Способ скрининга пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов
Владельцы патента RU 2448162:
Государственное научное учреждение Научно-исследовательский ветеринарный Институт Нечерноземной зоны РФ Российской Академии сельскохозяйственных наук (RU)
Мышей заражают пероральным введением суспензии двухдневной культуры родококков Rhodococcus equi, патогенной для свиней, содержащей 5×107 КОЕ в 1,0 мл физиологического раствора, в дозе 0,1 мл. После заражения перорально пятикратно с интервалом в 24 ч вводят пробиотический препарат в дозе 1-5×105-6 КОЕ в 1,0 мл, через 5 дней после заражения мышей убивают, суспензии внутренних органов высевают на плотные яичные среды. Через 1-2 дня культивирования при температурном оптимуме, но не позже 5 дней, контролируют выросшие колонии окраской по Цилю-Нильсену. Антагонистическую активность оценивают по индексу блокирования роста - отношению количества колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных, не получавших пробиотический препарат, к количеству колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных, получавших пробиотический препаратов. Вывод об эффективности пробиотического препарата делают при показателе, превышающем значение 3. Изобретение обеспечивает проведение быстрого и адекватного по отношению к нокардиоформным актиномицетам скрининга пробиотических препаратов in vivo. 15 табл., 14 пр.
Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается скрининга (поиска) пробиотических препаратов против кислотоустойчивых микроорганизмов и может быть использовано для скрининга (поиска) пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов in vivo.
Нокардиоформные актиномицеты - это ветвящиеся или мицелиальные бактерии, размножающиеся фрагментацией всех или отдельных частей их гиф с образованием неравномерных палочковидных и коккоидных элементов, которые затем дают начало новому мицелию /1/. К ним относятся бактерии родов Corynebacterium (вызывают коринебактериоз - инфекционное заболевание овец, характеризующееся поражением органов зрения и суставов), Mycobacterium (вызывают туберкулез и лепру), Nocardia (вызывают нокардиоз - инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных, характеризующееся гнойным воспалением лимфатических сосудов, молочной железы, грануломатозным поражением органов дыхания, а также кожи и подкожной клетчатки) и Rhodococcus (вызывают родококкоз у свиней и лошадей), близкие по составу и структуре химических компонентов клеточных стенок, обладающих значительной биологической активностью и определяющих многие свойства микроорганизмов. Близкое генетическое, иммунологическое, хемотаксономическое родство Corynebacterium, Nocardia и Rhodococcus с микобактериями обусловливает параспецифическую сенсибилизацию макроорганизма к туберкулину, что затрудняет диагностику туберкулеза. Установлено широкое распространение нокардий, родококков и коринебактерий в природе, что подтверждается выделением из биологического материала нокардий в 14,28% случаев и 43,65% из объектов внешней среды, родококков - в 25,1% и 56,34% и коринебактерий - в 31,25% и 25,92% соответственно /2/. Заражение нокардиоформными актиномицетами происходит преимущественно алиментарным путем. Объект заражения - молодняк сельскохозяйственных животных. Устойчивость новорожденного молодняка сельскохозяйственных животных к туберкулезу и другим актиномицетным инфекциям основывается не только на неспецифическом иммунитете, но и на защите желудочно-кишечного тракта от патогенов индигенной микрофлорой, причем оба эти фактора находятся в тесной связи. Как известно, у новорожденных животных формирование нормальной микрофлоры в оптимальных условиях жизни происходит к концу первого месяца жизни, а при наличии в окружении большого количества патогенной и условно-патогенной «хлевной» микрофлоры формирование задерживается до года. Формирование неспецифического клеточного иммунитета также происходит у животных к концу второго месяца жизни. По мнению ряда исследователей, нормальная кишечная микрофлора обеспечивает целостность многих систем организма, связанных с формированием общей лимфоретикулярной иммунной системы и локального местного иммунитета слизистой кишечника, периферической иммунной системы, гормональной и эндокринной систем /3/, что является достаточным основанием для применения пробиотических препаратов. Однако применение пробиотиков не всегда сопровождается положительным эффектом. Противоречивые результаты, полученные в ряде исследований, свидетельствуют о неудачном подборе использованных для приготовления препаратов пробиотических штаммов, а также несовместимости с антимикробными препаратами.
Цель изобретения - способ, позволяющий проводить быстрый и адекватный по отношению к нокардиоформным актиномицетам скрининг (поиск) пробиотических препаратов in vivo.
Поставленная цель достигается тем, что скрининг пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов осуществляется на экспериментальной модели родококкоза - мыши, зараженной родококками, патогенными для свиней.
Родококки - быстрорастущие (срок появления видимых колоний - 1-3 сут), частично кислотоустойчивые микроорганизмы, имеющие общие антигены с микобактериями, сходный состав ГЦ и общий тип клеточной стенки, что обусловливает сопоставимую с микобактериями устойчивость к дезинфектантам. Колонии родококков растут на селективных яичных питательных средах для микобактерий. Вирулентные штаммы вызывают родококкоз у свиней и лошадей. Нами установлено, что родококкоз, обнаруженный у молодняка свиней, вызывал резкий падеж поросят в возрасте 5-12 недель с наличием выраженных легочных и кишечных поражений (гнойная бронхопневмония с абсцессами, гнойный лимфаденит, некротический энтероколит), У взрослых животных наблюдались обширные абсцессы в шейной и ягодичной областях, а также в легких, наполненные сметанообразным содержимым, окруженные фиброзной тканью, без обызвествления. В предварительных исследованиях по in vitro выявлена повышенная по сравнению с микобактериями устойчивость родококков к действию пробиотических препаратов (таблица 1).
| Таблица 1 | |||||
| Антагонистическая активность коммерческих пробиотических препаратов по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vitro | |||||
| Индикатор ные штаммы |
Индекс блокирования роста | ||||
| бактисубтил | споробактерин | окарин | бифидобактерин | сахабактисубтил | |
| М. bovis (Vallee) | 5 | 9 | 7 | 1 | 6 |
| М. tuberculosis (Academia) | 2 | 3 | 6 | 1 | 10 |
| М. avium (ГИСК) | 6 | 4 | 10 | 2 | 10 |
| М. bovis №2 | - | - | - | 3 | 3 |
| М. bovis №3 | 5 | 7 | 3 | 2 | 5 |
| М. avium №4 | 9 | 9 | 3 | 1 | 10 |
| М. avium №2 | 10 | 8 | 2 | - | 3 |
| М. vaccae №296 | 9 | 6 | 5 | 1 | 4 |
| М. vaccae №1855 | 5 | 9 | 7 | - | 6 |
| Cor. pseud. | - | - | 8 | - | - |
| R/equi №6 | 4 | 4 | 5 | 5 | 5 |
| R/egui №12 | 4 | 4 | 5 | 5 | 5 |
Способ осуществляется следующим образом.
Белых беспородных мышей массой 20-22 г заражают пероральным введением 0,1 мл суспензии двухдневной культуры родококков Rhodococcus equi, содержащей 5×107 КОЕ в 1,0 мл физиологического раствора. Сразу после заражения мышам перорально вводят пятикратно с интервалом в 24 часа пробиотический препарат. Для оценки его эффективности через 5 дней после заражения животных убивают, проводят осмотр внутренних органов, а также посев суспензий органов на плотные яичные среды. Посевы контролируют через 1-2 дня, но не позже 5 дней. При появлении колоний их подсчитывают, и мазки с колоний изучают с окраской по Цилю-Нильсену. Антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных, не получавших пробиотический препарат, к количеству колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных, получавших пробиотический препарат, а вывод об эффективности пробиотического препарата делают при показателе антагонистической активности, превышающем 3.
Сущность способа поясняется примерами.
Пример 1. Эффективность пробиотического препарата окарин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород), содержащего Escherichia coli (штаммы Г-35-1/59, Г-35-2/60, Г-35-3/61) и Enterococcus faecalis (штамм Г-35-4/), определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Животных первых двух групп заражали пероральным введением 0,1 мл суспензии двухдневной культуры родококков (R.equi), содержавшей 5×107 КОЕ в 1,0 мл физиологического раствора. Животным 1-й группы сразу же после заражения пятикратно с интервалом в 24 часа орально вводили пробиотический препарат окарин в дозе 3×105 КОЕ в 0,1 мл. Животным 2-й группы пробиотического препарата не применяли. Животных 3-й группы не заражали, они служили контролем. Через 5 дней после заражения животных всех трех групп убивали. Проводили осмотр внутренних органов (селезенки, печени, легких и почек). Из внутренних органов (селезенки, печени, легких и почек) готовили суспензию для посева. Для этого их гомогенизировали в фарфоровых ступках, деконтамировали добавлением 0,5% водного раствора препарата лесептик. Через 20 минут патологический материал отмывали дважды физиологическим раствором, осадок ресуспендировали в 1,0 мл физиологического раствора и засевали на среду Левенштейна-Йенсена. Пробирки помещали в термостат и культивировали при температурном оптимуме в течение 5 дней с последующим контролем. При появлении колоний их подсчитывали, делали мазки с выросших колоний и окрашивали их по Цилю-Нильсену. Антагонистическую активность пробиотического препарата окарин оценивали по отношению количества колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных 2-й группы, к количеству колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных 1-й группы. Результаты представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, при заражении родококками мышей, не получавших пробиотического препарата, у них развивались поражения внутренних органов, характерные для родококкоза (печень увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками; селезенка увеличена, черного цвета: легкие пятнистые с кровоизлияниями, почки кровенаполненные), при заражении мышей, получавших пробиотический препарат, внутренние органы не поражались за исключением незначительного увеличения селезенки. При посеве на плотные яичные среды суспензии органов мышей, зараженных родококками, вырастали микроорганизмы, идентифицированные по морфологическим признакам как родококки. Антагонистическая активность пробиотика проявлялась ингибирующим действием на родококки и составила 3,5.
| Таблица 2 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата окарин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | Без изменений | Увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | Без изменений |
| - селезенка | Незначительно увеличена | Увеличена, черного цвета | Без изменений |
| - легкие | Без изменений | Пятнистые с кровоизлияниями | Без изменений |
| - почки | Без изменений | Кровенаполненные | Без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 21 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,5 | - | - |
Пример 2. Эффективность пробиотического препарата бифидобактерин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород) на основе штаммов Bifidobacterium bifidum №1, 791 и ЛВА-3 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата бифидобактерин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, темно-красного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые с кровоизлияниями | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполенные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 22 | 0 |
| Морфология клеток | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,67 | - | - |
Пример 3. Эффективность пробиотического препарата сахабактисубтил (производитель) на основе штаммов Bacillus subtilis ТНП-3 и ТНП-5 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1. Доза пробиотического препарата - 1×106 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата сахабактисубтил по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, черного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые, отечные | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполненные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 3 | 11 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | |
| Антагонистическая активность | 3,67 | - | - |
Пример 4. Эффективность пробиотического препарата окарин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород), содержащего Escherichia coli (штаммы Г-35-1/59, Г-35-2/60, Г-35-3/61) и Enterococcus faecalis (штамм Г-35-4/), определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду Финн-П. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 5.
| Таблица 5 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата окарин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | Без изменений | Увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | Без изменений |
| - селезенка | Незначительно увеличена | Увеличена, черного цвета | Без изменений |
| - легкие | Без изменений | Пятнистые с кровоизлияниями | Без изменений |
| - почки | Без изменений | Кровенаполненные | Без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 21 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,5 | - | - |
Пример 5. Эффективность пробиотического препарата окарин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород), содержащего Escherichia coli (штаммы Г-35-1/59, Г-35-2/60, Г-35-3/61) и Enterococcus faecalis (штамм Г-35-4/), определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду Гельберга. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 6.
| Таблица 6 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата окарин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | Без изменений | Увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | Без изменений |
| - селезенка | Незначительно увеличена | Увеличена, черного цвета | Без изменений |
| - легкие | Без изменений | Пятнистые с кровоизлияниями | Без изменений |
| - почки | Без изменений | Кровенаполненные | Без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 21 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,57 | - | - |
Пример 6. Эффективность пробиотического препарата окарин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород), содержащего Escherichia coii (штаммы Г-35-1/59, Г-35-2/60, Г-35-3/61) и Enterococcus faecalis (штамм Г-35-4/), определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду ФАСТ-3Л. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 7.
| Таблица 7 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата окарин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | Без изменений | Увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | Без изменений |
| - селезенка | Незначительно увеличена | Увеличена, черного цвета | Без изменений |
| - легкие | Без изменений | Пятнистые с кровоизлияниями | Без изменений |
| - почки | Без изменений | Кровенаполненные | Без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 21 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,6 | - | - |
Пример 7. Эффективность пробиотического препарата бифидобактерин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород) на основе штаммов Bifidobacterium bifidum №1, 791 и ЛВА-3 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду Финн-П. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 8.
| Таблица 8 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата бифидобактерин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, темно-красного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые с кровоизлияниями | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполенные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 22 | 0 |
| Морфология клеток | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,6 | - | - |
Пример 8. Эффективность пробиотического препарата бифидобактерин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород) на основе штаммов Bifidobacterium bifidum №1, 791 и ЛВА-3 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду Гельберга. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 9.
| Таблица 9 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата бифидобактерин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, темно-красного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые с кровоизлияниями | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполенные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 22 | 0 |
| Морфология клеток | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,65 | - | - |
Пример 9. Эффективность пробиотического препарата бифидобактерин (производитель фирма ИмБио, г.Нижний Новгород) на основе штаммов Bifidobacterium bifidum №1, 791 и ЛВА-3 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду ФАСТ-3Л. Доза пробиотического препарата - 1×105 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 10.
| Таблица 10 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата бифидобактерин по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, темно-красного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые с кровоизлияниями | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполенные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 6 | 22 | 0 |
| Морфология клеток | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,57 | - |
Пример 10. Эффективность пробиотического препарата сахабактисубтил (производитель) на основе штаммов Bacillus subtilis ТНП-3 и ТНП-5 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду Финн-П. Доза пробиотического препарата - 1×106 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 11.
| Таблица 11 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата сахабакти-субтил по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, черного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые, отечные | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполненные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 3 | 11 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,65 | - | ~ |
Пример 11. Эффективность пробиотического препарата сахабактисубтил (производитель) на основе штаммов Bacillus subtilis ТНП-3 и ТНП-5 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду Гельберга. Доза пробиотического препарата - 1×106 KOE в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 12.
| Таблица 12 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата сахабактисубтил по отношению к нокардиоформным актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, черного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые, отечные | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполненные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 3 | 11 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,7 | - | - |
Пример 12. Эффективность пробиотического препарата сахабактисубтил (производитель) на основе штаммов Bacillus subtilis ТНП-3 и ТНП-5 определяли на 3 группах белых беспородных мышей массой 20-22 г. Постановка опыта и учет результатов, как в примере 1, но посев суспензий органов производили на среду ФАСТ-3Л. Доза пробиотического препарата - 1×106 КОЕ в 0,1 мл. Результаты представлены в таблице 13.
| Таблица 13 | |||
| Антагонистическая активность пробиотического препарата сахабактисубтил по отношению к нокардиоформньш актиномицетам in vivo | |||
| Показатели | Группа животных | ||
| 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | |
| Заражали родококками | Не заражали родококками | ||
| Пробиотический препарат окарин орально | Пробиотического препарата окарин не применяли | Пробиотического препарата окарин не применяли | |
| Состояние внутренних органов | |||
| - печень | без изменений | увеличена, дряблая, покрыта мелкими белыми крупинками | без изменений |
| - селезенка | без изменений | увеличена, черного цвета | без изменений |
| - легкие | без изменений | пятнистые, отечные | без изменений |
| - почки | без изменений | кровенаполненные | без изменений |
| Количество колоний (в среднем на 1 пробирку) | 3 | 11 | 0 |
| Морфология клеток | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | Мелкие, бледно-розовые палочки и синие кокки | - |
| Антагонистическая активность | 3,6 | - | - |
Клиническая эффективность коммерческих пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномецитов, прогнозируемая по результатам оценки способом в соответствии с изобретением, была подтверждена в научно-производственных опытах на молодняке сельскохозяйственных животных.
Пример 13. В условиях хозяйства, условно благополучного по туберкулезу, в котором систематически выделяли реагирующих на туберкулин ППД для млекопитающих животных, но не удавалось подтвердить туберкулез при вскрытии, формировали 4 группы клинически здоровых новорожденных телят живой массой при рождении 28-32 кг: 3 группы - опытные, 1 группа - контрольная. Телят содержали отдельно от коров и кормили в соответствии с технологией выращивания. Телятам опытных групп после выпойки первой порции молозива пробиотические препараты (окарин, бифидобактерин и сахабактисубтил) применяли в рекомендованных дозах по следующей схеме: за 20-30 минут до второго кормления один раз в сутки в течение 5 дней двумя курсами с интервалом между ними в 3 дня. В 6-месячном возрасте пробиотические препараты применяли повторно по той же схеме. Телятам контрольной группы пробиотических препаратов не применяли. По достижении телятами 8-месячного возраста проводили аллергические исследования внутрикожной пробой с туберкулином ППД для млекопитающих. Результаты представлены в таблице 14.
| Таблица 14 | ||||
| Результаты аллергических проб с ППД-туберкулином для млекопитающих | ||||
| Показатели | Группы телят | |||
| Начиная со второго кормления пятикратно с интервалом в 24 ч выпойка пробиотических препаратов | Пробиотических препаратов не применяли | |||
| 1-я - окарин | 2-я - бифидобахтеоин | 3-я - сахабактисубтил | контроль | |
| Выявлено животных, гол.(%) | - | |||
| - с положительной реакцией | - | - | - | 3 (20,0) |
| - с отрицательной реакцией | 15 (100,0) | 15 (100,0) | 15 (100,0) | 12 (80,0) |
Как видно из таблицы 14, применение пробиотических препаратов профилактировало появление аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих в 100% случаев. При вскрытии вынужденно убитых телят контрольной группы с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих установлено увеличение подчелюстных, заглоточных и мезентериальных лимфатических узлов. Бактериологическими исследованиями изолированы культуры микроорганизмов, которые идентифицированы как R.equi и М.avium.
Пример 14. В условиях свинокомплекса формировали 4 группы поросят-отъемшей живой массой 6-6,4 кг: 3 группы - опытные, 1 группа - контрольная. Поросятам опытных групп с кормом вводили пробиотические препараты окарин, бифидобактерин и сахабактисубтил в рекомендованных дозах один раз в сутки в течение 10 дней. В 2-месячном возрасте пробиотические препараты применяли повторно тремя курсами по 10 дней. Поросятам контрольной группы пробиотических препаратов не применяли. По достижении поросятами 7-месячного возраста проводили аллергические исследования внутрикожной пробой с туберкулином ППД для млекопитающих. Результаты представлены в таблице 15.
| Таблица 15 | ||||
| Результаты аллергических проб с ППД-туберкулином для млекопитающих | ||||
| Показатели | Группы поросят | |||
| Начиная со второго кормления пятикратно с интервалом в 24 ч выпойка пробиотических препаратов | Пробиотических препаратов на применяли | |||
| 1-я - окарин | 2-я - бифидобактерин | 3-я - сахабактисубтил | контроль | |
| Выявлено животных, гол.(%) | - | |||
| - с положительной реакцией | - | - | - | 10 (10,0) |
| - с отрицательной реакцией | 100 (100,0) | 100 (100,0) | 100 (100,0) | 90 (90,0) |
Как видно из таблицы 15, применение пробиотических препаратов профилактировало появление аллергических реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих в 100% случаев. При вскрытии вынужденно убитых поросят контрольной группы с положительной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих установлено увеличение подчелюстных, заглоточных и мезентериальных лимфатических узлов. Бактериологическими исследованиями изолированы культуры микроорганизмов, которые идентифицированы как R.equi и М.avium.
Проведенные исследования подтвердили, что предложенный способ впервые позволил использовать в качестве модели для отбора пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов мышей, заражая их родококками, патогенными для свиней. Эффективность способа обусловлена простотой и удобством перорального заражения мышей, что позволяет использовать их как модель при экспериментальном заражении животных нокардиоформными актиномицетами и скрининге пробиотических препаратов. Антагонистическая активность пробиотических препаратов, выявленная на мышах, зараженных родококками, патогенными для свиней, была подтверждена в условиях хозяйств на молодняке сельскохозяйственных животных.
Источники информации
1. Нокардиоподобные коринебактерии / Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. - Киев: Наук. думка, 1985. - С.5.
2. www.mirrab.
3. Ветеринария с.-х. животных. - 2006. - №6. - С.3-6.
Способ скрининга пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов, отличающийся тем, что мышей заражают пероральным введением суспензии двухдневной культуры родококков Rhodococcus equi, содержащей 5·107 КОЕ в 1,0 мл физиологического раствора, в дозе 0,1 мл, после заражения перорально пятикратно с интервалом в 24 ч вводят пробиотический препарат в дозе 1-5·105-6 КОЕ в 1,0 мл, через 5 дней после заражения мышей убивают, суспензии внутренних органов высевают на плотные яичные среды, культивируют при температурном оптимуме, через 1-2 дня, но не позже 5 дней контролируют выросшие колонии окраской по Цилю-Нильсену, антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных, не получавших пробиотический препарат, к количеству колоний родококков, выросших при посеве суспензии органов животных, получавших пробиотический препарат, а вывод об эффективности пробиотического препарата делают при показателе антагонистической активности, превышающем 3.
