Способ отбора растений конопли на содержание в них каннабиноидов
Владельцы патента RU 2444180:
Государственное научное учреждение Чувашский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Чувашский НИИСХ Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение предназначено для использования в селекции растений. Отбор растений конопли на содержание каннабиноидов проводят посредством визуального анализа по антоциановой окраске черешков и пластинок верхушечных листьев, сформированных до фазы начала цветения. Растения с максимально интенсивной окраской содержат минимальное количество каннабиноидных соединений. В качестве селекционной элиты отбирают растения с темно-красной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев. Это позволяет упростить процесс отбора, существенно сократить селекционный процесс, а также затраты труда, времени и материальных средств. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.
Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве.
Известен способ отбора растений конопли на содержание в них каннабиноидов, включающий анализ органов растений (Патент №2324334, кл. А01Н, 2008) [1]. Однако данный известный способ позволяет отобрать растения только в период созревания семян. Поскольку конопля перекрестноопыляющееся растение, то при ее селекции на содержание каннабиноидов важно, чтобы селекционируемые растения уже ко времени цветения были идентичны по содержанию этих веществ, то есть необходимо проводить отбор до фазы начала цветения, что сократит в целом селекционный процесс.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является упрощение и сокращение времени отбора, снижение трудозатрат и затрат материальных средств.
Достигается это тем, что в способе отбора растений конопли на содержание в них каннабиноидов, включающем анализ признаков органов растений и отбор по этим признакам, отличающемся тем, что в качестве органа растения, на котором проводят визуальный анализ, используют черешки и пластинки верхушечных листьев, сформированных до фазы начала цветения, определяют признак интенсивности их антоциановой окраски и в качестве растений с минимальным содержанием каннабиноидных соединений отбирают растения с максимально интенсивной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
Рекомендуется в качестве селекционной элиты отбирать растения с темно-красной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
Пример 1. В 1996 году на четырех питомниках исходного материала, пространственно изолированных друг от друга и других посевов, определяли частоту появления в фазе бутонизации растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев в популяциях разных сортов однодомной конопли. Высокий агрофон на данных участках создавали внесением под предпосевную обработку почвы минеральных удобрений из расчета N120 P90 К90 кг/га действующего вещества. Посев семян - ручной, под маркер, площадь питания растений - 5×70 см.
Структурный анализ растений по признаку «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев» выполнили в фазе бутонизации. На все растения с указанным признаком привязывали пергаментные этикетки. Чтобы растения не ломались и не полегали, рядом с каждым растением в почву вставляли деревянные палочки (диаметр 3,0-5,0 см, длина 250-300 см). Перед началом цветения все отобранные растения накрывали пергаментными изоляторами (длина 210-250 см, ширина 20-30 см). Верхний конец изоляторов привязывали шпагатом к деревянным палочкам. Такой изолятор при необходимости легко приподнимался и снимался.
Для анализа содержания каннабиноидных соединений в намеченных исходных растениях образцы отбирали в период созревания 75% семян в соцветиях. Содержание каннабиноидов определяли на хроматографе «Кристалл 2000М» с программированием температуры. Разделение каннабиноидов проводили на капиллярной колонке. Пики идентифицировали по времени удерживания. Содержание рассчитывали по методу внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали метилстеарит.
Результаты исследований приведены в таблицах 1-2. На фиг.1 показан верхушечный лист растения конопли с антоциановой окраской черешков и листовых пластинок.
Впервые в практике отечественного коноплеводства зафиксирован факт, что в популяциях однодомных сортов конопли на ранних этапах вегетации (до цветения) могут появляться растения с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев с частотой 5,38-8,37%.
Выявленный фенотипический маркер вполне может быть использован при решении генетико-селекционных задач по созданию перспективного исходного материала: в отобранных растениях вариабельность содержания наркотически активного тетрагидроканнабинола (ТГК) составляет 0,017-0,020%.
Пример 2. В 1997-2001 годах на селекционных питомниках, пространственно изолированных от других посевов, изучали влияние непрерывного методического отбора в популяциях селекционных элит на частоту появления в ранний период вегетации (фаза бутонизации) растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
Селекционной элитой называли лучшие родоначальные растения.
Высокий агрофон на селекционном питомнике первого цикла отбора (1997 год) создавали внесением под предпосевную обработку почвы минеральных удобрений из расчета N120 P90 K90 кг/га действующего вещества. Для посева использовали семена лучших отобранных в питомнике исходного материала родоначальных растений (1996 год). Посев семян - ручной, под маркер, площадь питания растений - 5×45 см.
В фазе бутонизации ежедневно путем визуального осмотра проводили структурный анализ потомств селекционных элит по признаку «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев». На растения с максимально выраженным признаком привязывали пергаментные этикетки, а растения без антоциановой окраски выбраковывали. Данные визуальной оценки записывали в журнал.
Уборку проводили в фазе созревания 75% семян в соцветиях. Отобранные растения собирали в снопы, обмолачивали, семена доводили до требований посевного стандарта и высевали в будущем году на селекционном питомнике второго цикла отбора.
Так продолжали до тех пор, пока не получали однотипный по селектируемому признаку материал.
Результаты исследований приведены в таблице 3.
Экспериментальные данные позволяют констатировать, что отбор растений до цветения по предложенному фенотипическому маркеру, действительно, дает возможность целенаправленно регулировать процесс перекрестного оплодотворения между теми растениями, которые представляют наибольший селекционный интерес. Самое главное, признак «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев», как любой другой жизненно важный, в процессе непрерывного отбора может приобрести положительное значение: в наших экспериментах, например, в результате непрерывного четырехкратного отбора доля растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев увеличилась в 7 раз.
Пример 3. В 1997-2008 годах, учитывая выявленные закономерности, начали селекционный процесс по созданию безгашишного сорта однодомной конопли южносозревающего типа.
Для анализа содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) образцы отбирали в период созревания 75% семян в соцветиях. Содержание ТГК определяли на хроматографе «Кристалл 2000М» с программированием температуры. Разделение каннабиноидов проводили на капиллярной колонке. Пики идентифицировали по времени удерживания. Содержание рассчитывали по методу внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта использовали метилстеарит.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Табличный материал показывает, что признак «антоциановая окраска черешков и пластинок верхушечных листьев» вполне может служить основой для диагностики и отбора растений без психотомиметически активных каннабиноидных соединений. В селекционном материале, созданном новым способом в результате непрерывного четырехкратного отбора, в сравнении с известным содержание тетрагидроканнабинола оказалось в 3 раза ниже.
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет упростить процесс отбора, сократить затраты труда, времени и материальных средств, в конечном итоге, сократить селекционный процесс и создать южносозреваюшую форму конопли с нокаутированными генами синтеза тетрагидроканнабинола.
| Таблица 1 | |||
| Частота появления в фазе бутонизации растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев в популяциях сортов однодомной конопли (питомники исходного материала, 1996 год) | |||
| Сорт | Всего растений | В том числе с антоциановой окраской | |
| штук | % | ||
| Фибримон 56 (К=452) | 372 | 20 | 5,38 |
| ЮСО-21 (К=503) | 367 | 26 | 7,08 |
| ЮСО-14 (К=499) | 427 | 33 | 7,73 |
| Однодомная бернбургская (К=220) | 490 | 41 | 8,37 |
| Таблица 2 | ||||
| Характеристика исходных растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев по содержанию каннабиноидных соединений (питомник исходного материала, 1996 год) | ||||
| Сорт | Кол-во растений | Содержание каннабиноидов, % | ||
| КБД | ТГК | КБН | ||
| Фибримон 56 (К=452) | 20 | 0,37 | 0,020 | 0,009 |
| ЮСО-21 (К=503) | 26 | 0,34 | 0,019 | 0,008 |
| ЮСО-14 (К=499) | 33 | 0,32 | 0,017 | 0,007 |
| Однодомная бернбургская (К=220) | 41 | 0,31 | 0,017 | 0,007 |
| Примечание: КБД - каннабидиол; | ||||
| ТГК - тетрагидроканнабинол; | ||||
| КБН - каннабинол. |
| Таблица 3 | |||
| Влияние непрерывного методического отбора в популяциях селекционных элит на частоту появления в ранний период вегетации (фаза бутонизации) растений с антоциановой окраской черешков и пластинок верхушечных листьев (селекционный питомник) | |||
| Год | Всего растений | В том числе с антоциановой окраской | |
| штук | % | ||
| 1997 | 1485 | 212 | 14,27 |
| 1998 | 1640 | 470 | 28,65 |
| 1999 | 1724 | 980 | 56,84 |
| 2000 | 1964 | 1630 | 83,00 |
| 2001 | 2018 | 1971 | 97,67 |
| Таблица 4 | |||||||
| Степень изменчивости содержания тетрагидроканнабинола (ТГК) в потомствах растений с антоциановой окраской вегетативных органов в зависимости от способа и кратности их отбора (селекционный питомник) | |||||||
| Год | Всего растений | Содержание ТГК, % | Среднее | ||||
| До 0,0009 | 0,001-0,009 | 0,010-0,019 | 0,020-0,029 | Более 0,030 | |||
| Известный способ (прототип) | |||||||
| 1997 | 160 | - | 1 | 49 | 102 | 8 | 0,021 |
| 1998 | 366 | - | 4 | 123 | 221 | 18 | 0,021 |
| 1999 | 299 | - | 7 | 114 | 165 | 13 | 0,020 |
| 2000 | 537 | 3 | 24 | 215 | 274 | 21 | 0,019 |
| 2001 | 528 | 6 | 42 | 242 | 219 | 19 | 0,017 |
| 2002 | 520 | 23 | 78 | 227 | 179 | 13 | 0,015 |
| 2003 | 699 | 63 | 190 | 226 | 210 | 10 | 0,013 |
| 2004 | 676 | 118 | 203 | 191 | 161 | 3 | 0,011 |
| 2005 | 660 | 144 | 232 | 179 | 105 | - | 0,009 |
| 2006 | 636 | 169 | 244 | 161 | 62 | - | 0,008 |
| 2007 | 632 | 171 | 246 | 158 | 57 | - | 0,007 |
| 2008 | 537 | 145 | 210 | 134 | 48 | - | 0,007 |
| Новый способ | |||||||
| 1997 | 340 | - | 17 | 200 | 120 | 3 | 0,017 |
| 1998 | 634 | 24 | 188 | 332 | 80 | 10 | 0,012 |
| 1999 | 701 | 146 | 252 | 230 | 68 | 5 | 0,008 |
| 2000 | 763 | 163 | 384 | 200 | 16 | - | 0,006 |
| 2001 | 772 | 201 | 410 | 150 | 11 | - | 0,005 |
| 2002 | 780 | 203 | 413 | 156 | 8 | - | 0,005 |
| 2003 | 801 | 208 | 424 | 160 | 9 | - | 0,005 |
| 2004 | 824 | 214 | 437 | 165 | 8 | - | 0,005 |
| 2005 | 840 | 219 | 445 | 168 | 8 | - | 0,005 |
| 2006 | 864 | 225 | 458 | 173 | 8 | - | 0,005 |
| 2007 | 868 | 226 | 460 | 174 | 8 | - | 0,005 |
| 2008 | 963 | 250 | 510 | 193 | 10 | - | 0,005 |
1. Способ отбора растений конопли на содержание в них каннабиноидов, включающий анализ признаков органов растений и отбор по этим признакам, отличающийся тем, что в качестве органов растений, на которых проводят визуальный анализ, используют черешки и пластинки верхушечных листьев, сформированных до фазы начала цветения, определяют признак интенсивности их антоциановой окраски и в качестве растений с минимальным содержанием каннабиноидных соединений отбирают растения с максимально интенсивной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве селекционной элиты отбирают растения с темно-красной окраской черешков и пластинок верхушечных листьев.
