Способ определения концентраций пероксида водорода и устройство для его осуществления (варианты)

Предложен способ определения концентрации глюкозы в образце жидкости, в котором образец жидкости вводят в контакт с глюкозо-оксидазой, а образующееся при этом количество пероксида водорода определяют амперометрически с помощью электродов, к которым приложены различные перепады напряжения. Способ согласно изобретению включает следующие стадии: приложение напряжения активации для снижения напряжения и определения концентрации пероксида водорода, проведение измерений при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости и которое было снижено за счет предварительного приложения напряжения активации, проведение измерений, по крайней мере, при одном напряжении, которое подходит для определения в образце жидкости концентрации вещества, действующего как мешающее вещество при определении концентрации пероксида водорода, учет влияния мешающего вещества на результат измерений при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости, с помощью результата измерений при напряжении, которое подходит для определения концентрации мешающего вещества. Изобретение обеспечивает возможность амперометрического определения концентрации глюкозы в жидком образце с повышенной точностью за счет снижения или полного исключения влияния мешающих веществ на результаты определения. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Настоящее изобретение относится к способу и устройству для определения концентраций пероксида водорода в жидкостях, в частности к улучшенному определению концентраций пероксида водорода в крови, поте, моче или молоке.

Определение соединений, в особенности в присутствии других веществ, при этом некоторые из них являются соединениями, которые мешают проведению анализа, важно для многих областей применения, в частности для медицинской диагностики. Например, определение глюкозы в крови критически важно при лечении диабета. Лечение обещает быть особенно успешным, если сам пациент через регулярные промежутки времени проверяет содержание сахара в крови. Для этого пациент накалывает палец режущим инструментом и берет каплю крови, которую он помещает в одноразовый биодатчик. Биодатчик размещают в измерительном устройстве, которое проводит измерение и анализ. По прошествии от 10 до 30 с дисплей показывает значение содержания сахара, которое пациент использует для осуществления непрерывного контроля и/или для точного дозирования инсулина. Для этого требуется аккуратное измерение содержания сахара в крови. Случайные ошибочные измерения могут привести к острым осложнениям, таким как кома. Повторные ошибочные измерения приводят к постоянному физиологически неприемлемо высокому уровню сахара в крови, что ведет к слепоте, ампутациям, отказу работы почек и к инфаркту миокарда.

Известен ряд способов для определения уровней сахара в крови. Указанные способы обычно разделяются на две категории: оптические методы и электрохимические методы. В случае оптических методов для определения количества хромофоров, образовавшихся при реакции с глюкозой в крови, применяют отражательную спектроскопию или абсорбционную спектроскопию. Интенсивность изменения цвета пропорциональна содержанию сахара в крови.

В электрохимических способах для определения содержания сахара в крови применяются амперометрические или кулонометрические методы. Возможности применения и, прежде всего, эффективность электрохимических способов ограничена уровнем мешающих веществ в крови (мочевины, аминокислот, аскорбиновой кислоты, лекарств и т.п.), поскольку указанные соединения также могут претерпевать изменения на электродах и тем самым приводят к получению ошибочно высоких значений для уровней глюкозы. То же самое относится и к другим переменным, таким как, например, гематокритное число, которые также могут различаться от одного измерения к другому. Гематокритное число (HCT) представляет собой процент эритроцитов в цельной крови (в % об.). Нормальное значение гематокритного числа находится в диапазоне от 40 до 45% об. В случае болезни или у пострадавших в аварии, которые потеряли большое количество крови, HCT может находиться в диапазоне от приблизительно 22 до 65% об. Насколько это влияет на измерение содержания сахара в крови описывается, например, в патентах США №№5234516; 5288636; 5353351 и 5385846.

Вследствие неопределенности химического и физиологического состава крови или другой содержащейся в организме жидкости, результаты измерений при электрохимическом определении глюкозы с использованием обычного способа показывают отклонения от действительного значения для глюкозы, которые могут составлять вплоть до 20%.

Одноразовые электрохимические датчики обычно состоят из подложки, на которой расположены контакты, линии разводки и электроды, изготовленные из проводящего вещества. Зоны реакции и контакты к измерительному устройству формируют путем нанесения непроводящего слоя. Зона реакции образуется электродами. В общем случае имеется два электрода, один из которых служит в качестве измерительного электрода. Другим электродом является электрод сравнения и противоэлектрод. Действительная реакция определения протекает на измерительном электроде. Для этого слой фермента или ферментную мембрану наносят либо на указанный электрод, либо перед ним. Фермент применяют с тем, чтобы он специфично взаимодействовал с глюкозой в крови. В этом случае измерительный электрод измеряет концентрацию одного или нескольких продуктов, образующихся при ферментной реакции. Концентрация продуктов реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата, пока активность фермента выше, чем концентрация субстрата. В этом случае измерительный электрод непосредственно определяет концентрацию глюкозы в крови.

В литературе описан ряд чувствительных ферментных устройств для определения глюкозы в крови или в других жидкостях. Практически все чувствительные элементы для глюкозы функционируют в соответствии со следующей схемой реакции:

Определение глюкозы может быть произведено за счет (1) потребления кислорода (О₂ электроды), (2) образования пероксида водорода (Н₂О₂ электроды) или (3) повышения величины рН (рН электроды). Чувствительные электроды для глюкозы на основе изменения величины рН обладают тем недостатком, что возможности ее измерения определяется буферной емкостью образца.

В случае О₂ электрода и Н₂О₂ электрода измеряемое значение прямо пропорционально концентрации глюкозы в более или менее широком диапазоне измерений. Диапазон измерений определяется проницаемостью мембраны для глюкозы и кислорода. Высокая проницаемость мембраны обеспечивает высокую чувствительность, в то время как низкая проницаемость снижает чувствительность, но расширяет диапазон измерений. При высоких концентрациях глюкозы диапазон измерений может быть ограничен недостаточной активностью фермента. Тем не менее, эту ситуацию можно контролировать за счет применения избытка фермента. В связи с этим важно помнить, что при использовании больших количеств фермента, в частности, в случае глюкозо-оксидазы, может возникать автоингибирование.

Без мембраны диапазон измерений ограничивается максимальной величиной, составляющей приблизительно 200 мг/дл, за счет переноса кислорода к ферменту. Однако при лечении диабета обычными являются уровни сахара в крови, которые находятся в диапазоне от 200 до 500 мг/дл. С целью определить указанные значения, не жертвуя при этом чувствительностью из-за использования толстых мембран, были разработаны кислородонезависимые чувствительные элементы для анализа глюкозы. В указанных чувствительных элементах перенос электронов от окислительно-восстановительного центра фермента к поверхности электрода осуществляют молекулы, отличные от кислорода. Указанные соединения известны как медиаторы М. Механизм взаимодействия описывается следующей схемой:

Подобные чувствительные элементы в определенной степени являются кислородонезависимыми и способны функционировать даже в анаэробных условиях.

Однако при электрохимическом определении глюкозы в сложной среде, такой как кровь или моча, возникает проблема, заключающаяся в том, что другие вещества, содержащиеся в среде, могут повлиять на измеряемый электрический ток. В случае прямого определения Н₂О₂ приблизительно при потенциале +0,6 В (по стандартному водородному электроду) одновременно превращения претерпевает большое количество легко окисляемых соединений, что приводит к ошибочно высоким значениям. По указанной причине медиаторы обычно имеют низкие окислительно-восстановительные потенциалы, что снижает влияние мешающих химических веществ на результаты измерений. Примеры подходящих медиаторов включают бензохиноны и нафтохиноны (ЕР 0190740), замещенные флавины, феназины, фенотиазины, индофенолы, замещенные 1,4-бензохиноны и индамины (ЕР 0330517), N-оксиды, нитрозосоединения, гидроксиламины и оксины (ЕР 0354441), растворимые феррицианид/Fe(III) соединения (ЕР 0496730) и соли феназиния/феноксазиния (US 3791988).

Тем не менее, чувствительные элементы с медиаторами для определения глюкозы имеют недостатки. Например, все медиаторы токсичны. Невозможно предотвратить естественное взаимодействие глюкозо-оксидазы с кислородом, содержащимся в среде, поскольку сродство окислительно-восстановительного центра к кислороду приблизительно в 100 раз выше, чем, например, к Fe(III)CN₆. Указанное в большей степени происходит при низких концентрациях глюкозы, и полученные значения оказываются слишком низкими, поскольку Н₂О₂, образующийся при реакции с кислородом, не обнаруживается. Более того, при изготовлении указанных чувствительных элементов необходимо гарантировать, что медиатор остается в окисленном состоянии до момента проведения измерений. Каждое восстановление, даже частичное восстановление, приводит к повышению фонового тока, т.к. молекулы M_red уже присутствуют и, конечно, они также могут претерпевать превращения. Известно (ЕР 0741186), что медиаторы проявляют тенденцию к быстрому восстановлению, особенно, при высоких температурах и большой влажности. Естественно, это уменьшает срок годности при хранении и тем самым возможность использования указанных чувствительных элементов в качестве одноразовых датчиков.

Могут использоваться двухэлектродные и трехэлектродные системы. В обеих системах рабочие электроды и противоэлектроды, как правило, изготавливают из платины, золота, графита и т.п. Электродом сравнения является электрод Ag-AgCl, каломельный электрод или же электрод сравнения может быть изготовлен из того же вещества, что и рабочий электрод.

В международной заявке на изобретение, опубликованной под номером WO 81/03546, раскрывается способ определения концентрации глюкозы, в котором применяют кривую напряжения (нижний предел: от минус 1,0 до минус 0,6 В; верхний предел: от +0,7 до +1,1 В), имеющую время выдержки в некоторых точках (особенно там, где происходит превращение глюкозы) и точках инверсии. В конкретных областях определяют заряд. Точки выдержки и времена выдержки выбраны таким образом, чтобы заряд был пропорционален концентрации глюкозы, независимо от мешающих веществ, в первую очередь, мочевины и аминокислот. Области, в которых проводится интегрирование, отличаются тем, что глюкоза всегда вносит лишь положительный вклад в общий заряд, в то время как мешающие вещества вносят как положительный, так и отрицательный вклад, которые при интегрировании усредняются.

Тем не менее, указанный способ не применим в том случае, когда концентрация мешающих веществ высока, и в то же время концентрация глюкозы мала.

Таким образом, необходим способ определения глюкозы в крови, который работает с Н₂О₂ электродами, не требует медиаторов, относительно нечувствителен к значению гематокритного числа и температуре, при этом определение Н₂О₂ могло бы протекать в диапазоне более низких напряжений, что сделало бы способ менее чувствительным к мешающим химическим веществам. В то же время чувствительные элементы должны обладать способностью к хранению с тем, чтобы их можно было использовать в качестве одноразовых датчиков.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание способа амперометрического определения с повышенной точностью концентраций в жидком образце, в особенности в крови, поте, мочевине или молоке и, в частности, дальнейшее снижение или полное исключение влияния мешающих веществ на результаты определения.

Указанная задача достигается способом, определенным в пункте 1 формулы изобретения, а также посредством устройства, определенного в пунктах 22 и 23 формулы изобретения. Дополнительные улучшенные варианты осуществления настоящего изобретения определяются в дополнительных пунктах формулы изобретения.

Одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ амперометрического определения концентрации пероксида водорода, присутствующего в образце жидкости, в частности в крови, сыворотке, плазме, мочевине, тканевой жидкости, поте или молоке, с помощью электродов, к которым в течение цикла измерения подают различные напряжения Е. Способ включает измерение при напряжении Е_М, подходящем для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости, и измерение, по крайней мере, при одном напряжения Е_К, подходящем для определения концентрации вещества в образце жидкости, которое действует как мешающее вещество при определении пероксида водорода, в частности, для определения концентрации мочевины, аминокислот, аскорбиновой кислоты и некоторых лекарств.

Результат или результаты дополнительного(ых) измерения(ий) при одном или нескольких напряжениях E_Kn, подходящих для определения концентрации мешающих веществ в образце жидкости, может/могут использоваться для оценки влияния указанного вещества или указанных веществ на результат измерения при напряжении, которое подходит для определения пероксида водорода в указанном образце жидкости. В таком случае результат определения глюкозы становится нечувствительным к одному или нескольким мешающим веществам, которые содержатся в образце жидкости с неизвестными концентрациями.

Для определения концентрации пероксида водорода или концентрации мешающего вещества в образце жидкости, преимущественно, прикладывают напряжение, при котором электрический ток, протекающий между электродами, изменяется практически линейно, в крайнем случае экспоненциально, с изменением концентрации пероксида водорода или с изменением концентрации мешающего вещества.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, для учета влияния мешающего вещества, результаты измерений при напряжениях, подходящих для определения мешающих веществ, каждое из которых умножают на заранее установленный весовой коэффициент а , вычитают из результата измерения при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода. Общую величину электрического тока при напряжении, типичном для пероксида водорода, корректируют с помощью измеренных значений электрического тока при различных напряжениях для мешающих веществ, которые умножают на весовой коэффициент и, таким образом, простым способом получают более точные значения.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, измерения при различных напряжениях повторяют, как правило, до тех пор, пока не будет выполнен определенный критерий сходимости. Указанным способом могут быть компенсированы погрешности, вызванные ошибкой измерения или выбросами.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения напряжение активации, которое, как правило, находится в диапазоне между -200 и +700 мВ, предпочтительно, составляет 0 В, прикладывают до подачи первого напряжения измерения. В результате напряжение измерения может быть сдвинуто в катодную область.

Предпочтительно прикладывают максимум 10 различных напряжений и, как правило, прикладывают 4 напряжения, величина которых находится в диапазонах от -1200 до -800 мВ, от -600 до 0 мВ, от -200 до +700 мВ и от +200 до +1400 мВ. Напряжения измерения, которые прикладывают с целью определения концентрации мешающих веществ, в общем случае являются более катодными, чем напряжение измерения Е_М, так что потребляется небольшое количество субстрата.

В типичном варианте применения настоящего изобретения, например при определении концентрации глюкозы в жидкости, конечным продуктом ферментной реакции является пероксид водорода. В ферментной реакции, преимущественно, используют, по крайней мере, одну оксоредуктазу, например глюкозо-оксидазу в случае определения глюкозы. Дополнительные субстраты могут определяться другими подходящими ферментами, такими как, например, лактатоксидаза, холестериноксидаза, алкоголь-дегидрогеназа, ксантиноксидаза, оксидаза аминокислот, оксидаза аскорбиновой кислоты, ацил-СоА-оксидаза, уриказа, глутаматдегидрогеназа, фруктозодегидрогеназа и т.п.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения в качестве электродов применяют золотые электроды.

Дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются измерительные устройства, которые могут применяться для проведения вышеописанного способа. Указанные измерительные устройства могут включать измерительные электроды, интегрированные, например, с измерительной системой на чипах, или же измерительные электроды присоединяют к внешней тест-полоске для измерений, которая электрически соединена с измерительным устройством.

В указанном измерительном устройстве падение электрохимического напряжения в образце жидкости, преимущественно, компенсируется с помощью схемы управления.

Кроме того, в предпочтительном варианте измерительного устройства напряжение на измерительном электроде на протяжении всего измерения поддерживают постоянным с помощью схемы управления.

Вышеописанные и дополнительные объекты, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут более понятны после следующего подробного описания предпочтительных вариантов осуществления изобретения со ссылками на чертежи, где:

на фиг.1 показана типичная кривая напряжения, которое прикладывают к измерительным электродам;

на фиг.2 показана типичная кривая измеренного тока в реакции по отношению к кривой напряжения, приведенной на фиг.1;

на фиг.3 схематически показана структура тест-полоски, которая подходит для проведения измерений;

на фиг.4 показана кривая измеренного тока I_M при различных напряжениях для пероксида водорода, например, Е_М;

на фиг.5 показано влияние величины напряжения активации Е _А на измеренный ток для Е _М=+800 мВ для примера, показанного на фиг.4; и

на фиг.6 показана схема управления для подачи перепадов напряжения по настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением, к электродам датчика прикладывают несколько перепадов напряжения.

В данном способе, по крайней мере, одно напряжение выбирают таким образом, чтобы оно подходило для измерения концентрации пероксида водорода. В частности, указанное напряжение представляет собой напряжение, при котором измеряемый ток зависит линейно или самое большее зависит экспоненциально от изменения концентрации пероксида водорода, другими словами, он изменяется линейно или самое большее экспоненциально с изменением концентрации пероксида водорода.

Кроме того, по крайней мере, одно напряжение выбирают таким образом, чтобы оно подходило для измерения концентрации вещества, которое ведет себя как мешающее вещество в процессе вышеуказанного определения концентрации пероксида водорода, т.е. вещества, которое влияет на электрический ток, протекающий между электродами в процессе определения концентрации пероксида водорода, в частности увеличивает его. Подобное дополнительно прикладываемое напряжение измерения позволяет оценить концентрацию конкретного мешающего вещества и, в частности, представляет собой напряжение, при котором измеряемый ток является линейным по отношению к концентрации мешающего вещества и не является линейным по отношению к концентрации пероксида водорода.

Оценочные значения для мешающего вещества или мешающих веществ затем можно использовать в качестве корректирующего фильтра для полученного предварительного оценочного значения концентрации пероксида водорода и эта процедура заключается в том, что оценивается величина электрического тока, которую мешающее(ие) вещество(а) вносит(ят) в измерения при напряжении для определения пероксида водорода и измеренное значение соответствующим образом корректируется. Например, если измеренное значение представляет собой уровень измеренного электрического тока, который протекает при напряжении для определения пероксида водорода, то оценочное значение количества мешающего вещества, которое определяют в соответствии с вышеуказанным способом для указанного измеренного значения, можно вычесть из указанного измеренного значения.

Далее описывается, каким образом можно оценить вклад мешающих веществ в измеренное значение при напряжении Е _М для определения концентрации пероксида водорода, используя измеренные значения при напряжениях с E _K1 по E _Kn для определения концентраций мешающих веществ и каким образом ранее полученное значение может быть скорректировано для определения (конечного) концентрации пероксида водорода.

В случае измерения сахара в крови затем определяют действительную измеряемую концентрацию при типичном напряжении E _Ki для определения концентрации мешающего вещества, используя вышеуказанный способ для мешающих веществ k1, k2, … kn. Указанное типичное напряжение представляет собой, например, напряжение, при котором измеряемый электрический ток линеен по отношению к концентрации мешающего вещества. В качестве измеренных величин в этом случае получают значения электрического тока I _k1 , I _k2 , … I _kn. Кроме того, определяют предварительное значение концентрации пероксида водорода, используя вышеуказанный способ при типичном напряжении E _M для определения концентрации пероксида водорода, при этом в качестве измеряемой величины получают значение электрического тока I _M.

Затем из указанных измеренных значений рассчитывают величину тока I _M', используя следующую рабочую формулу:

I M' =I M -a 1 ·I k1 -a 2 ·I k2 -…-a n ·I kn

(III)

Константы a ₁ , a ₂ , … , a _n представляют собой весовые коэффициенты, которые должны быть установлены заранее в ходе предварительно проведенных в лаборатории экспериментов. Они необходимы, поскольку значения I _k1 , I _k2 , …, I _kn, как указано ранее, измеряют при напряжениях E _k1 , E _k2 , …, E _kn, где значения E _k отличаются от E _M, как правило, имеют меньшие значения. Кроме того, в случае множества мешающих веществ, отношение уже не является линейным, поскольку вещества оказывают влияние друг на друга. Отношение варьируется в зависимости от концентрации мешающих веществ и количества дополнительных компонентов. В итоге величина a _i включает множество факторов.

Вышеуказанную рабочую формулу программно вводят в измерительное устройство. Однако следует отметить, что дополнительные факторы оказывают некоторое влияние на расчет концентрации и также могут вносить свой вклад в приведенную выше рабочую формулу. Подобные факторы, в частности, включают оценку пропорции измеренного электрического тока, вызываемого мешающими веществами, концентрации которых измеряют отдельно, используя вышеуказанный способ. Более того, помимо химического состава образца жидкости, на измеренные значения электрического тока могут оказывать влияние физические и физиологические факторы, такие как температура образца.

Ниже с помощью примеров описывается определение концентрации глюкозы в жидкости. Указанное определение осуществляют путем взаимодействия образца с глюкозо-оксидазой, при этом образуется пероксид водорода, и путем амперометрического определения количества образовавшегося пероксида водорода.

Для этого, по крайней мере, два, преимущественно, не более десяти и, как правило, четыре напряжения прикладывают к измерительному электроду тест-полоски, приведенной на фиг.3. Тест-полоска для измерения состоит из трех электродов (14): измерительного электрода, противоэлектрода и электрода сравнения. Подложка 10 изготовлена из термопластичной пленки (например, ПВХ от компании Ineos, Германия). Над поверхностью электрода образуется капилляр, который сформирован пленочной прокладкой 11 (например, Duplobond® от компании Lohmann, Германия) и покровной пленкой 12 с гидрофильным покрытием (например, Hostaphan® RN HSTE от компании Mitsubishi Polyester Films, Германия). Глюкозо-оксидазу наносят на поверхность электрода, используя способ трафаретной печати (например, HEMA GX от компании Aurum Technology, Австрия). Примерами диапазонов напряжения для типичного случая являются:

EA:	от -200 до +200 мВ
EM:	от +400 до +800 мВ
Ek1:	от -400 до -600 мВ
Ek2:	от -800 до -1000 мВ

E_A обозначает напряжение активации. Причина в следующем: известно, что на золотом электроде окисление Н₂О₂ протекает при двух различных напряжениях (M.Gerlache et al., Electrochimica Acta, Vol.43, No.23, pages 3467-3473, 1998). Первый пик в этом диапазоне соответствует началу образования оксида (Е_р=+0,49 В), а второй - сдвинутый в несколько более анодную область пик - полностью соответствует оксидной области (Е_р=+0,87 В). Высота первого пика, в частности, очень сильно зависит от состава электрода и состава среды. Образование первого пика ускоряется адсорбцией ионов ОН на поверхности золота. Если ионы ОН не могут быть адсорбированы (например, в случае больших концентраций в среде ионов Cl и/или поверхностно-активных веществ, в случае загрязненной или окисленной поверхности), первый пик либо совсем не образуется, либо слишком мал. Однако указанный первый пик наиболее подходит для определения Н₂О₂, поскольку потенциал полуволны окисления Н₂О₂ и образования оксида отделены друг от друга. Это позволяет осуществить более чувствительный способ измерения, чем с использованием, например, платиновых электродов, на которых всегда измеряют образование оксида вместе с определением Н₂О₂.

Очевидно, что напряжение измерения может быть сдвинуто далеко в катодную область (до +0,1 В) путем приложения напряжения, которое меньше чем напряжение начала образования оксида (напряжение активации Е_А), перед подачей действительного напряжения измерения (Е_М). Причина заключается в том, что при приложении напряжения активации образуется небольшое каталитическое количество оксида. В результате напряжение измерения в этом случае снижается, по крайней мере, с +0,6 В (по стандартному водородному электроду) до величины меньше чем +0,4 В. В итоге влияние мешающих химических веществ на измеряемый электрический ток также снижается, и использование медиаторов больше не является абсолютно необходимым.

В данном примере рабочая формула принимает следующий вид:

I M' =I M -a 1 ·I k1 -a 2 ·I k2

(IV)

Эффективность указанного способа становится очевидной, если сравнить доверительные интервалы (CI) вместе с корректирующим членом и без корректирующего члена. В случае определения содержания глюкозы в жидкости посредством реакции образца с глюкозо-оксидазой за счет образования пероксида водорода и амперометрического определения количества пероксида водорода, который образуется при использовании вышеуказанного способа, получают доверительный интервал 0,96999. Если в уравнение включают корректирующий член с эмпирически найденными весовыми коэффициентами a₁=-0,11 и a₂=047, то доверительный интервал возрастает до 0,99922.

Затем непосредственно из I _M можно рассчитать концентрацию сахара в крови G, поскольку она пропорциональна концентрации пероксида водорода, которая, в свою очередь, пропорциональна I _M' (в данном случае обозначают как I _BZ ). G получают с отрезком d, отсекаемым на координатной оси, и углом наклона k (оба значения определяют при калибровке) следующим образом:

Все напряжения относятся к внутреннему электроду сравнения. Напряжение, которое подходит для измерения концентрации пероксида водорода, находится в диапазоне от +200 и +1400 мВ. В диапазоне измерений от +770 до +1030 мВ доверительный интервал (без корректирующего члена) составляет 95%.

На фиг.1 показано примерное поведение кривой напряжения с четырьмя перепадами напряжения с Р ₁ по Р ₄, которые прикладывают к измерительным электродам. Наибольший анодный потенциал - Р ₂ на фиг.1 - обычно является потенциалом, который подходит для измерения концентрации пероксида водорода. Потенциал Р ₁ соответствует напряжению активации Е _А, назначение которого заключается в снижении напряжения измерения Е _М до величины <+0,6 В (по стандартному водородному электроду). Таким образом, Р ₃ и Р ₄ соответствуют перепадам напряжения, которые подходят для измерения двух различных мешающих параметров.

Четыре временных диапазона с t ¹ _mess по t ⁴ _mess соответствуют периодам времени, в течение которых можно проводить измерения: t ² _mess обозначает временной диапазон, в течение которого можно проводить измерение (или несколько измерений в импульсном режиме), относящееся к определению концентрации пероксида водорода; t ³ _mess и t ⁴ _mess обозначают временные диапазоны, в течение которых можно проводить измерения, относящиеся к определению мешающих веществ. Повторяющееся t ¹ _mess измерение играет лишь роль при первом цикле. В данном случае его используют для проверки работоспособности тест-полоски. При последующих циклах никаких измерений при Р ₁ не проводится.

Каждый период измерения находится в конце временного интервала, в котором прикладывают напряжение.

На фиг.2 показана кривая электрического тока, соответствующая кривой напряжения, приведенной на фиг.1. Из фиг.2 хорошо видно, как ток между измерительными электродами стабилизируется в конце каждого периода времени, в котором прикладывают напряжение. Эти окончания соответствуют четырем измеренным временным диапазонам с t ¹ _mess по t ⁴ _mess.

Как уже указано выше, для определения концентрации глюкозы, преимущественно, многократно, а не просто один раз, прикладывают напряжение измерения и проводят соответствующие измерения. После того как полученное указанным образом значение для сахара в крови G больше не изменяется, конечное значение отображается на дисплее.

Электрическая схема для формирования перепадов напряжения по настоящему изобретению приведена на фиг.6. Напряжение измерительного электрода поддерживают постоянным с помощью операционного усилителя (ОР) 21 (входные или выходные линии 5, 6, 7) посредством контактов 27. С помощью цифроаналогового преобразователя (DAC; не показан) генерируется вплоть до десяти различных перепадов напряжения с различной амплитудой и длительностью и прикладывается к регулятору 22 (входные или выходные линии 8, 9, 10) в качестве заданных значений. Регулятор 22 компенсирует падения электрохимического потенциала в крови в процессе измерения (компенсация внутреннего сопротивления). Таким образом, напряжение между измерительным электродом и электродом сравнения (измерительное устройство подсоединено посредством контакта 25) соответствует заданному значению.

Электрический ток на электродах протекает через измерительный резистор R_Mess (27) и приводит к перепаду на нем напряжения. Регуляторы 23 (входные или выходные линии 1, 2, 3), которые играют роль повторителей напряжения, передают напряжение VSINK измерительного электрода на аналого-цифровой преобразователь (ADC; не показан), а регуляторы 21 (входные или выходные линии 5, 6, 7) передают напряжение после измерительного резистора 24 (U _ADC). Электрический ток, возникающий на электродах при протекании регистрируемой реакции, определяют по следующей формуле:

1. Способ определения концентрации глюкозы в образце жидкости, в котором образец жидкости вводят в контакт с глюкозо-оксидазой, а образующееся при этом количество пероксида водорода определяют амперометрически с помощью электродов, к которым приложены различные перепады напряжения, отличающийся тем, что указанный способ включает следующие стадии, на которых осуществляют:
- приложение напряжения активации для снижения напряжения и определения концентрации пероксида водорода,
- проведение измерений при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости и которое было снижено за счет предварительного приложения напряжения активации,
- проведение измерений, по крайней мере, при одном напряжении, которое подходит для определения в образце жидкости концентрации вещества, действующего как мешающее вещество при определении концентрации пероксида водорода,
- учет влияния мешающего вещества на результат измерений при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости, с помощью результата измерений при напряжении, которое подходит для определения концентрации мешающего вещества.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости, электрический ток, протекающий между электродами, изменяют самое большее экспоненциально с изменением концентрации пероксида водорода.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при напряжении, которое подходит для определения концентрации пероксида водорода в образце жидкости, электрический ток, протекающий между электродами, изменяют, по существу, линейно с изменением концентрации пероксида водорода.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что при напряжении, которое подходит для определения концентрации мешающего вещества в образце жидкости, электрический ток, протекающий между электродами, изменяют самое большее экспоненциально с изменением концентрации мешающего вещества.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что при напряжении, которое подходит для определения концентрации мешающего вещества в образце жидкости, электрический ток, протекающий между электродами, изменяют, по существу, линейно с изменением концентрации мешающего вещества.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения влияния мешающих веществ результат измерений при напряжениях, которые подходят для определения концентрации пероксида водорода, корректируют с помощью результатов измерений при напряжениях, подходящих для определения мешающих веществ, каждое из которых умножают на заранее эмпирически установленный весовой коэффициент.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что результатом измерений является величина электрического тока.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерения при различных напряжениях проводят несколько раз.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что значение напряжения активации находится в диапазоне от -200 до +700 мВ.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что значение напряжения активации составляет 0 В.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что прикладывают максимум 10 различных напряжений.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что прикладывают строго четыре различные напряжения.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что четыре значения напряжений находятся в диапазонах от -1200 до -800 мВ, от -600 до 0 мВ, от -200 до +700 мВ и от +200 до +1400 мВ.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцом жидкости является кровь, пот, моча или молоко.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что мешающими веществами являются мочевина, аминокислоты, аскорбиновая кислота или лекарства.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что пероксид водорода является конечным продуктом ферментной реакции.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что при проведении ферментной реакции используют, по крайней мере, одну оксоредуктазу.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что используемой оксоредуктазой является глюкозо-оксидаза, лактатоксидаза, холестериноксидаза, алкоголь-дегидрогеназа, ксантиноксидаза, оксидаза аминокислот, оксидаза аскорбиновой кислоты, ацил-СоА-оксидаза, уриказа, глутаматдегидрогеназа или фруктозодегидрогеназа.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют электроды, являющиеся золотыми электродами.

20. Измерительное устройство, содержащее два или несколько электродов, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью осуществления способа по любому из пп.1-19.

21. Измерительное устройство, которое выполнено с возможностью соединения с тест-полоской для измерения, имеющей два или несколько электродов, отличающееся тем, что после присоединения к тест-полоске для измерения измерительное устройство обеспечивает осуществление способа по любому из пп.1-19.

22. Измерительное устройство по п.21, отличающееся тем, что падения электрохимического напряжения в образце жидкости компенсируются с помощью схемы управления.

23. Измерительное устройство по п.21, отличающееся тем, что в течение всего измерения напряжение на измерительном электроде поддерживают постоянным с помощью схемы управления.