Пептидоподобное соединение, обладающее противовирусной активностью, и способ его получения


 

C07K1/06 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2450806:

Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)

Заявленная группа изобретений относится к ветеринарной вирусологии и касается пептидоподобного соединения, обладающего противовирусными свойствами, а также способа его получения. Для этого осуществляют синтез при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СН2Сl2=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3×10 мл). Заявленное пептидоподобное соединение позволяет расширить арсенал противовирусных средств для лечения и профилактики вирусных заболеваний крупного рогатого скота при достоверном снижениии репродукции вируса за счет стабильности химического состава и сохранении противовирусной активности в течение 2-х лет. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к расширению спектра противовирусных препаратов для нужд ветеринарии. Изобретение относится также к области получения этого вещества.

В настоящее время известен ряд противовирусных препаратов пептидной природы для лечения вирусных инфекций человека и животных. Примерами таких препаратов могут служить смесь димеров рибонуклеазы А и лизоцина (См. патент РФ №2092183 от 10.10.1997, МПК А61К 38/57, А61К 9/02, А61К 9/09) или коммерческий препарат Аллокин-альфа - противовирусный препарат, созданный на основе биологически активных пептидов, выделенных из иммунной системы личинок падальных мух семейства Каллифорид. Главное составляющее вещество препарата - цитокиноподобный пептид аллоферон противовирусного и противоопухолевого свойства, усиливающий цитотоксическую активность имеющихся в наличии иммунных клеток человека. Несмотря на высокую противовирусную активность данных препаратов, им присущ ряд недостатков. Наиболее существенным из них является высокая стоимость получения. Недостатком этих препаратов также является то, что они легко инактивируются в силу своей белковой природы, поэтому требуют специальных условий хранения и высокой степени очистки; имеют небольшой срок хранения (до 1 года). Все это делает невозможным широкое применение данных препаратов для нужд ветеринарии.

Наиболее близким решением, принятым за прототип к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является препарат лигавирин, получаемый путем экстракции слабощелочным раствором растительного сырья (опилки, солома, лузга подсолнуха), подвергнутого предварительно частичной биодеградации и модификации ксилотрофными грибами Pleurotus ostreatus, с последующим кислотным осаждением, промывкой водой и сушкой при комнатной температуре. Лигавирин представляет собой комплексное соединение, состоящее из пептидов в количестве 12-21% (См. патент РФ №2070411 от 20.12.1996, МПК А61К 47/38, А61К 47:36, А61К 38:04, А61К 35:84).

К недостаткам данного препарата можно отнести то, что он не является гомогенным соединением. Способом его получения является микробиологическая переработка растительного сырья, без выделения конкретного вещества. Данный препарат не имеет постоянного состава (содержание пептидов 12-21%) и фиксированных противовирусных свойств.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала противовирусных средств.

Сущность изобретения заключается в том, что предложено новое пептидоподобное соединение, обладающее противовирусной активностью и отвечающее составу C32H46F12N8O10.

Сущность изобретения заключается также в том, что предложен способ получения пептидоподобного соединения, заключающийся в том, что синтез осуществляют при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СН2С12=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3×10 мл).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез

К раствору 1,12-додекандиамина (2.3 ммоль, 0.46 г) и этилдиизопропиламина (5.1 ммоль, 0.87 мл) в 10 мл этилацетата добавляли при перемешивании раствор N-гидроксисукцинимидного эфира Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина (5.1 ммоль, 2.3 г) в 5 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивали 24 ч при 22°С. Затем в реакционную смесь добавляли N,N-диметилэтилендиамин (1 ммоль, 110 мкл) и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь промывали последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл). Органический слой сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в смеси ТФУ:CH2Cl2=1:1 (5 мл) и выдерживали реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре. Растворитель и ТФУ удаляли в вакууме, остаток упаривали с этанолом (3×10 мл). Выход трифторацетата N,N'-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина 0.81 г, 37.7%.

Данные 1Н ЯМР-спектра для трифторацетата N,N'-бис-L-гистидил-1,12-додекандиамина (D2O) δ, м.д. (J/Гц): 1.61 (м, 4Н, -О-CH2(CH 2)2СН2О-); 1.71 (м, 4Н, -NH-CH2CH2CH 2O-); 2.87-3.12 (м, 4Н, His-CH-CH 2); 3.20 (м, 4Н, -NH-CH 2-); 4.03 (т, 2Н, His-CH, J=7.3); 7.27 (с, 2Н, CHIm); 8.56 (с, 2Н, CHIm). ESI-MS, m/z найдено 475.6 [М+H]+ вычислено 474.64. Элементный анализ. Найдено С 41,01; Н 4,67; F 24,80; N 11,90. C32H46F12N8O10. Вычислено С 41,29; Н 4,98; F 25,49; N 12,04.

Исходя из метода синтеза, данных элементного анализа, 1Н ЯМР и ESI - мас-спектроскопии полученному соединению была приписана структурная формула:

Полученному пептидоподобному соединению присвоено рабочее название ринумид.

Пример 2. Определение влияния условий и сроков хранения ринумида на стабильность его химического состава.

Ринумид хранили в условиях бытового холодильника при -4±2°С и при комнатной температуре 20±2°С в течение двух лет (срок наблюдения). Проводили элементный анализ препарата с периодичностью один раз в три месяца. В результате проведенных исследований не было отмечено отклонений в его составе.

Таким образом, полученный препарат стабилен (срок наблюдения 2 года), не требует особых условий хранения.

Пример 3. Оценка цитотоксичности ринумида

Цитотоксичность ринумида оценивали путем добавления его разведений в среде Игла MEM к выращенному монослою перевиваемой клеточной культуры КСТ (коронарные сосуды теленка) в лунки 96-луночного планшета (Costar), до конечных концентраций 39,06-5000,0 мкг/мл (по четыре лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 3 суток.

Токсичность препаратов оценивали по четырехкрестовой системе, анализируя морфологию клеток и целостность монослоя при микроскопировании в инвертированном микроскопе.

Таблица 1
Доза препарата Цитотоксическое действие (ЦТД)
5 мг/мл ++++
2,5 мг/мл ++++
1,25 мг/мл ++++
625,0 мкг/мл ++++
312,5мкг/мл -+-+
156,25 мкг/мл ----
78,125 мкг/мл ----
39,06 мкг/мл ----

Из данных таблицы 1 видно, что минимальная нетоксичная доза ринумида для культуры клеток КСТ составляет 156,25 мкг/мл.

Учитывая результаты определения нетоксичной дозы, рассчитали максимально переносимую концентрацию (МПК) препарата для культуры клеток КСТ, которая составила 78,125 мкг/мл. За МПК принимали 1/2 дозы, при которой отсутствовало цитопатическое действие вещества.

Пример 4. Оценка противовирусной активности ринумида в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) в условиях in vitro в культуре клеток.

Для оценки противовирусного действия препарата ринумида культуру клеток КСТ заражали вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (штамм «ВК-1») в дозе не менее 1-10 ТЦД/кл. Через 1,5 часа после заражения в лунки с культурой клеток вносили ринумид в дозе 78,0±1,0 мкг/мл (опыт) или разводящую питательную среду (контроль). Культивировали при 37°С в течение 72 часов, после чего вируссодержащую суспензию титровали для определения инфекционной активности вируса ВД-БС КРС.

Противовирусный эффект препарата рассчитывали по разнице инфекционных активностей вируса в контрольных и опытных образцах (Вирусология. Методы, под ред. Б.Мейхи, М.: «Мир», 1988) и выражали в lg снижения титров вируса (Н.Д.Львов и соавт., Вопросы вирусологии, 1986, №2). В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препарата.

Определение инфекционного титра вируса ВД-БС КРС проводили микрометодом (Вирусология. Методы, под ред. Б.Мейхи, М.: «Мир», 1988) в 96-луночных культуральных планшетах с культурой клеток КСТ с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в ТЦД50/0,1 мл (50%-ная тканевая цитопатическая доза).

Разница титра вируса в опытных и контрольных образцах более чем в 21g ТЦД50/мл свидетельствует о противовирусной активности ринумида.

В таблице 2 представлены показатели снижения инфекционной активности вируса (выраженной в lg) в контроле, где вирус репродуцировался без препарата, и в опыте, где репродукция осуществлялась в присутствии препаратов.

Таблица 2
Титр вируса (lg ТЦД50/мл)
контроль
Титр вируса (lg ТЦД50/мл)
опыт
4,83±0,07 2,75±0,12

Из данных таблицы 2 видно, что ринумид в значительной степени (на 2,08 lg ТЦД50/мл) подавляет инфекционную активность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Снижение титра вируса было достоверным (более 2 lg ТЦД50/мл) при внесении препарата через 1,5 часа после заражения культуры клеток.

Пример 5. Оценка противовирусной активности ринумида, после его хранения

Ринумид хранили в течение двух лет в условиях бытового холодильника при -4±2°С и при комнатной температуре +20±2°С в течение двух лет (срок наблюдения). С периодичностью один раз в шесть месяцев проводили оценку его противовирусной активности в отношении вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

В результате проведенных исследований ринумид показал противовирусную активность в отношении тестируемого вируса на протяжении всего срока наблюдения, вызывая снижение его активности на 2,0-2,25 lg ТЦД50/МЛ.

Таблица 3
Срок хранения, мес. Титр вируса (lg ТЦД50/мл) контроль Титр вируса (lg ТЦД50/мл) опыт
При -4±2°С При +20±2°С
6 5,08±0,14 2,92±0,07 2,83±0,07
12 5,67±0,07 3,67±0,07 3,58±0,07
18 5,5±0,12 3,5±0,12 3,42±0,07
24 5,58±0,07 3,58±0,07 3,5±0,12

Установлено, что полученное соединение обладает противовирусной активностью, которая сохраняется на протяжении двух лет (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±2°С.

Таким образом, заявляемое пептидоподобное соединение позволяет достоверно снижать репродукцию вируса ВД-БС КРС в чувствительной культуре клеток, т.е. обладает противовирусной активностью.

Полученное пептидоподобное соединение имеет стабильный химический состав, сохраняет противовирусную активность на протяжении двух лет (срок наблюдения) при режиме его хранения -4±2°С и +20±2°С.

Ринумид может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, в частности вирусом вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

1. Способ получения пептидоподобного соединения, обладающего противовирусной активностью, заключающийся в том, что синтез осуществляют при 22°С в течение 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,12-додекандиамин-этилдиизопропиламин-N-гидроксисукцинимидный эфир Nα,Nim-ди-трет-бутилоксикарбонил-L-гистидина 2.3:5.1:5.1 в этилацетате как растворителе, добавляют в реакционную смесь N,N-диметилэтилендиамин (1 моль, 110 мкл) и перемешивают ее в течение 30 мин, затем промывают последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO3 (20 мл) и водой (20 мл), удаляют растворитель в вакууме, путем растворения остатка в смеси ТФУ:СН2Сl2=1:1 (5 мл), выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой в вакууме и упаривают остаток с этанолом (3·10 мл).

2. Соединение, обладающее противовирусной активностью, полученное способом по п.1 и отвечающее составу C32H46F12N8O10.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к химии пептидов и более конкретно к новому способу получения нонапептидэтиламида формулы и промежуточным соединениям для его получения.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к новому способу получения бусерелина формулы pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C 2H5·2AcOH (I), заключающемуся в том, что синтез осуществляют путем конденсации C-концевого защищенного дипептида формулы X-pGlu-His-OH (IIa), где X - защитная группа, с N-концевым защищенным гептапептидом формулы H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 (III) и полученный N-защищенный нонапептидэтиламид формулы X-pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 (IV) обрабатывают деблокирующим агентом для удаления N-защитной группы и выделяют конечный продукт с помощью хроматографии.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биохимии, протеомике и фармакологии для экспрессии и получения сложных трансмембранных белков из бактериальных штаммов-продуцентов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных белков в Escherichia coli, и может быть использовано для синтеза паратиреоидного гормона человека (rhPTH (1-34)).
Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу хроматографической очистки циклического пептида октреотида I, и имеет своей целью разработку полупромышленного процесса очистки октреотида-сырца.
Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу хроматографической очистки циклического пептида октреотида I, и имеет своей целью разработку полупромышленного процесса очистки октреотида-сырца.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения рекомбинантного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) из культуры прокариотических клеток.
Изобретение относится к твердофазному способу синтеза пептида формулы H-D- -Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2, в котором используются и Вос-защищенные, и Fmoc-защищенные аминокислоты и смола из хлорметилированного полистирола.
Изобретение относится к области фармацевтики. .

Изобретение относится к новому клатратному комплексу -циклодекстрина с 1-{[6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-H-индол-3-ил]карбонил}-4-бензилпиперазином формулы (I): при мольном соотношении 1-{[6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-1-Н-индол-3-ил]карбонил}-4-бензилпиперазин: -циклодекстрин от 1:1 до 1:10, его способу получения и применению в качестве противовирусного средства для лечения гриппа.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, конкретно к противовирусному и интерфероногенному лекарственному средству на основе амизона. .
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения комбинированной бивалентной, культуральной, инактивированной, концентрированной, очищенной вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).
Изобретение относится к медицине, онкологии, и может быть использовано для подавления опухолевого роста. .
Наверх