Микроорганизмы молока млекопитающего, их содержащие композиции и их применение для лечения мастита

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Способ селекции пробиотиков включает стадии: (i) выделения штаммов молочнокислых бактерий или бифидобактерий, присутствующих в свежем молоке млекопитающего с помощью селекции в молочнокислой культуральной среде, (ii) селекции тех штаммов стадии (i), которые способны к переносу в молочную железу после перорального приема, и/или колонизируют молочную железу после их местного применения, (iii) селекции тех штаммов стадии (ii), которые способны снижать степень выживаемости и/или степень адгезии Staphylococcus aureus на эпителиальных клетках, и (iv) селекции тех штаммов стадии (iii), которые способны защищать животных от мастита; применение отобранных пробиотических штаммов в качестве лекарственного средства. Композиция включает один или несколько пробиотических штаммов в замороженной, лиофилизованной или сухой форме. Изобретение обеспечивает повышение эффективности предотвращения или лечения мастита у людей и животных, без побочных эффектов, которые возникают при использовании для тех же целей антибиотиков. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр., 8 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к новому способу предотвращения или лечения мастита как у людей, так и у животных посредством применения выделенных из молока млекопитающего микроорганизмов, полученных от здоровых хозяев соответствующего вида; настоящее изобретение относится к тем новым пробиотическим микроорганизмам, полученным из молока, которые способны снижать риск инфекционного мастита, и к способу скрининга, используемому для их получения; настоящее изобретение относится к применению этих пробиотических бактерий для профилактики или лечения мастита и других заболеваний; и, в конечном счете, к композициям, включающим эти соединения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Мастит представляет собой воспаление и инфекцию молочной железы, которое особенно часто встречается у женщин и других самок млекопитающих во время лактации. Мастит в основном бывает вызван стафилококковой и/или стрептококковой селекцией и разрастанием в протоках молочных желез и в ареоле молочных желез. Среди людей маститу подвержено до 30% лактирующих женщин, который часто приводит к раннему и нежелательному отлучению от груди, поскольку представляет собой действительно болезненное состояние.

Кроме того, мастит не является патологией, специфичной только для человека, маститу также подвержены все виды млекопитающих. В этом смысле, инфекционный мастит у видов и пород животных, разводимых для производства молока, таких как коровы, овцы или козы, представляется важной проблемой с экономической точки зрения, так как молоко, полученное во время инфекционного процесса, должно быть выброшено из-за высокого количества бактериальных и соматических клеток. Кроме того, мастит может представлять собой важную проблему у таких видов домашних животных (свиньи, кролики...) и у таких пород животных (например, быки для производства мяса), которые не предназначены для производства молока, так как уменьшенное количество молока низкого бактериологического качества может значительно увеличивать процент заболеваемости и смертности среди потомства.

В этих случаях, терапия на основе антибиотиков выступает как единственный возможный метод лечения. Однако для имеющегося в настоящее время широкого спектра антибиотиков грамположительной направленности характерна низкая эффективность для стафилококковых и стрептококковых штаммов, вызывающих мастит, и поэтому, фактически, в некоторых обстоятельствах такие способы лечения могут быть пагубными, поскольку они обычно элиминируют симбиотическую флору, характерную для молока млекопитающего, которая может оказывать некоторые защитные эффекты. Кроме того, антибиотикотерапия может в результате приводить к появлению остатков антибиотика в молоке, что также является пагубным, если это происходит в период лактации. Альтернативно, для лечения субклинического мастита, вызванного S. aureus, также используется рекомбинантный бычий GM-CSF (Takahashi,H. et al. 2004, Cad.J.Vet.Res. 68:182-187), но его использование не демонстрирует эффективности при лечении поздней стадии инфекции S. aureus.

Альтернативным способом лечения мастита является использование пробиотиков. Например, Sytnik,S.I. et al. (Vrach Delo., 1990, 3:98-100) осуществили попытку использования бифидобактерий для предотвращения мастита, но при этом не наблюдали какого-либо ингибирования времени удержания микрофлоры груди. Greene,W.A. et al. (J.Dairy Sci., 1991, 74:2976- 2981) описали использование коммерческого препарата лактобактерий при повышенном количестве соматических клеток (SSC) для лечения путем введения прямой интрамаммарной инъекции, но сделали заключение, что продукт лактобактерий, используемый в анализе, не является эффективным в качестве интрамаммарного лечения субклинического мастита на основе SCC. В патенте US4591499 описан способ лечения мастита с использованием интрамаммарной инъекции эмульсии типа «масло в воде», содержащей непатогенный штамм лактобактерий или смесь штаммов. Однако по-видимому, штаммы, описанные в этом документе, действуют посредством неспецифического уменьшения pH в молочной железе и нуждаются во введении путем прямой интрамаммарной инъекции. В патенте RU2134583 описано применение местной композиции, содержащей лактобактерин (микробная масса лактобактерий, которая была в живом виде лиофилизована/высушена в культуральной среде) или бифидумбактерин (лиофилизованный биопрепарат, иммобилизованный на специальном активированном угле), для лечения массированного распространения микробов грудного молока. Однако этот препарат подходит исключительно для местного введения и представляет собой часть многостадийного лечения, которое включает расслабляющий массаж и применение суспензии организмов, выделенных из нормальной микрофлоры кишечника, дополнительно содержащей защитную пленкообразующую среду. В международной патентной заявке WO05/34970 описан способ лечения мастита путем интрамаммарной инъекции штамма Lactococcus lactis. Таким образом, все данные об уровне техники, описанные выше, относятся к применению пробиотических штаммов путем или интрамаммарной инъекции, или путем местного применения. Таким образом, в области техники сохраняется необходимость разработки дополнительных способов, обеспечивающих предотвращение или лечение мастита и других патологий молочной железы у женщин и у самок других млекопитающих, способов, более легких в применении и с использованием менее инвазивных средств.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданном и удивительном открытии того, что молоко млекопитающего содержит пробиотические штаммы, которые способны переноситься в молочную железу после их перорального приема, и проявляют местный терапевтический эффект против патогенов, которые вызывают мастит, таким образом, помогая уменьшать случаи мастита.

Кроме того, эти штаммы имеют ряд дополнительных неожиданных предпочтительных свойств, которые делают их пригодными для лечения других заболеваний. Настоящее изобретение является предпочтительным по отношению к способам, известным в области техники, принимая во внимание ценные свойства, которые может обеспечить лактация, и благодаря экономической заинтересованности фермеров в молочной продуктивности.

В первом аспекте, в изобретении предлагается способ селекции пробиотиков, включающий стадии:

(i) выделения штаммов молочнокислых бактерий или бифидобактерий, присутствующих в свежем молоке, из вида млекопитающего с помощью селекции в молочнокислой культуральной среде,

(ii) селекции тех штаммов стадии (i), которые способны к переносу в молочную железу после перорального приема, и/или колонизируют молочную железу после их местного применения,

(iii) селекции тех штаммов стадии (ii), которые способны снижать степень выживаемости и/или степень адгезии Staphylococcus aureus на эпителиальных клетках, и

(iv) селекции тех штаммов стадии (iii), которые способны защищать животных от мастита.

В другом аспекте, в изобретении предлагаются пробиотические штаммы, получаемые способом по изобретению. В другом аспекте, в изобретении предлагается супернатант культуры штамма или смеси штаммов по изобретению.

В следующем аспекте, в изобретении предлагается композиция, фармацевтический продукт, кормовой или пищевой продукт, включающие, по меньшей мере, один пробиотический штамм по изобретению, или супернатант культуры одного или более штаммов по изобретению.

В другом аспекте в изобретении предлагается применение пробиотических штаммов по изобретению, или культурального супернатанта для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики хронической или острой инфекции или инвазии, или нежелательной микробной колонизации, где инфекция, инвазия или колонизация вызваны паразитами, бактериями, дрожжами, грибками или вирусами, причем лекарственное средство воздействует на любую поверхность тела или слизистую оболочку нуждающегося в этом субъекта или животного.

В следующем аспекте в изобретении предлагается применение пробиотического штамма или смеси пробиотических штаммов по изобретению или культурального супернатанта для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики реакций гиперчувствительности к пище и метаболической непереносимости; констипации и других желудочно-кишечных расстройств; воспалительных или аутоиммунных нарушений, выбранных из группы, состоящей из IBD, неспецифического язвенного колита, артрита, атеросклероза, рассеянного склероза, псориаза или саркоидоза; и опухолевого роста, метастаза и рака у нуждающегося в этом субъекта или животного.

В следующем аспекте в изобретении предлагается применение пробиотического штамма или смеси пробиотических штаммов или культурального супернатанта по изобретению для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики аллергических нарушений или астмы у нуждающегося в этом субъекта или животного.

В следующем аспекте в изобретении предлагается применение пробиотического штамма или смеси пробиотических штаммов или культурального супернатанта по изобретению для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики временно подавленного иммунного статуса индивидуумов или животных, подвергшихся физиологической нагрузке или нагрузке, полученной в результате терапии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 представлены последовательности 16S рРНК пробиотических штаммов бактерий, включенных в настоящее изобретение, и их профиль ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК.

На Фигуре 2 представлена диаграмма, демонстрирующая способность переноса в молочную железу мышей штаммов по настоящему изобретению и колонизацию пищеварительного канала мышей штаммами по настоящему изобретению. Количество лактобактерий (серые столбцы), бифидобактерий (черные столбцы) и энтерококков (белые столбцы) в образцах сцеженного молока и в образцах фекалий лактирующих мышей, получающих ежедневно в течение 14 дней 10⁸ КОЕ генетически стабильных штаммов, анализировали с помощью посева бактериальных колоний. Образцы сцеженного молока и образцы фекалий собирали в дни 0, 5 и 10, соответствующие дням получения пробиотиков. Количество ПЦР-позитивных колоний в молоке выражено в %.

На Фигуре 3 представлена диаграмма, демонстрирующая ингибирование выживаемости и адгезии стафилоккоков, получаемое после совместного культивирования стафилоккоков со штаммами, включенными в настоящее изобретение. A. Ингибирующий эффект пробиотиков, включенных в настоящее изобретение, оказываемый на выживаемость Staphylococcus aureus, оценивали in vitro с помощью анализа диффузии в агар из лунки на ТСА-чашках. Диаметр островка ингибирования (в миллиметрах), вызванного бактериальными супернатантами, определяет противомикробный эффект. B. Адгезию патогенного штамма Staphylococcus aureus на клетках Caco-2 оценивали в присутствии пробиотических штаммов по изобретению. Десять случайных областей просчитывали, и результаты выражали как среднее значение % прикрепленных к клеткам грамотрицательных бактерий по сравнению с количеством патогенных бактерий, прикрепленных к клеткам в отсутствие пробиотиков.

На Фигуре 4 представлена диаграмма, демонстрирующая эффект защиты от мастита. Мастит индуцировали у лактирующих мышей через 10 дней после родового акта путем инъекции 10⁶ КОЕ S. aureus в четвертую пару молочных желез. Нагрузку стафилококка в сцеженном молоке (A) и балльную оценку воспаления молочной железы (B) проводили через 5 и 10 дней после инфекции.

На Фигуре 5 представлена диаграмма, демонстрирующая адгезию пробиотических штаммов на клетках кишечника. Адгезию пробиотических штаммов по настоящему изобретению оценивали с использованием клеточных линий кишечника Caco-2 (серые столбцы) или HT-29 (черные столбцы). Двадцать случайных областей просчитывали, и результаты выражали как среднее значение количества бактерий, прикрепленных к клеткам, на единицу области ± Станд.откл.

На Фигуре 6 представлена диаграмма, демонстрирующая выживаемость пробиотических штаммов в условиях, близких к условиям пищеварения. Сопротивляемость пробиотических штаммов по настоящему изобретению к кислотному содержанию (серые столбцы) и к высокому содержанию солей желчных кислот (черные столбцы) оценивали in vitro путем культивирования бактерий в среде MRS, pH 3 или в растворе 0,15% солей желчных кислот в течение 90 минут. Результаты представлены в качестве среднего значения ± Станд.откл. трех независимых экспериментов.

На Фигуре 7 демонстрируется эффект, оказываемый пробиотическими штаммами на модель перорально индуцированной инфекции сальмонеллой. A. Диаграмма, демонстрирующая эффект лечения пробиотиками, оказываемый на ингибирование транслокации сальмонеллы в селезенку. Количество колоний сальмонеллы измеряли в селезенках мышей, подвергнутых лечению с помощью пробиотиков, вакцинированных (серые столбцы) или не вакцинированных (черные столбцы) с помощью 10⁸ КОЕ инактивированных бактерий сальмонеллы, через 24 часа после перорального введения 10¹⁰ КОЕ бактерий сальмонеллы. B. Кривые выживаемости животных после инфекции сальмонеллой.

На Фигуре 8 представлена диаграмма, демонстрирующая эффект, оказываемый пробиотическими штаммами на экспрессию цитокинов и иммуноглобулина G. Анализировали продуцирование TNF-альфа (A) и IL-10 (B) в макрофагах, выделенных из костного мозга, стимулированных с помощью LPS и указанного пробиотического штамма в течение 12 часов, в то время как экспрессию IgG (C) анализировали в лимфоцитах, полученных из селезенки мышей Balb/c (возрастом 6-8 недель) и стимулированных с помощью LPS и указанного пробиотического штамма в течение 6 дней. Продуцирование обоих цитокинов и IgG детектировали с помощью анализа ELISA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предлагается новый способ профилактики и терапевтического лечения инфекционного мастита одновременно у женщин и у самок других нуждающихся в этом млекопитающих. Способ основан на применении конкретных пробиотических штаммов, селектированных для такого конкретного применения. В первом аспекте в изобретении предлагается способ селекции пробиотиков, включающий стадии:

(i) выделения штаммов молочнокислых бактерий или бифидобактерий, присутствующих в свежем молоке, из вида млекопитающего с помощью селекции в молочнокислой культуральной среде,

(ii) селекции тех штаммов стадии (i), которые способны к переносу в молочную железу после перорального приема, и/или колонизируют молочную железу после их местного применения,

(iii) селекции тех штаммов стадии (ii), которые способны снижать степень выживаемости и/или степень адгезии Staphylococcus aureus на эпителиальных клетках, и

(iv) селекции тех штаммов стадии (iii), которые способны защищать животных от мастита.

В стадии (i) любое молоко, полученное из организма млекопитающего, может использоваться в качестве стартового материала для способа по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется молоко человека, коровы, свиньи, овцы, кошки или собаки. Кроме того, любая молочнокислая культуральная среда, известная из области техники, может использоваться для селекции штаммов. Предпочтительно, молочнокислую культуральную среду выбирают из среды MRS, из среды APT, из среды RCM, из среды LM 17, из среды GM 17 и среды Elliker. Наиболее предпочтительно, молочнокислая культуральная среда представляет собой среду MRS.

В стадии (ii) штаммы, выделенные в стадии (i), селектируют на основе их способности к переносу в молочную железу после перорального приема, и/или способны колонизировать молочную железу после местного применения. Для детектирования способности к переносу в молочную железу может быть использован анализ, такой, как описанный в патентной заявке WO2004003235 для детектирования переноса микроорганизма в молоко после перорального приема.

В стадии (iii) может использоваться любой анализ, известный из области техники, для измерения степени выживаемости стафилококка и для измерения степени адгезии S. aureus на эпителиальных клетках. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, эффект, оказываемый пробиотиками на степень адгезии, измеряют с использованием конфлюентной культуры клеточной линии кишечника, к которой добавляют клетки S. aureus и пробиотики по изобретению, и с помощью любого подходящего метода измеряют количество прикрепленных клеток S. aureus. Обычно клеточная линия кишечника представляет собой Caco-2, и количество прикрепленных клеток измеряют с помощью прямого обследования клеточных монослоев с использованием световой микроскопии. Кроме того, альтернативно, стадия селекции (iii) также может включать измерение жизнеспособности S. aureus в присутствии пробиотических штаммов. Может использоваться любой анализ, подходящий для измерения ингибирования роста бактериальных штаммов. Обычно, оценку жизнеспособности S. aureus проводят с помощью анализа диффузии в агар из лунки.

В стадии (iv) может использоваться любой анализ для измерения эффекта защиты от мастита. Предпочтительно, анализ включает использование экспериментальной модели мастита на животном, где, по меньшей мере, один патоген, о котором известно, что он является причинным фактором мастита, инъецируют в молочную железу. Более предпочтительно, экспериментальной моделью на животном является мышь, и патогеном, который необходимо ввести, чтобы вызвать мастит, является S.aureus.

В другом аспекте, в изобретении предлагается пробиотический штамм, который можно получить с помощью способа по изобретению. Предпочтительно, пробиотический штамм выбирают из группы, состоящей из штамма Bifidobacterium breve, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7263, Bifidobacterium breve, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7264, Lactobacillus reuteri, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7260, Lactobacillus plantarum, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7262, Lactobacillus fermentum, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7265, Lactobacillus reuteri, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7266, Lactobacillus salivarius, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7409, Enterococcus hirae, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7410, Enterococcus faecalis, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7411, Lactobacillus plantarum, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7412, Lactobacillus reuteri, депонированного в коллекции CECT под регистрационным номером № 7413.

В следующем аспекте в изобретении предлагается супернатант культуры одного или более штаммов по изобретению. Супернатант может быть получен из культуры с помощью любых средств, доступных специалисту в данной области, включающих центрифугирование, фильтрацию, флотацию и тому подобное.

В следующем аспекте в изобретении предлагается применять пробиотический штамм или смесь пробиотических штаммов по изобретению или супернатант культуры одного или более штаммов по изобретению в качестве лекарственного средства. В другом аспекте, в изобретении предлагается композиция, которая включает, по меньшей мере, один из бактериальных штаммов по изобретению. Предпочтительно, композиция включает, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 6 штаммов по изобретению, и где каждый из штаммов представлен в композиции в пропорции, составляющей от 0,1% до 99,9%, предпочтительно, от 1% до 99%, более предпочтительно, от 10% до 90%. В другом варианте осуществления изобретения, композиция включает любой из бактериальных штаммов по изобретению вместе с другим штаммом или смесью штаммов, и где каждый из штаммов представлен в композиции в пропорции, составляющей от 0,1% до 99,9%, предпочтительно, от 1% до 99%, более предпочтительно, от 10% до 90%. В другом аспекте, в изобретении предлагается композиция, которая включает супернатант культуры одного или более штаммов по изобретению. Предпочтительно, супернатант представлен в композиции в пропорции, составляющей от 0,1% до 99,9%, предпочтительно, от 1% до 99%, более предпочтительно, от 10% до 90%.

В другом аспекте, в изобретении предлагается фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного штамма, или предлагается фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество супернатанта культуры одного или более штаммов по изобретению. Фармацевтический препарат может принимать форму таблеток, капсул, жидких бактериальных суспензий, сухих пероральных добавок, водонасыщенных пероральных добавок, пробирок с сухой смесью, пробирок с жидкой смесью. Предпочтительно, пробиотик-содержащая или супернатант-содержащая композиция и фармацевтический продукт направлены к поверхности слизистой оболочки рта, желудка и/или кишечника; однако они также могут быть направлены к слизистой оболочке носоглотки, дыхательных путей, репродуктивного тракта или к слизистой оболочке желез, и/или к молочной железе и они могут вводиться женщинам или животным с помощью перорального пути введения, назального, окулярного, ректального, местного и/или вагинального.

В другом аспекте, в изобретении предлагается кормовой или пищевой продукт, включающий, по меньшей мере, один пробиотический штамм по изобретению, или супернатант культуры одного или более штаммов по изобретению. Не ограничивающие примеры продуктов питания, которые могут использоваться по настоящему изобретению, представляют собой молоко, йогурт, сыр, творог, ферментированное молоко, ферментированные продукты на основе молока, ферментированные продукты на основе круп, ферментированные мясные продукты, другие мучные продукты на основе молока или на основе круп, смеси лечебного питания, мороженое, соки, хлеб, пирожные или конфеты, смеси корма животных, полусинтетические или синтетические питательные смеси, детские смеси, смеси лечебного питания, мороженое, соки, мука, хлеб, пирожные, конфеты или жевательные резинки.

Требуемое дозированное количество пробиотических штаммов в композиции, пищевой или фармацевтической композиции, описанных ранее, будет варьироваться согласно природе нарушения или согласно предполагаемому применению композиции, которая используется или профилактически, или терапевтически, и согласно типу вовлеченного в использование композиции организма.

В настоящем изобретении может использоваться любая подходящая дозировка пробиотиков или их комбинаций при условии, что токсические эффекты не превышают терапевтических эффектов. Терапевтическая эффективность и токсичность могут определяться с помощью стандартных фармацевтических процедур с использованием экспериментальных животных, таких процедур, как расчет статистических данных ED (дозы, терапевтически эффективной у 50% популяции) или LD (дозы, летальной для 50% популяции). Соотношение дозы токсического эффекта к дозе терапевтического эффекта представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен в виде соотношения LD/ED. Тем не менее, активность новых микроорганизмов у индивидуума является естественно дозо-зависимой. То есть, чем больше новых микроорганизмов вводится посредством принятия внутрь или введения вышеуказанного пищевого материала или фармацевтической композиции, тем выше защитная и/или терапевтическая активность микроорганизмов. Так как микроорганизмы по настоящему изобретению не причиняют вреда людям и животным и достоверно выделяются из грудного молока здорового человека, то эти микроорганизмы могут вводиться в большом количестве, так что, по существу, большая пропорция слизистой оболочки индивидуума будет колонизирована новыми микроорганизмами. Предпочтительными являются композиции, которые демонстрируют большие значения терапевтических индексов. Данные, полученные из исследований на модели животных, используются для определения интервала дозировок для применения у человека или животного. Дозировка, содержащаяся в таких композициях, предпочтительно находится в интервале циркулирующих концентраций, который включает ED, с небольшой токсичностью или в отсутствие токсичности. Дозировка варьируется в этом интервале в зависимости от применяемой дозированной формы, чувствительности пациента и пути введения. Точная дозировка будет определяться лечащим врачом в свете факторов, связанных с требующимся лечением субъекта. Например, для приготовления пищевой композиции по настоящему изобретению, по меньшей мере, один пробиотический штамм по настоящему изобретению вводится с подходящим носителем в количестве от 10⁵ КОЕ/г примерно до 10¹² КОЕ/ на 1 г материала носителя, предпочтительно, примерно от 10⁶ КОЕ/г примерно до 10¹¹ КОЕ/ на 1 г материала носителя, более предпочтительно, примерно от 10⁶ КОЕ/г примерно до 10¹⁰ КОЕ/ на 1 г материала носителя.

В случае фармацевтической композиции, дозировка пробиотического штамма должна составлять примерно от 10⁵ КОЕ/г примерно до 10¹⁴ КОЕ/ на 1 г материала носителя, предпочтительно, примерно от 10⁶ КОЕ/г примерно до 10¹³ КОЕ/ на 1 г материала носителя, более предпочтительно, примерно от 10⁷ КОЕ/г примерно до 10¹² КОЕ/ на 1 г материала носителя. В целях настоящего изобретения аббревиатура КОЕ будет обозначать "колониеобразующая единица", которая определяется как количество бактериальных клеток, обнаруженных с помощью микробиологических подсчетов на чашках с агаром.

Дозировка и введение регулируются для обеспечения подходящего уровня активного компонента или для поддержания целевого эффекта. Факторы, которые могут приниматься во внимание, включают тяжесть стадии заболевания, общее состояние здоровья субъекта, возраст, вес и пол субъекта, время и частоту введения, комбинацию(и) лекарственных средств, чувствительность реакции и ответ на терапию. Композиции продолжительного действия могут вводиться каждые 3-4 дня, каждую неделю или каждые две недели в зависимости от периода полужизни и скорости выведения конкретной композиции.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, изобретение также относится к композициям штаммов по настоящему изобретению в лиофилизованной, сублимированной или в сухой форме, которые могут быть получены с помощью любого стандартного метода, известного из уровня техники.

В другом аспекте, в изобретении предлагается композиция, фармацевтический продукт, кормовой или пищевой продукт, где пробиотический штамм или смесь штаммов представлены в частично или полностью инактивированной форме.

Множество людей обладает нарушенной кишечной микрофлорой, то есть нарушен баланс между полезными и вредными кишечными бактериями. Ряд факторов, среди которых стресс, присутствие солей желчных кислот и специфическое питание, влияет на бактериальную микрофлору. В этих случаях процесс ферментации может быть нарушен, и количество полезных бактерий уменьшается, вследствие чего слизистая оболочка толстой кишки иссушается и прекращает функционировать в то же самое время, как потенциальные злокачественные бактерии быстро возрастают в количестве. Пробиотические штаммы по изобретению способны предотвращать адгезию S. aureus на эпителиальных клетках, а также способны уменьшать степень выживаемости клеток S. aureus и многих других патогенов. Таким образом, пробиотические штаммы по изобретению конкретно применяются для лечения указанных заболеваний, так как они эффективно содействуют уничтожению патогенов, в то время одновременно они содействуют репопуляции поверхности слизистой оболочки физиологической микрофлорой.

По этой причине, один аспект настоящего изобретения представляет собой применение пробиотиков по изобретению и супернатантов культуры одного или более штаммов по изобретению для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для профилактического или терапевтического лечения хронической или острой инфекции, или инвазии, или нежелательной микробной колонизации поверхности слизистой оболочки, или любого другого локального участка у человека, где инфекция, инвазия или колонизация вызваны паразитами, бактериями, дрожжами, грибками или вирусами, оказывающими влияние на любую поверхность тела или слизистой оболочки, причем указанное терапевтическое лечение включает введение эффективного количества пробиотика или пробиотик-содержащей композиции нуждающемуся в этом субъекту. В предпочтительном варианте осуществления изобретения инфекция или колонизация любой поверхности тела или слизистой оболочки субъекта или животного вызвана паразитами, бактериями, дрожжами, грибками или вирусами.

Пробиотики по изобретению были селектированы на основе их способности колонизировать молочную железу после перорального приема и на основе их способности предотвращать адгезию S. aureus на эпителиальных клетках, а также на основе их способности снижать выживаемость S. aureus. Таким образом, штаммы являются подходящими для лечения мастита. Соответственно, в следующем аспекте, в изобретении предлагается применение пробиотических штаммов по изобретению и супернатантов культур одного или более штаммов по изобретению для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения или профилактики инфекционного мастита у человека и животного. Этот способ заключается в применении пробиотических штаммов, селектированных из соответствующего свежего молока, и в способности этих штаммов к переносу в молочную железу и в проявлении там своих полезных свойств, таких как ингибирование стафилококковой инфекции.

Кроме того, также было продемонстрировано, что пробиотические штаммы по изобретению обладают некоторыми из свойств, характерных для потенциального пробиотического штамма, а именно безвредность и хорошая сопротивляемость процессу пищеварения, а также способность колонизации пищеварительного канала. Таким образом, штаммы способны достигать кишечного тракта после перорального приема и проявляют там свои терапевтические свойства. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, в изобретении предлагается применение пробиотических штаммов по изобретению и супернатанта культуры одного или более штаммов по изобретению для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения неонатальной диареи.

Известно, что пробиотические штаммы уменьшают продуцирование активированными макрофагами про-воспалительных цитокинов во время хронических воспалительных нарушений. Соответственно, в другом аспекте, в изобретении предлагается применение бактериальных штаммов, композиций по изобретению и супернатантов культуры одного или более штаммов по изобретению в приготовлении фармацевтической композиции для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения воспалительных или аутоиммунных нарушений. Не ограничивающие примеры таких воспалительных и аутоиммунных заболеваний включают IBD, неспецифический язвенный колит, артрит, атеросклероз, рассеянный склероз, псориаз или саркоидоз.

Пробиотические штаммы по изобретению способны к репопуляции иммунного барьера пищеварительного канала, и, таким образом, они также конкретно подходят для улучшения иммунного барьера пищеварительного канала нуждающегося в этом субъекта или животного. Соответственно, в другом аспекте в изобретении предлагается применение одного или более пробиотических штаммов по изобретению и супернатантов культуры одного или более штаммов по изобретению для приготовления фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики реакций гиперчувствительности к пище и метаболической непереносимости, такой как лактозная непереносимость; констипации и других желудочно-кишечных расстройств.

Известно, что пробиотики применяются для противодействия раку благодаря их эффектам, оказываемым на ингибирование в кишечнике канцерогенных токсинов, таких как нитрозамины, а также благодаря эффекту, оказываемому этими пробиотиками на модулирование естественной иммунной реакции. Соответственно, в следующем аспекте в изобретении предлагается применение штаммов, заявленных в настоящем изобретении, и супернатантов культуры одного или более штаммов по изобретению для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для профилактического или терапевтического лечения некоторых типов рака и для ингибирования опухолевого роста, метастаза и рака у нуждающегося в этом субъекта или животного.

Штаммы по изобретению способны модулировать иммунный ответ и баланс между цитокинами Th1 и Th2. Соответственно, в следующем аспекте в изобретении предлагается применение штаммов, композиций и супернатантов по изобретению для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики аллергических нарушений, астмы и нарушений, связанных с развитием устойчивости против принятых внутрь белков.

В следующем аспекте, в изобретении предлагается применение штаммов, композиций и супернатантов по изобретению для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики временного подавления иммунного статуса индивидуумов, возникающего в процессе старения, или временного подавления иммунного статуса здоровых индивидуумов, подвергшихся интенсивной нагрузке или, как правило, сильной физиологической нагрузке или стрессу.

В другом аспекте, в изобретении предлагается терапевтическое применение пробиотического штамма, комбинаций штаммов и супернатантов, где штамм или штаммы вводятся перорально, местно, назально, энтерально, окулярно, урогенитально, ректально или вагинально.

Кроме того, благодаря присутствию селектированных штаммов в грудном молоке, субъекты, нуждающиеся в лечении, могут представлять собой не только тех, кто непосредственно принимает селектированные штаммы, но также могут представлять собой утробный плод или грудных младенцев. Соответственно, еще в одном аспекте в изобретении предлагается применение штаммов, композиций и супернатанта по изобретению для производства лекарственного средства, созданного для введения лактирующей женщине с целью терапевтического или профилактического лечения их утробных плодов и/или грудных младенцев.

Следующие методы и примеры иллюстрируют изобретение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Выделение пробиотиков из молока млекопитающего

Образцы свежего молока (2 мл за исключением случаев, когда у самок собирают только 0,5 мл) получали от 23 здоровых женщин на 6-14 день после родов; от 8 самок свиньи на 5 день после родов, от 9 самок на 2-10 день после родов и от 4 коров на 2 день после родов. Ни женщины, ни животные не испытывали затруднений во время родов, и им не проводили никакой терапии с введением антибиотиков в последние две недели перед сбором образца молока. Все образцы молока немедленно замораживали при -80°C.

Для того чтобы выделить бактериальные штаммы из этих образцов, последовательные разведения 0,1 мл образцов в пептонном бульоне высевали на чашки со средой MRS, APT, RCM, LM 17, GM 17 и Elliker-агаром, инкубировали при 37°C в аэробных и в анаэробных условиях в течение 24-48 часов. Среди исходно полученных колоний в приблизительном количестве 1200 штук, выбрали 120 (10%; включают характерные колонии с различной морфологией, наблюдаемые на чашках) и субкультивировали на MRS-агаре при 37°C в анаэробных условиях. Среди них дополнительно выбирали 86 изолятов со следующими характеристиками: не образующие спор, негативные по каталазе и оксидазе грамположительные бактерии.

Эти 68 селектированных изолятов дополнительно охарактеризовывали как фенотипически (API CH50, APIZYM и оценка устойчивости к антибиотикам), так и генетически (секвенирование 16S рРНК и профиль ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК). Эта характеризация привела в результате к получению 59 различных бактериальных штаммов, которые дополнительно оценивали посредством процесса скрининга, описанного в настоящем изобретении, с целью получения потенциальных пробиотических кандидатов, способных защищать организм от мастита.

После окончания процесса скрининга только 6 штаммов (2 от женщин, 2 от самок и 2 от самок свиней) удовлетворяли всем определенным критериям. Другие молочнокислые бактерии получали от других видов млекопитающего, таких как коза, овца, кошка, крыса и мышь, но они не удовлетворяли в достаточной степени всем критериям скрининга, и по этой причине их не включили в настоящее изобретение.

- Bifidobacterium breve, причем указанные бактерии получены из молока человека.

- Bifidobacterium breve, причем указанные бактерии получены из молока человека.

- Lactobacillus reuteri, причем указанные бактерии получены из молока свиньи.

- Lactobacillus plantarum, причем указанные бактерии получены из молока свиньи.

- Lactobacillus reuteri, причем указанные бактерии получены из молока собаки.

- Lactobacillus fermentum, причем указанные бактерии получены из молока собаки.

- Lactobacillus salivarius, причем указанные бактерии получены из молока свиньи.

- Enterococcus hirae, причем указанные бактерии получены из молока кошки.

- Enterococcus faecalis, причем указанные бактерии получены из молока кошки.

- Lactobacillus plantarum, причем указанные бактерии получены из молока кошки.

- Lactobacillus reuteri, причем указанные бактерии получены из молока собаки.

Пример 2: Физиологическая и генетическая характеризация

Все эти изоляты генетически и физиологически охарактеризовывали. Для идентификации каждого пробиотического штамма, осуществляли анализ ферментации API 50CH (BioMerieux) штаммов при 37°C в анаэробных условиях в течение 24 и 48 часов, следуя инструкциям производителя. Результаты для 24 часов суммировали в Таблице I. Позитивный ферментируемый субстрат представляет собой тот, для которого получено значение выше чем 3.

Благодаря низкой специфичности характеризации API, также осуществляли анализ последовательностей 16S рРНК селектированных бактериальных штаммов. Последовательность 16S РНК селектированных бактерий и их профиль ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК продемонстрированы на Фигуре 1. Полученные результаты привели к классификации бактериальных штаммов, как указано выше. Соответственно этой классификации бактериальные штаммы по изобретению депонировали согласно Бедапештскому соглашению в коллекцию CECT - Coleccion Española de Cultivos Tipo-, Валенсия (Испания) 17 апреля 2007 года, и присвоили им следующие регистрационные номера:

- Bifidobacterium breve CECT7263

- Bifidobacterium breve CECT7264

- Lactobacillus reuteri CECT7260

- Lactobacillus plantarum CECT7262

- Lactobacillus reuteri CECT7265

- Lactobacillus fermentum CECT7266

Следующие бактериальные штаммы по изобретению депонировали согласно Будапештскому соглашению в коллекцию CECT - Coleccion Española de Cultivos Tipo-, Валенсия (Испания) 30 мая 2008 года:

Lactobacillus salivarius CECT7409

Enterococcus hirae CECT7410

Enterococcus faecalis CECT7411

Lactobacillus plantarum CECT7412

Lactobacillus reuteri CECT7413

Пример 3: Селективный скрининг штаммов

Пример 3a: Перенос в молочную железу после перорального приема

После получения различных штаммов кандидатов из молока млекопитающего, как указано в первом критерии селекции, следующая стадия в способе селекции, описанном в настоящем изобретении, состоит в том, что бактерии должны быть способны к переносу в молоко после перорального приема или местного применения. Для того чтобы протестировать эту способность, предполагаемые штаммы генетически метили, как описано ранее (WO 2004/003235), и вводили беременным крысам перорально, выступающим в качестве экспериментальной животной модели. В молоке и неонатальных фекальных образцах измеряли вместе лактобактерии, бифидобактерии и энтерококки. Кроме того, специфичный перенос бактерий анализировали с помощью ПЦР-скрининга колоний, полученных из молока лактирующих крыс и из неонатальных фекальных образцов.

Четырем беременным крысам Wistar перорально инокулировали 10⁸ КОЕ генетически меченных штаммов, переносимых в 0,5 мл молока, каждые два дня за две недели до родов. После родов, перенос генетически меченных бактерий в грудное молоко анализировали путем сравнения бактерий, выделенных из образцов неонатальных фекалий в дни 0, 5 и 10 после родов. Все чашки инкубировали в течение 24 часов при 37°C в анаэробных условиях. Для каждого полученного образца измеряли вместе бифидобактерии, лактобактерии и энтерококки. Среди колоний, которые росли на чашках с агаром MRS, случайно выбирали 50 из каждого образца и субкультивировали на чашках Cm-MRS. В конечном счете использовали Cm-устойчивые колонии в качестве матриц для детекции специфических генетически меченных колоний (Фигура 2). Перенос считали позитивным, когда, по меньшей мере, 1% полученных колоний представляли собой PCR-позитивные колонии.

Пример 3b: Ингибирование выживаемости Staphylococcus aureus

Пробиотические штаммы по настоящему изобретению оценивали с использованием анализа диффузии в агар из лунки на предмет их способности продуцировать бактерицидные метаболиты, способные снижать выживаемость Staphylococcus aureus. Готовили чашки с агаром TSA, содержащие 10⁶ КОЕ/мл S. aureus. Лунки диаметром 5 мм вырезали в агаре с использованием стерильного инструмента cork-borer. Затем добавляли в лунки 50 мкл концентрированного в два раза супернатанта каждого раствора, содержащего пробиотический штамм, и давали возможность диффундировать в агар в течение периода пре-инкубации в течение 2 часов при 4°C, с последующей аэробной инкубацией чашек при 37°C в течение 16-18 часов. После периода инкубации, наблюдали и измеряли островки ингибирования (в миллиметрах) для оценки бактерицидного эффекта пробиотических кандидатов (Фигура 3A).

Пример 3c: Ингибирование адгезии Staphylococcus aureus на эпителиальных клетках

Клеточные линии кишечника Caco-2 культивировали до конфлюэнтного состояния в 35 мм пластиковых чашках, содержащих 2 мл среды без антибиотиков. На 10-14 день после достижения состояния конфлюэнтности, 1 мл среды заменяли на 1 мл суспензии, содержащей 10⁸ пробиотических бактерий в среде DMEM. Культуры инкубировали в течение 1 часа при 37°C. После этого, к культурам добавляли 1 мл суспензии, содержащей 10⁸ патогенных бактерий (S. aureus) в среде DMEM, и инкубировали еще 1 час при 37°C. Клетки промывали дважды с помощью PBS и фиксировали ледяным 70% метанолом в течение 30 минут. Чашки сушили на воздухе и окрашивали по Граму. Прикрепленные бактерии визуализировали с использованием оптического микроскопа Axiovert 200 (Zeiss) при 1000x увеличении в масляной иммерсии. Считали количество грамотрицательных бактерий в 10 случайных областях, и результаты выражали как среднее значение % патогенных бактерий, прикрепленных к клеткам, по сравнению с контрольными культурами, не содержащими пробиотические штаммы (Фигура 3B).

Пример 3d: Защиты от мастита

Для оценки эффективности защиты от мастита с помощью пробиотических кандидатов использовали экспериментальную модель на мыши, имеющей эту патологию. Вкратце, 10-ти беременным крысам Wistar на группу ежедневно вводили с помощью перорального зонда 10⁸ КОЕ/день каждого пробиотического штамма, переносимого в 200 мкл молока в течение двух недель после родов. Через одну неделю после родов инфекцию мастита индуцировали у животных с помощью инъекции 10⁶ КОЕ S. aureus в четвертую пару молочных желез. Сцеженное молоко собирали в дни 0, 5 и 10 после инфекции для измерения бактериальной нагрузки (Фигура 4A); и 5 животных каждой группы умерщвляли в дни 5 и 10 после инфекции для получения биопсий молочной железы с тем, чтобы оценить воспалительный процесс с помощью гистологического исследования.

Цельные железы фиксировали в 5% формалине и обезвоживали с помощью спирта и, в конечном счете, помещали в парафин. Тканевые срезы окрашивали с помощью гематоксилин-эозина, исследовали слепым методом (Фигура 4B). Для качественной оценки изменений гистологии молочной железы, значение индекса воспаления (HV) определяли следующим образом:

- Балльная оценка 0: Нет инфильтрации.

- Балльная оценка 1: Умеренная интерстициальная инфильтрация PMN клеток в выделенные области тканевых срезов, не нарушенный тубулярный эпителий.

- Балльная оценка 2: Интерстициальная инфильтрация, перекрывающая большую часть областей, дисперсные области нарушения ткани с потерей структуры ткани и редко встречающиеся картины образования абсцесса.

- Балльная оценка 3: Тяжелая форма инфильтрации, перекрывающая большую часть областей, часто встречающиеся области нарушения ткани с потерей архитектуры ткани и часто встречающиеся картины образования абсцесса.

Пример 4: Пробиотический потенциал штаммов

Селектированные штаммы дополнительно анализировали на предмет выявления различных характеристик, которые могут усиливать их способности действовать в качестве пробиотических штаммов. Полученные результаты описаны в указанных примерах.

Пример 4a: Адгезия на клетки Caco-2 и HT-29

Для анализов адгезии, клеточные линии Caco-2 (ATCC HTB-37) и HT-29 (ATCC HTB-38) применяли в качестве модели клеток кишечника. Обе клеточные линии представляют черты, характерные для клеток кишечника, такие как поляризация, экспрессия ферментов кишечника, продуцирование конкретных структурных полипептидов, таких как муцины.

Клетки растили в пластиковых матрасах (75 см², Nunc) в среде DMEM в качестве культуральной среды с добавлением 10% инактивированной ФТС, заменимые аминокислоты, 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицин, 1 мкг/мл амфотерцина. Культивирование осуществляли при 37°C в атмосфере, включающей 95% воздуха и 5% CO₂. Среду меняли 1 раз в два дня и клетки рассевали каждую неделю.

Клеточные линии кишечника Caco-2 и HT-29 рассевали в 35 мм-пластиковых чашках, содержащих 2 мл среды без антибиотиков до состояния конфлюэнтности. На 10-14 день после достижения состояния конфлюэнтности, 1 мл среды заменяли на 1 мл суспензии, содержащей 10⁸ бактерий в среде DMEM (PAA). Культуры инкубировали в течение 1 часа при 37°C. После этого, клетки промывали дважды с помощью PBS и фиксировали ледяным 70% метанолом в течение 30 минут. Чашки сушили на воздухе и окрашивали по Граму. Прикрепленные бактерии визуализировали с использованием оптического микроскопа Axiovert 200 (Zeiss) при 1000x увеличении в масляной иммерсии. Считали количество бактерий в 20 случайных областях, и результаты выражали как среднее значение количества бактерий, прикрепленных к клеткам на область ± станд.откл. (Фигура 5).

Пример 4b: Устойчивость к кислоте и к солям желчной кислоты

Для анализа устойчивости пробиотических штаммов по настоящему изобретению к кислотному содержанию и к содержанию солей желчной кислоты, к условиям, с которыми столкнутся эти бактерии в процессе транзита по системе пищеварения, бактерии культивировали в среде MRS-бульона с pH 3 или с содержанием 2% солей желчной кислоты (Sigma) в течение 90 минут. Выживаемость рассчитывали с помощью посева на чашки с MRS-агаром последовательных разведений бактерий и сравнивали с количеством колоний, полученных в контрольных условиях (MRS-бульон, pH 5,8).

Чашки с бактериями культивировали в течение 24 часов при 36°C в предельно анаэробных условиях. Эксперимент повторяли три раза (Фигура 6).

Пример 4c: Устойчивость к антибиотикам

Использование современных антибиотиков приводит к снижению количества симбиотической микрофлоры пищеварительного канала, что иногда приводит к диарее и другим расстройствам пищеварительного канала. Кроме того, это снижение количества бактерий пищеварительного канала может быть следствием инфекции организма-хозяина условно-патогенными бактериями и вирусами. Использование антибиотиков для блокирования инфекции не излечивает этого расстройства, но осложняет его. В других случаях, подобных воспалению кишечника, где пробиотики могут проявить полезную функцию, этот потенциальный эффект иногда ограничивается одновременной терапией с использованием антибиотиков. По всем этим причинам селекция потенциальных пробиотических штаммов, которые способны сопротивляться распространенным антибиотикам, должен быть со всей очевидностью интересным.

Для анализа устойчивости пробиотических штаммов по настоящему изобретению использовали анализ диффузии в агар из лунки. Готовили чашки с агаром Müeller-Hinton, содержащие 10⁶ КОЕ/мл каждого пробиотического штамма. Затем добавляли коммерческие диски антибиотика в лунки и давали возможность диффундировать в агар в течение 10 минут периода пре-инкубации при комнатной температуре с последующей предельно анаэробной инкубацией чашек при 36°C в течение 16-18 часов. Данные об устойчивости пробиотических штаммов к антибиотикам суммированы в Таблице II.

Пример 4d: Продуцирование противомикробных метаболитов

Предположили, что основной механизм, используемый пробиотиками, заключается в контролировании баланса между полезными и вредными бактериями кишечника в системе пищеварительного канала. Когда количество полезных бактерий уменьшается, условно-патогенные бактерии могут разрастаться и нарушать самочувствие организма-хозяина или даже индуцировать инфекцию. Большинство бактериальных организмов приобрели характеристики или механизмы, которые уменьшают возможности роста других микроорганизмов, которые находятся с ними в симбиозе и, таким образом, дают возможность их собственного селективного роста. Уменьшение pH посредством продуцирования кислоты молочнокислыми бактериями является одним из таких механизмов. Кроме того, некоторые молочнокислые бактерии также продуцируют биоактивные пептидные компоненты и другие метаболиты, которые селективно ингибируют рост других бактерий, дрожжей или грибков. Это случай реутерина (альдегид) или бактериоцинов (пептиды, такие как низин или педиоцин PA-I).

Пробиотические штаммы по настоящему изобретению оценивали с помощью анализа диффузии в агар из лунки на предмет их способности продуцировать бектерицидные метаболиты. Готовили чашки с TSA-агаром, содержащие 10⁶ КОЕ/мл различных патогенных бактериальных штаммов, и оценивали так, как указано ранее в Примере 3b для S. aureus. Полученные результаты описаны в Таблице III.

Пример 5: Эффект пробиотических штаммов по настоящему изобретению, оказываемый на транслокацию Salmonella typhimurium у мышей после иммунизации с помощью вакцины в виде инактивированного штамма Salmonella

Транслокация грамотрицательных бактерий по эпителию пищеварительного канала может встречаться в особенности у субъектов после желудочно-кишечной инфекции, заболевания или хирургической операции. В отсутствие лечения это может привести к эндотоксикозу. В этом примере, исследовали эффект, оказываемый получением пробиотических штаммов по настоящему изобретению на транслокацию патогенна пищеварительного канала Salmonella typhimurium.

Самцам мышей Balb/c (возрастом 6-8 недель) ежедневно давали 1×10⁸ КОЕ в 0,2 мл молока или только молоко в течение двух недель. После этого мышей или перорально иммунизировали, или не иммунизировали с помощью вакцины в виде инактивированного штамма Salmonella (10⁸ КОЕ, инактивированных с помощью параформальдегида, в 0,2 мл молока). После иммунизации мышам давали пробиотические препараты в другие дни в течение дополнительных двух недель. Через две недели после пероральной иммунизации, всем мышам перорально вводили живой штамм S. typhimurium (10¹⁰ КОЕ в 0,2 мл молока). Затем через 24-48 часов определяли у половины животных уровень колонизации S. typhimurium в селезенке. За оставшимися животными следили в течение двух дополнительных недель с целью оценки выживаемости животных после инфекции бактериями Salmonella.

Полученные результаты демонстрируют, что большинство тестируемых пробиотиков потенцируют полезный эффект вакцинации мышей вакциной в виде инактивированного штамма Salmonella, как показано на Фигуре 7.

Пример 6: Эффект L. plantarum CECT7262 или L. reuteri CECT7260, оказываемый на предотвращение неонатальной диареи у новорожденных поросят

Отлучение от грудного молока поросят в возрасте 3-4 недель коррелирует с высоким показателем смертности у этих животных в основном благодаря увеличению случаев диарейных инфекций. Вероятно, эта высокая смертность связана с подавлением их иммунитета благодаря стрессовой модификации их пищевого и режимного статуса и благодаря важным изменениям в составе их микробиоты пищеварительного канала.

По этой причине фермеры стараются разрешить эту задачу с использованием нескольких способов, таких как использование антибиотиков, иммуностимуляторов или компонентов защиты слизистой оболочки, таких как колистин или ZnO. Однако официальное запрещение EU на использование антибиотиков для продукции животноводства в 2006 усложнило ситуацию. По этой причине использование пробиотиков для модулирования микробиоты пищеварительного канала и для модулирования иммунного ответа проявило себя в качестве потенциальной альтернативы.

Сравнили защитный эффект, оказываемый введением 3×10⁹ КОЕ/день L. reuteri CECT7260 и L. plantarum CECT7262, и введением состава животного корма, содержащего 3000 м.д. ZnO и 40 м.д. колистина, двум группам из 48 и 45 отлученных от грудного молока поросят в течение периода времени, составляющего 34 дня.

В обеих группах никто из животных не страдал от диареи, не умирал во время исследования, и по оценкам вес тела также был сходным при обоих типах лечения, что предполагает, что состав животного корма с добавлением этих пробиотиков является, по меньшей мере, настолько же хорошим, как составы, содержащие подходящие антибиотики и иммуномодуляторы.

Пример 7: Эффект, оказываемый пробиотическими бактериями на продуцирование воспалительных цитокинов и IgG

Кроме уменьшения риска инфекции, многие клинические эффекты, ассоциированные с лечением пробиотиками, проявляются благодаря иммуномодулирующим способностям селектированных пробиотических штаммов. Регуляция иммунного ответа обычно опосредована через изменение баланса между про-воспалительными цитокинами (Th1), такими как TNF-альфа, гуморальными цитокинами (Th2), такими как IL-4 или IL-13, и регуляторными цитокинами (Th3), такими как IL-10 и TGF-бета. Кроме того, разбалансировка иммунного ответа будет также модулировать секрецию иммуноглобулинов во время последующего гуморального ответа. По этой причине тестировали эффект, оказываемый некоторыми из пробиотических штаммов по настоящему изобретению на регуляцию экспрессии некоторых из этих ключевых цитокинов и IgG.

В качестве клеточной модели использовали выделенные из костного мозга макрофаги, стимулированные с помощью 100 нг/мл LPS (Sigma). 10⁵ макрофагов/на лунку культивировали в 24-луночных пластиковых планшетах (Nunc) в присутствии 1 мл DMEM. После прикрепления, макрофаги стимулировали или не стимулировали с помощью 100 нг/мл LPS и с помощью 10⁷ КОЕ/мл указанных пробиотических штаммов в течение 12 часов при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Супернатанты собирали и анализировали продуцирование цитокинов с использованием анализа ELISA (Biosource) мышиного TNF-альфа или мышиного IL-10. Полученные результаты суммированы на Фигурах 8A и B.

Анализ эффекта, оказываемого пробиотическими штаммами по настоящему изобретению на продуцирование иммуноглобулинов, осуществляли с использованием культур лимфоцитов, полученных из селезенки самцов мышей Balb/c (возрастом 6-8 недель). 2×10⁶ лимфоцитов культивировали в 1 мл DMEM в 24-луночных пластиковых планшетах и стимулировали с помощью инактивированных пробиотических культур (10⁸ КОЕ/мл) в присутствие или в отсутствие 25 мкг/мл LPS в течение 6 дней. Продуцирование лимфоцитами IgG оценивали с использованием анализа ELISA мышиного IgG от Bethyl (Фигура 8C).

1. Способ селекции пробиотиков, включающий стадии:
(i) выделения штаммов молочно-кислых бактерий или бифидобактерий, присутствующих в свежем молоке, из вида млекопитающего с помощью селекции в молочно-кислой культуральной среде,
(ii) селекции тех штаммов стадии (i), которые способны к переносу в молочную железу после перорального приема и/или колонизируют молочную железу после их местного применения,
(iii) селекции тех штаммов стадии (ii), которые способны снижать степень выживаемости и/или степень адгезии Staphylococcus aureus на эпителиальных клетках, и
(iv) селекции тех штаммов стадии (iii), которые способны защищать животных от мастита.

2. Способ по п.1, где молоко, используемое в стадии (i), выбрано из молока человека, свиньи, коровы, кошки, овцы и собаки.

3. Пробиотический штамм, получаемый с помощью способа по п.1 или 2.

4. Пробиотический штамм по п.3, отличающийся тем, что он выбран из группы, состоящей из штамма Bifidobacterium breve, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7263, Bifidobacterium breve, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7264, Lactobacillus reuteri, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7260, Lactobacillus plantarum, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7262, Lactobacillus fermentum, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7265, и штамма Lactobacillus reuteri, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7266, Enterococcus hirae, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7410, Lactobacillus plantarum, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7412, Enterococcus faecalis, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7411, Lactobacillus salivarius, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7409, Lactobacillus reuteri, депонированного в коллекции СЕСТ под регистрационным номером №7413.

5. Супернатант культуры штамма или штаммов, определенных в п.3 или 4.

6. Пробиотический штамм по п.3 или 4 или супернатант по п.5 для применения в качестве лекарственного средства.

7. Композиция, включающая, по меньшей мере, пробиотический штамм по п.3 или 4 или супернатант, определенный в п.5.

8. Композиция, определенная в п.7, которая представлена в замороженной, лиофилизованной или сухой форме.

9. Композиция, определенная в п.7 или 8, где пробиотический штамм представлен в частично инактивированной или полностью инактивированной форме.