие соединения были получены коммерчески: лимонин (Sigma, Steinheim, Германия); муравьиная кислота, метанол и ацетонитрил (Merck, Darmstadt, Германия); дейтерированные растворители (Aldrich, Taufkirchen, Германия); деионизированную воду, использованную для хроматографии, очищали с помощью градиентной системы А10 Milli-Q (Millipore, Βillerica, США). Апельсиновые косточки и апельсиновый сок, полученные из апельсинов (сорт Валенсия, поздний), собранных во Флориде (США) в марте 2006 года, а также замороженный концентрированный апельсиновый сок, приготовленный из той же порции фруктов, получали от промышленных производителей апельсинового сока (США). Свежие апельсины (сорт Валенсия, поздний) получали от местного продавца.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Прибор ВЭЖХ состоял из двух насосов (Sykam, S 1122), градиентного смесителя (Sunchrom, динамический/статистический градиентный смеситель), инжектора Rheodyne (петля 250 мкл), автоматического пробоотборника (Spark, Midas 380), диодного матричного детектора (Sunchrom, SpectraFlow 600, DAD), при регулировании эффлюента в диапазоне длин волн между 200 и 600 нм, модуля расщепления (Upchurch, P-470, градуированный микросплиттер) и испаряющего светорассеивающего детектора (ELSD) (S.E.D.E.R.E., Sedex 85 LT-ELSD, p=2,6 бар, Т=40°С), оборудованного небулайзером (S.E.D.E.R.E., ВЭЖХ небулайзер 200 мкл/мин-2,5 мл/мин).

Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия (ЖХ/МС)

ЖХ-МС/МС анализ проводили с использованием ВЭЖХ системы Agilent 1100, соединенной с ЖХ-МС/МС API 4000 (Applied Βiosystems, Darmstadt, Германия), функционирующей или в режиме отрицательной (ESI^-), или положительной (ESI⁺) ионизации электрораспылением. Напряжение распыления устанавливали при -4500 В, азот служил газом воздушной завесы (20 фт/кв. дюйм), и разгруппировывающий потенциал устанавливали при -65 В. С помощью режима множественного реакционного мониторинга (MRM) соединения 2 и 3 анализировали с использованием описанного выше перехода масс.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

Спектроскопические эксперименты ¹Н, COSY, HMQC и HMΒC проводили на ЯМР приборе DPX 400 МГц фирмы Βruker (Rheinstetten, Германия). Образцы растворяли в ДМСО-d₆ или MeOD-d₄ с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта и помещали в ЯМР-ные ампулы (Schott Professional, 178×5 мм) перед измерением. Обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Mestre-C для ЯМР.

Пример 1 - Выделение лимонин-17-β-D-глюкопиранозида из апельсиновых косточек

Апельсиновые косточки (100 г) тщательно промывали водой, затем ацетоном и замораживали в жидком азоте, измельчали в мельнице мелкого помола и затем дважды экстрагировали метанолом (300 мл) в течение 4 часов при 60°С. После фильтрования из экстракта удаляли растворитель в вакууме, получая экстрагированные в метанол вещества в виде аморфного порошка (28 г).

Аликвоту (2 г) данного неочищенного изолята помещали в воду (10 мл), находящуюся наверху охлаждаемой водой стеклянной колонки (300×35 мм), заполненной суспензией вещества Амберлит XAD-2 (ΒDH Chemicals Ltd, Poole, Англия), уравновешенной водой. Проводили хроматографию при скорости потока 5 мл/мин, начиная с воды (200 мл, фракция I), затем с использованием смесей метанол/вода, содержащих 20% (200 мл, фракция II), 40% (200 мл, фракция III), 60% (200 мл, фракция IV), 80% (200 мл, фракция V) и метанол (200 мл, фракция VI). Индивидуальные фракции собирали по отдельности, растворитель удаляли в вакууме при 30°С и затем подвергали лиофильной сушке для получения фракций I-VI в виде аморфных порошков.

Фракции II-IV объединяли, растворяли в смеси (20/80, об./об.) метанола и 0,1% водной муравьиной кислоты и, после мембранной фильтрации, аликвоты (250 мкл) фракционировали с помощью полупрепаративной ВЭЖХ на колонке Microsorb-MV, RP-18, 250×10 мм, внутренний диаметр 5 мкм (Varian, Германия). При контроле эффлюента с помощью УФ-детектора при 220 нм, а также ELSD, хроматографию проводили при скорости потока 3,5 мл/мин, начиная со смеси (10/90, об./об.) ацетонитрила и 0,1% водной муравьиной кислоты, повышая содержание ацетонитрила до 20% в течение 15 минут, выдерживая эту концентрацию в течение 5 минут и, наконец, поднимая содержание ацетонитрила до 100% в течение 5 минут. Эффлюент, имеющий пик, обнаруженный при 17 минутах, собирали в охлажденную льдом колбу, органический растворитель удаляли в вакууме, и водный слой наносили на верхнюю часть картриджа Strata C18-E SPE (10 г, 55 мкм, Giga-Tubes, Phenomenex), уравновешенного водой. Картридж наполняли до краев водой (150 мл), затем сушили путем просасывания через него тока азота и, наконец, элюировали метанолом (100 мл). В картридже SPE удаляются следы муравьиной кислоты для предотвращения протон-катализируемого высвобождения агликона. Органический эффлюент избавляли от растворителя в вакууме, остаток суспендировали в воде (5 мл) и подвергали лиофильной сушке, получая лимонин-17-β-D-глюкопиранозид в виде белого аморфного порошка с чистотой более 99%.

Лимонин-17-β-D-глюкопиранозид, 1 на фиг.1 УФ/виз (ацетонитрил/вода; рН 2,5): λ_макс.=220 нм; ЖХ/МС (ESI⁺): m/z 649 ([M-H]^-); ЖХ/МС (ESI^-): m/z 668 ([M+NH₄]⁺), 673 ([M+Na]⁺), 689 ([M+K]⁺); ¹H-ЯМР (400 МГц, MeOD-d₄, COSY): δ 0,66 [c, 3H, H-C(24)], 0,98 [c, 3H, H-C(25b)], 1,21 [c, 3H, H-C(25a)], 1,40 [c, 3H, H-C(18)], 1,66 [м, 1H, H-C(12)], 1,78 [м, 2H, H-C(11)], 1,99 [м, 1H, H-C(12)], 2,43 [дд, 1H, J=7,4, 22,1 Гц, H-C(6)], 2,55 [дд, 1H, J=5,6, 19,0 Гц, H-C(6)], 2,68 [д, 1H, J=4,3 Гц, H-C(9)], 2,71 [д, 2H, J=4,1 Гц, H-C(2)], 2,79 [дд, 1H, J=5,6, 14,7 Гц, H-C(5)], 2,94 [c, 1H, H-C(15)], 3,11 [м, 2H, H-C(2'), H-C(5')], 3,20 [м, 1H, H-C(4')], 3,27 [м, 1H, H-C(3')], 3,48 [м, 1H, H-C(6')], 4,20 [c, 1H, H-C(1)], 4,29 [д, 1H, J=7,6 Гц, H-C(1')], 4,40 [д, 2H, J=8,1 Гц, H-C(19)], 5,42 [c, 1H, H-C(17)], 6,53 [д, 1H, J=1,3 Гц, H-C(21)], 7,24 [c, 1H, H-C(23)], 7,63 [c, 1H, H-C(22)]; ¹³C-ЯМР (100 МГц, MeOD-d₄, HMQC, HMBC): δ 17,1 [C, C(11)], 18,4 [C, C(24)], 20,8 [C, C(25b)], 24,7 [C, C(18)], 26,8 [C, C(12)], 29,2 [C, C(25a)], 35,2 [C, C(2)], 36,4 [C, C(6)], 44,8 [C, C(13)], 45,1 [C, C(9)], 45,2 [C, C(10)], 50,7 [C, C(8)], 54,8 [C, C(5)], 59,8 [C, C(15)], 61,7 [C, C(6')], 63,8 [C, C(19)], 69,1 [C, C(14)], 70,4 [C, C(4')], 75,4 [C, C(2')], 76,0 [C, C(5')], 76,9 [C, C(3')], 78,1 [C, C(17)], 78,4 [C, C(1)], 80,8 [C, C(4)], 104,3 [C, C(1')], 112,3 [C, C(21)], 125,4 [C, C(20)], 140,3 [C, C(22)], 142,3 [C, C(23)], 173,0 [C, C(3), C(16)], 209,6 [C, C(7)].

Пример 2 - Образование лимонина из лимонин-17-β-D-глюкопиранозида

Для исследования предполагаемого неферментативного высвобождения лимонина из лимонин-17-β-D-глюкопиранозида во время хранения апельсинового сока, водный раствор глюкопиранозида, доведенный до значения рН, соответствующего свежевыжатому апельсиновому соку (рН 3,5), или до значений рН, найденных для концентратов апельсиновых соков (рН 2,0 и 3,0), выдерживали при 20°С в течение вплоть до 14 недель в темноте. С регулярными временными интервалами из модельных растворов отбирали аликвоты и анализировали в них количество лимонина, высвободившегося из глюкопиранозида, с помощью ВЭЖХ-МС/МС, функционирующего в режиме MRM. Независимо от значения рН модельного раствора лимонин образовывался при увеличении времени хранения, как показано на фиг.2, но пониженные значения рН способствовали образованию горького соединения. Например, 0,85 мол.% лимонина высвободилось из глюкопиранозида при хранении при рН 2,0, тогда как при рН 3,5 образовалось только 0,25% горького соединения.

Для исследования влияния температуры на образование лимонина водные растворы глюкопиранозида, доведенные до рН 3,0 выдерживали при 4, 20 и 30°С в течение вплоть до 14 недель в темноте. Через регулярные промежутки времени определяли количество лимонина с помощью ВЭЖХ-МС/МС, функционирующего в режиме MRM. Результаты, представленные на фиг.3, четко показывают, что высвобождение лимонина из лимонин-17-β-D-глюкопиранозида ускорялось при 30°С по сравнению с модельными растворами, выдерживаемыми при 4 и 20°С, соответственно. Например, лимонин высвобождался из своего предшественника с выходом около 4,0% при выдерживании при 30°С, тогда как только 0,2% горького соединения было обнаружено после хранения раствора его предшественника при 4°С в течение 14 недель.

В частности, водные растворы лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (0,35 мг/л), доведенные до значения рН 2,0, 3,0 и 3,5, соответственно, путем добавления следовых количеств соляной кислоты (1 моль/л) выдерживали при разной температуре (4, 20, 30°С) в течение вплоть до 14 недель в закрытых ампулах в темноте. Через регулярные промежутки времени с помощью шприца отбирали образцы (5 мкл) и анализировали образование лимонина с помощью ЖХ-МС/МС на колонке Synergi Fusion, 150×2 мм, внутренний диаметр 4 мкм (Phenomenex). Для достижения этого хроматографию проводили при скорости потока 250 мкл/мин, начиная со смеси (80/20, об./об.) 0,1% водной муравьиной кислоты и ацетонитрила, повышая содержание ацетонитрила до 40% в течение 10 минут, затем до 80% в течение 5 минут, выдерживали при этой концентрации в течение 5 минут и, наконец, до 100% в течение 5 минут. С использованием отрицательного режима ионизации электрораспылением лимонин анализировали в режиме множественного реакционного мониторинга (MRM) с использованием перехода массы m/z 469→229. Количественный анализ проводили путем сопоставления площади пиков, полученных для следовых масс с пиками определенных стандартных растворов лимонина в метаноле.

Фиг.4 иллюстрирует, что на хроматограмме ЖХ-МС/МС не проявляются как раз лимонин-17-β-D-глюкопиранозид (1) и лимонин (3), но, неожиданно, на ней имеется третий пик (4), элюированный при 16,59 минуты и демонстрирующий тот же переход массы m/z 469→229, который был выявлен для лимонина, таким образом подразумевая существование стереоизомера лимонина. Поскольку химическая структура данного соединения к этому моменту еще не была с очевидностью подтверждена с помощью ЯМР-спектроскопических экспериментов, дополнительные эксперименты были направлены на получение соединения 4 в подходящих количествах для проведения спектроскопических экспериментов.

Пример 3 - Идентификация лимонина и изолимонина (соединение 4)

Высвобождение из лимонин-17-β-D-глюкопиранозида

Для определения химической структуры соединения 4, выявленного в примере 2 и проиллюстрировано на фиг.4, водный раствор лимонин-17-β-D-глюкопиранозида, доведенный до рН 1,5, выдерживали в течение 4 часов при 60°С, соединение 4 выделяли и очищали с помощью полупрепаративной ВЭЖХ, и его химическая структура была определена с помощью ЖХ-МС/МС и 1D/2D-ЯМР (одномерный/двумерный ЯМР) экспериментов. В спектре ¹Н-ЯМР, показанном на фиг.5, наблюдался 21 сигнал, среди которых 10 сигналов, показавших химические сдвиги при δ 1,44, 1,72, 2,00, 2,25, 2,66, 2,66, 2,73, 2,75, 2,91 и 4,14 м.д., достаточно хорошо соотносились с резонансами алкильных протонов H-C(12a), H-C(11), H-C(12b), H-C(6a), H-C(2a), H-C(5), H-C(2b), H-C(9), H-C(6b) и H-C(1) лимонина. Отнесение данных сигналов было определенно подтверждено с помощью гомо- (COSY) и гетероядерных корреляционных экспериментов (HMQC, HMΒC). Диастереотопные протоны, имеющие резонансные сигналы при 4,51 и 4,78 м.д., хорошо соответствовали метиленовым протонам Н-С(19), указывая таким образом на сохранившееся А-кольцо, какое имеется в лимонине. Также резонансные сигналы, наблюдавшиеся при 6,62, 7,60 и 7,70 м.д. для фурановых протонов Н-С(21), Н-С(22) и Н-С(23), демонстрировали структурное подобие с лимонином. Однако соединение 4 показало бросающееся в глаза различие с лимонином в химических сдвигах протонов Н-С(15), Н-С(17) и Н-С(18). Протон Н-С(17) показал сильнопольный сдвиг от 5,48 м.д. (3) до 5,05 м.д. (4), тогда как для протонов Н-С(15) и Н-С(18) наблюдался слабопольный сдвиг от 4,21 и 1,11 м.д. (3) до 4,50 и 1,48 м.д. (4), соответственно. Кроме того, 2D-ЯМР эксперименты выявили различие в химических сдвигах С(17)/С(18), резонирующих при 77,9/20,0 м.д. для лимонина (3) и 85,1/27,1 м.д. для соединения (4), указывая таким образом на эпимеризацию лимонина в положении С(17) в структуре соединения 4. Принимая во внимание все спектроскопические данные, соединение 4 было впервые однозначно идентифицировано как С₁₇-эпимер лимонина, имеющий фурановое кольцо при С(17) в β-ориентации в отличие от α-ориентации в лимонине. Хотя соединение 4, называемое С₁₇-эпилимонином или изолимонином, ранее предполагалось в качестве метаболита лимонин-17-β-D-глюкопиранозида в плазме крови человека, это является первым подтверждением структуры данного эпимера лимонина на основании спектроскопических данных и демонстрацией его гидролитического высвобождения из глюкопиранозида.

В частности, раствор лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (35 мг) в воде (20 мл) доводили до рН 1,5 с использованием следовых количеств соляной кислоты (1 моль/л) и выдерживали в течение 4 часов при 60°С. После охлаждения раствор наносили на верхнюю часть уравновешенного водой картриджа Strata C18-E SPE (10 г, 55 мкм, Giga Tubes, Phenomex), затем быстро промывали водой (150 мл), затем смесью вода/метанол (50/50, об./об.; 100 мл) и метанолом (150 мл). Из метанольной фракции растворитель удаляли в вакууме, растворяли в смеси метанола и 1% водной муравьиной кислоты и аликвоты (100 мкл) разделяли с помощью полупрепаративной ВЭЖХ на колонке Microsorb-MV, RP-18, 250×10 мм, внутренний диаметр 5 мкм (Varian, Германия). При мониторинге эффлюентов с помощью УФ-детектора при 220 нм, а также ELSD, хроматографию проводили при градиенте растворителя, подающегося со скоростью потока 3,5 мл/мин, начиная со смеси (30/70, об./об.) ацетонитрила и 1% водной муравьиной кислоты, повышая содержание ацетонитрила до 40% в течение 15 минут, затем до 80% в течение 10 минут и, наконец, до 100% в течение 10 минут. Обнаружены два пика; эффлюенты, содержащие каждый из пиков, по отдельности собирали в охлаждаемые на льду колбы, растворитель удаляли в вакууме и затем подвергали лиофильной сушке. Выделенные соединения были идентифицированы с помощью ЖХ-МС и ЯМР экспериментов как лимонин и его ранее неизвестный стереоизомер С₁₇-эпилимонин, также известный как изолимонин.

Лимонин, 3: УФ/виз (ацетонитрил/вода; рН 2,5): λ_макс.=220 нм; ЖХ/МС (ESI⁺): m/z 509 ([M+K]⁺), 493 ([M+Na]⁺), 488 ([M+NH₄]⁺); ЖХ/МС (ESI^-): m/z 469 ([M-H]^-); ¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆, COSY): δ 1,00 [c, 3H, H-C(24)], 1,02 [c, 3H, H-C(25b)], 1,11 [c, 3H, H-C(18)], 1,19 [c, 3H, H-C(25a)], 1,23 [м, 1H, H-C(12)], 1,73 [м, 2H, H-C(11)], 1,83 [м, 1H, H-C(12)], 2,27 [дд, 1H, J=3,0, 14,7 Гц, H-C(6)], 2,46 [дд, 1H, J=3,0, 15,7 Гц, H-C(5)], 2,55 [м, 1H, H-C(9)], 2,62 [м, 1H, H-C(2)], 2,77 [д, 1H, J=16,4 Гц, H-C(2)], 3,10 [т, 1H, J=15,5 Гц, H-C(6)], 4,11 [м, 1H, H-C(1)], 4,12 [c, 1H, H-C(15)], 4,48 [д, 1H, J=12,9 Гц, H-C(19)], 4,92 [д, 1H, J=12,9 Гц, H-C(19)], 5,48 [c, 1H, H-C(17)], 6,51 [c, 1H, H-C(22)], 7,66 [c, 1H, H-C(21)], 7,72 [c, 1H, H-C(23)]; ¹³C-ЯМР (100 МГц, MeOD-d₄, HMQC, HMBC): δ 17,4 [C, C(24)], 18,1 [C, C(11)], 20,0 [C, C(18)], 20,4 [C, C(12)], 22,3 [C, C(25b)], 30,1 [C, C(25a)], 35,9 [C, C(2)], 36,5 [C, C(6)], 37,5 [C, C(13)], 45,7 [C, C(10)], 46,9 [C, C(9)], 50,5 [C, C(8)], 54,3 [C, C(15)], 58,2 [C, C(5)], 65,3 [C, C(19)], 67,4 [C, C(14)], 77,9 [C, C(17)], 78,9 [C, C(1)], 80,4 [C, C(4)], 110,9 [C, C(22)], 120,6 [C, C(20)], 141,9 [C, C(23)], 143,9 [C, C(21)], 168,7 [C, C(16)], 170,9 [C, C(3)], 208,5 [C, C(7)].

С₁₇-эпилимонин, 4: УФ/виз (ацетонитрил/вода; рН 2,5): λ_макс.=220 нм; ЖХ/МС (ESI⁺): m/z 509 ([M+K]⁺), 493 ([M+Na]⁺), 488 ([M+NH₄]⁺); ЖХ/МС (ESI^-): m/z 469 ([M-H]^-); ¹H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆, COSY): δ 0,99 [c, 3H, H-C(24)], 0,99 [c, 3H, H-C(25b)], 1,19 [c, 3H, H-C(25a)], 1,44 [м, 1H, H-C(12)], 1,72 [м, 2H, H-C(11)], 2,00 [м, 1H, H-C(12)], 2,25 [дд, 1H, J=3,7, 16,2 Гц, H-C(6)], 2,66 [м, 1H, H-C(2)], 2,66 [м, 1H, H-C(5)], 2,73 [м, 1H, H-C(2)], 2,75 [м, 1H, H-C(9)], 2,91 [т, 1H, J=15,8 Гц, H-C(6)], 4,14 [д, 1H, J=3,68 Гц, H-C(1)], 4,50 [c, 1H, H-C(15)], 4,51 [д, 1H, J=13,2 Гц, H-C(19)], 4,78 [д, 1H, J=13,2 Гц, H-C(19)], 5,05 [c, 1H, H-C(17)], 6,62 [c, 1H, H-C(22)], 7,60 [c, 1H, H-C(21)], 7,70 [c, 1H, H-C(23)]; ¹³C-ЯМР (100 МГц, MeOD-d₄ HMQC, HMBC): δ 18,3 [C, C(11)], 19,3 [C, C(24)], 22,1 [C, C(12)], 22,1 [C, C(25b)], 27,1 [C, C(18)], 30,6 [C, C(25a)], 36,6 [C, C(2)], 36,9 [C, C(6)], 40,3 [C, C(13)], 45,0 [C, C(9)], 45,1 [C, C(10)], 47,6 [C, C(8)], 56,3 [C, C(5)], 56,6 [C, C(15)], 65,4 [C, C(19)], 70,4 [C, C(14)], 79,1 [C, C(1)], 79,9 [C, C(4)], 85,1 [C, C(17)], 112,9 [C, C(22)], 122,4 [C, C(20)], 143,8 [C, C(21)], 144,2 [C, C(23)], 168,8 [C, C(16)], 170,5 [C, C(3)], 208,3 [C, C(7)].

Хотя авторы настоящего изобретения не хотели бы связываться с какой-либо теорией, на фиг.6 проиллюстрирован реакционный путь, показывающий образование лимонина (3) и изолимонина или С₁₇-эпилимоинана (4) из лимонин-17-β-D-глюкопиранозида. Поскольку глюкоза представляет собой хорошую уходящую группу, гексоза отщепляется от α-положения фурфурилиденовой группы 1 в кислотных условиях, таким образом приводя к высвобождению делокализованного фурфурилиденового катиона в качестве основного недолговечного промежуточного соединения. Внутримолекулярная циклизация, индуцированная нуклеофильной атакой карбоксильной функции, затем приводит к образованию лимонина (3), содержащего фурановое кольцо в α-ориентации, а также изолимонин/С₁₇-эпилимонина, для которого фурановое кольцо при С(17) имеет β-ориентацию.

Также было показано, что выдерживание лимонина в водном растворе, имеющем рН 3, не приводит к образованию заметного количества изолимонина, так что изолимонин не образуется за счет непосредственной эпимеризации лимонина.

Пример 4 - Количественная оценка содержания лимонина и изолимонина в апельсиновом соке

Для исследования образования лимонина и изолимонина/С₁₇-эпилимонина во время хранения апельсинового сока свежевыжатый апельсиновый сок (рН 3,5) хранили в течение вплоть до четырех недель при 4 и 20°С и затем количественное содержание лимонина и изолимонина/С₁₇-эпилимонина определяли с помощью ВЭЖХ-МС/MC в режиме MRM. Как показано на фиг.7А, концентрация лимонина в апельсиновом соке незначительно повышалась от 70,0 мкг/100 г в свежевыжатом соке до 80 и 85 мкг/100 г при выдерживании в течение 2 недель при 4 и 20°С, соответственно. Хранение апельсинового сока вызывало также повышение концентрации С₁₇-эпилимонина, например, в образцах, выдержанных в течение четырех недель при 4 и 20°С соответственно, наблюдалось 1,5- или 2-кратное увеличение количества С₁₇-эпилимонина (фиг.7В). Сравнение вызванного хранением повышения количества лимонина с количеством изолимонина четко показывает, что при хранении апельсинового сока образование лимонина было более предпочтительным, чем образование его С₁₇-эпимера, что таким образом подтверждает литературные данные о том, что во время хранения лимоноат А-кольцевой лактон, присутствующий в соке, медленно превращается в лимонин при кислотном катализе.

Во второй группе экспериментов исследовали влияние температурной обработки на образование лимонина и изолимонина/С₁₇-эпилимонина. Для этого свежевыжатый апельсиновый сок термически обрабатывали при 70°С в течение 10 минут и, для понимания максимальной степени высвобождения данных соединений, при 95°С в течение вплоть до 240 минут. ВЭЖХ-МС/MC (MRM) анализ показал, что концентрация лимонина и изолимонина в свежеприготовленном, не подвергавшемся нагреванию соке составляла 70,0 и 1,3 мкг/100 г, соответственно (фиг.8А). При термической обработке концентрации обоих терпеноидов значительно увеличивались, например, нагревание в течение 10 минут при 70°С вызывало повышение количества изолимонина с коэффициентом пять, достигая концентрации 6,1 мкг/100 г, тогда как концентрация лимонина достигала концентрации в 100 мкг/100 г.

Нагревание апельсинового сока при 95°С еще сильнее влияло на количества лимонина и изолимонина. Уже после нагревания сока в течение 10 минут при 95°С количество С₁₇-эпилимонина повышалось с коэффициентом десять (фиг.8А). После нагревания в течение 30 и 60 минут соответственно образовывалось 20 и 30 мкг/100 г С₁₇-эпилимонина. После нагревания в течение 60 минут концентрация лимонина увеличивалась от 70 до 115 мкг/100 г и достигала максимального значения в 140 мкг/100 г после 4 часов. Расчет соотношения между обоими лимоноидами в нагревавшихся образцах апельсинового сока показало, что соотношение С₁₇-эпилимонин/лимонин резко изменяется при увеличении времени нагревания и достигает максимума, составляющего 0,50, после 240 минут (фиг.8В).

Для проведения подобных определений апельсины нарезали на половинки и осторожно вручную выжимали сок с помощью кухонной соковыжималки для цитрусовых (Citromatic MPZ 22, Βraun, Германия). С целью исследования влияния хранения при охлаждении на концентрации лимонина и изолимонина в апельсиновом соке аликвоты (300 мл) свежевыжатого апельсинового сока выдерживали при 4 и 20°С в течение 4 недель в темноте. Для исследования образования лимонина и изолимонина при повышенной температуре аликвоты (300 мл) свежевыжатого апельсинового сока обрабатывали термически при 70°С в течение 10 минут или при 95°С в течение вплоть до 240 минут.

Для количественного анализа аликвоты (8 г) свежего и обработанного апельсинового сока, соответственно, центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, нерастворимое вещество суспендировали и тщательно смешивали с водой (8 мл) и опять центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочные жидкости объединяли и помещали на верхнюю часть уравновешенного водой картриджа С 18-Е SPE (1 г, 5 мкм, Phenomenex). Картридж наполняли до краев водой (20 мл), затем сушили путем просасывания через него тока азота и, наконец, элюировали метанолом (20 мл). Из метанольного эффлюента растворитель удаляли в вакууме и помещали остаток в 3,0 мл метанола. Аликвоты (5 мкл) анализировали на содержание лимонина и изолимонина/С₁₇-эпилимонина с помощью ВЭЖХ-МС/MC на колонке Synergi Fusion, 150×2 мм, внутренний диаметр 4 мкм (Phenomenex). Для этого хроматографию проводили при скорости потока 250 мкл/мин, начиная со смеси (80/20, об./об.) 0,1% водной муравьиной кислоты и ацетонитрила, повышая содержание ацетонитрила до 40% в течение 10 минут, затем до 80% в течение 5 минут, выдерживали при этой концентрации в течение 5 минут и, наконец, до 100% в течение 5 минут. С использованием отрицательного режима ионизации электрораспылением лимонин и изолимонин/С₁₇-эпилимонин анализировали в режиме множественного реакционного мониторинга (MRM) с использованием перехода массы m/z 469→229. Количественный анализ проводили путем сопоставления площади пиков, полученных для следовых масс с пиками определенных стандартных растворов лимонина и С₁₇-эпилимонина в метаноле.

Цель конечного эксперимента была сфокусирована на влиянии процесса концентрирования апельсинового сока на количество 3 и 4. Для этого концентрацию С₁₇-эпилимонина определяли количественно в свежем апельсиновом соке и в замороженном концентрате апельсинового сока, полученном из той же порции апельсинового сока путем концентрирования в 6,6 раза. В то время как апельсиновый сок содержал изолимонин/С₁₇-эпилимонин в количестве 1,6 мкг/100 г, примерно 21,0 мкг/100 г изолимонина было найдено в соответствующем замороженном концентрате сока. Учитывая, что концентрат был получен при 6,6-кратном концентрировании апельсинового сока, ожидалось, что в концентрированном соке будет содержаться 10,6 мкг/100 г эпимера. Но в замороженном концентрате присутствовало в два раза более высокое количество в 21,0 мкг/100 г, таким образом впервые ясно показывая, что С₁₇-эпилимонин образуется в значительных количествах во время изготовления замороженного концентрированного апельсинового сока.

Пример 5 - Органолептический анализ

Для исследования влияния хиральности С(17) на сенсорную активность данных лимоноидов поровые концентрации горького вкуса были определены для лимонина и С₁₇-эпилимонина. Данные органолептические исследования выявили поровую концентрацию горького вкуса в 10,0 мкг/л (вода) для С₁₇-эпилимонина, которая весьма близка к таковой для лимонина (4,0 мкмоль/л), что таким образом демонстрирует схожую сенсорную активность обоих тритерпеноидных лактоновых соединений.

Для проведения данной оценки одиннадцать экспертов (четыре женщины и семь мужчин, возраст 23-39 лет), которые участвовали в течение по крайней мере двух лет в еженедельных тренингах, определяли пороговые концентрации распознавания вкуса в бутылированной воде (рН 5,1) с помощью трех-альтернативного метода вынужденного выбора с повышающимися концентрациями стимула в соответствии с методом, описанным ранее Stark, T.; Βarenther, S.; Hofmann, T. (2005) J. Agric. Food Chem. 53:5407-5418.

Примеры указывают, что несмотря на то, что закрытие цикла лимоноат-А-кольцевого лактона (2) только дает возможность образования лимонина (фиг.1), гидролитическое разрушение лимонин-17-β-D-глюкопиранозида (1) через фурфурилиден-катион приводит к лимонину (3) и С₁₇-эпилимонину (4) (фиг.6). Поскольку было установлено, что при хранении на холоде у апельсинового сока образуются только следовые количества изолимонина, тогда как существенно более высокие количества высвобождаются из его предшественника - лимонин-17-β-D-глюкопиранозида, при повышенной температуре, соотношение С₁₇-эпилимонин/лимонин может быть подходящим маркером, дающим возможность аналитического определения термического вклада, примененного во время переработки апельсинового сока.

Как можно видеть из фиг.8, соотношение изолимонин/лимонин увеличивается от 0 до примерно 0,25 в течение примерно 20 минут и до примерно 0,40-0,45 в течение примерно 60 минут при 100°С. Таким образом, соотношение изолимонин/лимонин (также выраженное как соотношение С₁₇-эпилимонин/лимонин) имеет тенденцию указывать на степень нагревания.

Хотя изобретение было описано относительно конкретных примеров, включая ныне предпочтительные способы изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что имеются многочисленные вариации и изменения вышеуказанных систем и методов, которые отвечают сути и объему данного изобретения, как оно представлено в прилагаемой формуле изобретения.

1. Способ регулирования вкуса фруктового сока для снижения горького вкуса фруктового сока, включающий:
регулирование в соке концентрации соединения, выбранного из группы, состоящей из лимонина, изолимонина, номилина и их смесей до концентрации ниже порогового уровня горького вкуса указанного соединения.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий регулирование в соке соотношения Брикс/кислота для снижения концентрации указанного соединения.

3. Способ по п.1, дополнительно включающий регулирование в соке концентрации полиметоксилированных флавонов до уровня ниже порогового уровня их горького вкуса.

4. Способ по п.3, дополнительно включающий регулирование в соке соотношения Брикс/кислота для снижения концентрации полиметоксилированных флавонов до уровня ниже порогового уровня их горького вкуса.

5. Способ по п.1, дополнительно включающий регулирование в соке концентрации лимоноидных β-D-глюкопиранозидов до уровня ниже порогового уровня их горького вкуса.

6. Способ по п.3, дополнительно включающий регулирование в нем концентрации лимоноидных β-D-глюкопиранозидов до уровня ниже порогового уровня их горького вкуса.

7. Способ по п.1, в котором сок содержит смесь изолимонина и лимонина, причем соотношение изолимонин/лимонин составляет менее чем около 0,25.

8. Способ по п.2, в котором сок содержит смесь изолимонина и лимонина, причем соотношение изолимонин/лимонин составляет менее чем около 0,25.

9. Способ по п.1, в котором концентрацию регулируют методом, выбранным из группы, состоящей из обратного осмоса, ионного обмена, перегонки или их комбинаций.

10. Способ по п.2, в котором соотношение Брикс/кислота регулируют путем снижения концентрации кислоты, выбранной из группы, состоящей из яблочной кислоты, лимонной кислоты и их смесей.

11. Способ по п.4, в котором соотношение Брикс/кислота регулируют путем снижения концентрации кислоты, выбранной из группы, состоящей из яблочной кислоты, лимонной кислоты и их смесей.

12. Фруктовый сок, имеющий менее горький вкус, чем необработанный фруктовый сок, при этом указанный сок содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из лимонина, изолимонина, номилина и их смесей, в концентрации ниже порогового уровня горького вкуса указанного соединения.

13. Фруктовый сок по п.12, дополнительно включающий полиметоксилированные флавоны.

14. Фруктовый сок по п.12, дополнительно включающий лимоноидные β-D-глюкопиранозиды.

15. Фруктовый сок по п.12, содержащий смесь изолимонина и лимонина, причем соотношение изолимонин/лимонин составляет менее чем около 0,25.

16. Обработанный фруктовый сок, имеющий менее горький вкус, чем необработанный фруктовый сок, при этом указанный обработанный фруктовый сок содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из лимонина, изолимонина, номилина и их смесей, в концентрации ниже концентрации указанного соединения в необработанном соке и ниже порогового уровня горького вкуса указанного соединения.

17. Обработанный сок по п.16, содержащий смесь изолимонина и лимонина, причем соотношение изолимонин/лимонин составляет менее чем около 0,25.

18. Обработанный сок по п.16, дополнительно содержащий кислоту, выбранную из группы, состоящей из яблочной кислоты, лимонной кислоты и их смесей, в концентрации, которая ниже концентрации кислоты в необработанном соке.

19. Обработанный сок по п.16, в котором концентрация указанного соединения ниже порогового уровня горького вкуса указанного соединения.

20. Обработанный сок по п.18, в котором концентрация указанного соединения ниже порогового уровня горького вкуса указанного соединения.