Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo



Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo
Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo
Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo
Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo
Штамм вируса гриппа а/russia/01/2009-ma субтипа h1n1 для исследования лечебной и профилактической активности противовирусных препаратов in vitro и in vivo

 


Владельцы патента RU 2451072:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Штамма вируса гриппа A/Russia/01/2009-ma субтипа H1N1 предназначен для исследования эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа в экспериментах in vitro и in vivo. Штамм депонирован в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-511. Штамм адаптирован к мышам и способен вызывать летальную инфекцию у мышей, что упрощает оценку эффективности противогриппозных лекарственных препаратов. Штамм применяют при определении противогриппозной активности препаратов in vitro с использованием клеток MDCK. На основе штамма создана адекватная модель для изучения активности противовирусных препаратов против вируса гриппа субтипа H1N1 in vivo, заключающаяся в интраназальном заражении мышей линии BALB/c массой 14-16 г данным штаммом. 4 табл., 3 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа субтипа H1N1 и может быть использовано в медицинской вирусологии при изучении биологии вируса гриппа, а также при исследовании эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа.

Известен штамм A/California/04/2009 субтип H1N1 вируса гриппа (аналог), выделенный в США от ребенка с легким течением заболевания, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов в культуре клеток и на животных [1].

Однако указанный штамм A/California/04/2009 не является летальным для лабораторных мышей, вследствие чего эффективность используемых противовирусных препаратов определяют по динамике размножения вируса в легких подопытных мышей, что значительно затрудняет оценку результатов.

Известно, что многие штаммы вируса гриппа A субтипа H1N1, выделяемые от людей, не являются летальными для мышей. Поэтому для моделирования гриппозной пневмонии мышей существует необходимость их адаптации к данным хозяевам. Так, для моделирования летальной инфекции, вызванной вирусом сезонного гриппа H1N1-субтипа, используется адаптированный к мышам штамм A/Puerto Rico/8/1934 [2], который принят в качестве ближайшего аналога (прототипа). Он часто используется для экспериментальной инфекции хорьков и мышей, чтобы изучить патогенез вируса, иммунный ответ и протестировать противовирусные соединения. Штамм A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), прошедший более 100 пассажей через легкие мышей и обладающий высокой пневмовирулентностью, является наиболее близким по отношению к вариантам вируса сезонного гриппа, циркулирующим в настоящее время.

Однако указанный штамм генетически и по антигенным свойствам значительно отличается от штаммов пандемического вируса гриппа, появившихся в 2009 г., которые содержат генетический материал птичьего, человеческого и свиного вирусов гриппа [3].

Известны другие штаммы пандемического вируса гриппа, адаптированные к мышам, - A/California/04/2009-MA и A/TN/1-560/09-MA [4]. Однако дикие штаммы A/California/04/2009 и A/TN/1-560/09 были выделены в апреле 2009 г., в самом начале развития пандемии. Вследствие колоссальной изменчивости вируса гриппа уже с осени 2009 г. в мире циркулировали штаммы, отличные по молекулярно-генетическим свойствам от референс-штамма A/California/04/2009. Кроме того, оба штамма выделены в Америке. Штаммы пандемического вируса гриппа, которые были бы выделены в Российской Федерации и адаптированы к мышам, на сегодняшний день отсутствуют.

Известен штамм вируса гриппа A/Swine/1976/31(H1N1), - адаптированный к мышам вирус гриппа, выделенный от свиней [5]. Однако указанный штамм генетически и по антигенным свойствам также значительно отличается от штаммов вируса гриппа A (H1N1) 2009 г.

Поскольку штаммы пандемического вируса гриппа A (H1N1) 2009 широко распространены во всем мире и будут продолжать циркулировать наряду с вирусами сезонного гриппа [6], они имеют важное значение в эпидемиологической и клинической практике, поэтому референс-штаммы вируса гриппа 2009 г. субтипа H1N1 необходимо использовать для проверки эффективности противогриппозных препаратов, а также их комбинаций in vivo и in vitro.

Таким образом, в настоящее время в России отсутствует наиболее близкий по генетическим свойствам штамм вируса гриппа H1N1-субтипа (2009), адаптированный к мышам и доступный для моделирования летальной гриппозной инфекции с целью исследования профилактической и лечебной эффективности противовирусных препаратов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма вируса гриппа H1N1-субтипа, который обеспечивал бы более адекватное моделирование летальной инфекции, вызываемой вирусом гриппа субтипа H1N1, на мышах в экспериментах по изучению биологии вируса гриппа и оценке активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин.

Указанный технический результат достигается тем, что получен новый штамм вируса гриппа A/Russia/01/2009-ma субтип H1N1, обеспечивающий более адекватное исследование активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа in vivo и in vitro.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм A/Russia/01/2009-ma является представителем вирусов гриппа род Influenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Заявляемый штамм изначально выделен из 10-%-го гомогената ткани легкого женщины, умершей от гриппа. Выделенный штамм прошел 8 пассажей на мышах линии BALB/c, а затем 2 пассажа на клетках MDCK. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-511 (справка о депонировании прилагается).

Источник получения. Из патологического материала (легкое, трахея, бронхи), полученного от женщины, умершей от гриппозной инфекции во время пандемии 2009 г., был выделен изолят вируса гриппа субтипа H1N1, который получил название A/Russia/01/2009. Вирус был выделен на клетках MDCK на первом пассаже, гибель клеток по апоптотическому пути наблюдалась через 2-3 суток с момента инфицирования. Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами гуся. Вирус агглютинировал эритроциты человека и гуся: гемагглютинирующая активность составила 3,11±0,15 lg ГАЕ/мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 6,312±0,6 lg TCID50/мл.

Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса гриппа A осуществлялась методом ОТ-ПЦР согласно [7], а также с помощью ПЦР тест-системы «АмплиСенс Influenza virus A/Hl-swine-FL» (ФГУН ЦНИИЭ, Москва).

Заявляемый штамм эффективно культивируется на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) в титрах 6,35±0,4 lg EID50/мл и на культуре клеток MDCK - в титрах 6,875±0,45 lg TCID50/мл. Штамм вызывает заболевание с летальным исходом у мышей при интраназальном пути введения. Следует отметить стабильное, закономерное проявление клинических признаков заболевания и 100% летальность штамма для мышей в дозе 200 TCID50.

Адаптация штамма вируса гриппа A/Russia/01/2009 к мышам

Штамм A/Russia/01/2009 адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего готовили 10-2 и 10-3 разведения вируса A/Russia/01/2009 и полученными разведениями заражали две группы мышей (n=3). Далее (и в течение последующих семи пассажей) на третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на физиологическом растворе. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей неразведенными 10%-ми гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-го гомогената на клетках MDCK (табл.1).

Таблица 1
Инфекционные титры вируса A/Russia/01/2009, определенные на культуре клеток MDCK, в процессе пассирования через легкие мышей линии Balb/c
номер пассажа Титр вируса в легких мышей, lgTCID50/ml±S.D.
10-2 10-3
I 3,875±0,22 3,375±0,2c
II 3,75±0,14 3,75±0,14a
III 4,5±0,22a,b 4,25±0,14a,b
IV 5,125±0,22a,b 4,75±0,14a,b,c
V 3,75±0,14b 3,5±0,11b
VI 5,375±0,07a,b 5,375±0,11a,b
VII 5,5±0,01a,b 4,75±,22a,b,c
VIII 5,75±0,1a,b 4±0,22a,b,c
Приложение: a - статистически значимое отличие от пассажа I (P<0,05) по тесту Манна-Уитни; b - статистически значимое отличие от предыдущего пассажа (P<0,05) по тесту Манна-Уитни; с - статистически значимое отличие от того же пассажа при инфицирующей дозе 103 TCID50/мышь (P<0,05) по тесту Манна-Уитни.

Как следует из данных, представленных в таблице 1, инфекционный титр вируса A/Russia/01/2009 увеличивался от пассажа к пассажу (исключение составил только пятый пассаж вируса через легкие мышей). После того как вирус прошел восемь пассажей на мышах, был наработан его пул на клетках MDCK. Инфекционный титр пула вируса был практически равен титру исходного вируса и составил 6,875±0,45 lg TCID50/мл.

Культуральные свойства. Штамм A/Russia/01/2009-ma при культивировании на монослое клеток MDCK вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-3 сутки (температура культивирования 37°C, в атмосфере 5% CO2).

Патогенность для человека. Штаммы вируса гриппа субтипа H1N1, циркулирующие на территории Российской Федерации с 2009 г., являются патогенными для человека: летальность для человека, если учитывать только лабораторно подтвержденные случаи, составляет около 0,5% [8].

Патогенность для млекопитающих. Штамм A/Russia/01/2009-ma относится к вариантам вируса гриппа, патогенным для мышей: вызывает тяжелое заболевание и гибель мышей линии BALB/c при интраназальном инфицировании.

Биологические свойства адаптированного и исходного штаммов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Биологические характеристики штамма A/Russia/01/2009 и его адаптированного к мышам варианта
Штамм число пассажей lgГАЕ/мл±S.D. lgTCID50/мл±S.D. lgMLD50/мл±S.D. lgTCID50-lgMLD50
A/Russia/01/2009 2/MDCK 3,11±0,15 6,312±0,6 >6,312 -
A/Russia/01/2009-ma 2/MDCK, 8/BALB/с, 2/MDCK 3,7±0,15 6,875±0,45 5,6±0,09 1,275

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°C.

Для культивирования штамма на клетках MDCK используют следующие питательные среды: DMEM, MEM, среда 199, RPMI, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Пример 1. Моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c. Сравнение патогенности дикого штамма и штамма A/Russia/01/2009-ma

Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.

Пул вируса A/Russia/01/2009-ma использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. На растворе Хенкса готовили десятикратные разведения вируса в диапазоне концентраций 10-1-10-5. Под легким эфирным наркозом по 10 мышей заражали подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл. В течение 21 сут вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ую гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [9]. Рассчитанное значение MLD50 составило 5,6±0,09 lg/мл.

После определения MLD50 были проведены эксперименты по моделированию гриппозной пневмонии мышей с различной степенью летальности. Для этого мышей заражали в дозах 10 и 200 TCID50, что соответствует 0,5 и 10 MLD50. Наблюдение за мышами вели в течение 16 дней после инфицирования. Мышей взвешивали через день. Ежедневно учитывали павших животных и высчитывали среднюю продолжительность жизни мышей (MSD) по формуле: MSD=Σf(d-1)/n, где f - количество мышей, умерших на день d, а также мыши, выжившие на момент завершения эксперимента (d в этом случае - 15), n - количество мышей в группе.

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 0,5 MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости на 7-8 день после инфицирования наблюдали клинические симптомы заболевания (снижение активности, потеря аппетита, одышка, тремор, изменение качества шерсти), а также снижение массы тела на 11±7%. На 14 день после заражения две мыши погибли (MSD - 14,6 дней). Снижение массы тела прекратилось после 13-го дня наблюдения (фиг.1).

На фигуре 1 представлена динамика изменения массы тела мышей, зараженных 0,5 MLD50 и 10 MLD50

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 10 MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости первые признаки заболевания, а также снижение массы тела на 12±4% наблюдали уже на 3-4 сутки после инфицирования. Гибель мышей регистрировали, начиная с шестого дня после инфицирования. Потеря массы тела быстро прогрессировала и доходила до 35% (фиг.1). К 10 сут наблюдения все 10 мышей погибли, а средняя продолжительность жизни мышей составила 6,1±0,6 дней.

В то же время штамм A/Russia/01/2009 в эквивалентных в пересчете на TCID50 дозах не оказывал видимого негативного воздействия на мышей. Описанные выше симптомы заболевания отмечали только при заражении мышей диким штаммом в диапазоне концентраций 100-10-4. Однако на 4 сут от момента инфицирования наблюдали полное клиническое выздоровление животных.

Нами была определена кинетика репликации дикого и адаптированного штаммов в легких подопытных животных. Гомогенаты легких мышей, зараженных 10 MLD50 штамма A/Russia/01/2009-ma и 105 TCID50 штамма A/Russia/01/2009, титровали через 1, 3, 6 и 9 сут после заражения. Титр вируса A/Russia/01/2009-ma в течение всего периода наблюдения был на 1-2 lg выше титра вируса A/Russia/01/2009. Вирус A/Russia/01/2009-ma определялся в легких мышей вплоть до 9 сут. В то же время на эти же сроки нам не удалось зарегистрировать присутствия вируса A/Russia/01/2009 (таблица 3). Надо отметить, что к этому времени у мышей исчезли клинические симптомы заболевания, что, видимо, напрямую связано со снижением эффективности репликации вируса в легких животных.

Таблица 3
Репликация в легких мышей адаптированного и дикого штамма пандемического вируса гриппа 2009 г.
Название штамма Титр вируса, lgTCID50/мл±S.D.
1 сут 3 сут 6 сут 9 сут
A/Russia/01/2009-ma 6,11±0,53 5,55±0,19 5,625±0,9 2,375±1,5
A/Russia/01/2009 4,21±0,47 4,31±0,54 3,56±0,12 -

В процессе пассирования штамма A/Russia/01/2009-ma на культуре клеток MDCK его летальная доза увеличивается. Так, на клетках MDCK было проведено 5 последовательных пассажей, а пул вируса, полученный после пятого пассажа, использовали для интраназального заражения десятикратными разведениями вируса пяти групп мышей линии BALB/c (n=10). Значение MLD50 для этого пула вируса составило 4,5±0,15 lg/мл, что на 1 lg меньше, чем у исходного пула вируса, наработанного в результате двух пассажей на MDCK. В то же время инфекционный титр вируса для клеток MDCK не изменялся от пассажа к пассажу. Таким образом, несмотря на то что адаптированный вирус не перестает быть летальным для мышей, его вирулентность в отношении мышей в результате длительного пассирования на клетках MDCK снижается. Поэтому необходимо заново определять MLD50 при получении нового пула вируса и, в случае существенного снижения вирулентности вируса, проводить дополнительный пассаж вируса через легкие мышей.

Пример 2. Исследование in vitro чувствительности штамма A/Russia/01/2009-ma к современным противогриппозным препаратам

В экспериментах использовали субстанции следующих препаратов: арбидол, предоставленный фирмой «Фармстандарт», Россия (серия 2188), солянокислый римантадин (Sigma-Aldrich, США), озельтамивир (Roche, Швейцария) и рибавирин (Sigma-Aldrich, США).

Противовирусную активность исследуемых препаратов в отношении адаптированного и дикого штаммов вируса гриппа A учитывали по уровню экспрессии вирусных антигенов в тест-системе на основе иммуноферментного анализа (ИФА). За день до эксперимента по исследованию противовирусной активности лечебных препаратов клетки MDCK высевали на 96-луночные планшеты («Orange Scientific», Бельгия) из расчета 30000 клеток/лунка в 200 мкл среды для культивирования клеток.

В эксперименте использовали следующую ростовую среду (среда для размножения вируса): DMEM (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург), 0,2% БСА («Sigma-Aldrich», США), 2 мкг/мл обработанного ТРСК трипсина («Sigma-Aldrich», США), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл канамицина. Исследуемые препараты добавляли к клеткам в двукратной концентрации в 100 мкл среды для размножения вируса. К вирусному контролю добавляли по 100 мкл среды, а к контролю клеток - 200. После инкубации клеток с исследуемыми препаратами в течение 2 часов при 37°C в лунки, исключая клеточный контроль, добавляли по 100 мкл среды DMEM с вирусом. Множественность заражения составляла 0,01 и 0,1 TCID50 на клетку. Далее планшеты инкубировали в термостате с CO2 в течение 20 часов при 37°C. После инкубации клетки исследовали под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии в них цитотоксических и цитопатических изменений. Затем среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) в течение 15 минут, хорошо высушивали и затем отмывали 3 раза ФСБ с 0,05% TWEEN 20. Все дальнейшие процедуры отмывки также проводили указанным раствором. Затем к клеткам добавляли по 100 мкл раствора ФСБ с 1% фетальной сыворотки и 1% TWEEN 20, инкубировали при 37°C в течение 30 мин. После удаления раствора, к клеткам добавляли по 100 мкл моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа A (CDC, США) в разведении 1:5000. После инкубации с антителами в течение 1 часа при 37°C в лунки вносили по 100 мкл IgG кролика против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена в разведении 1:6000 (ЗАО “Биосан”, Россия). После 4-кратной отмывки лигированную пероксидазу выявляли добавлением в лунки 100 мкл ОФД (ортофенилендиамин-субстратный буфер). Реакцию учитывали по оптической плотности при 490 нм в спектрофотометре фирмы «Биорад». Каждое разведение вируса исследовали в 4-х повторах в серии из трех независимых экспериментов, для которых вычисляли среднее значение ОП-490. Процент ингибирования определяли по формуле:

100×[1-(ОП490 опыта-ОП490 клеточного контроля/ОП490 вирусного контроля-ОП490 клеточного контроля]

Препарат, подавляющий размножение вируса на 50% и более, можно расценивать как эффективный в отношении исследуемого вируса.

Как следует из данных, представленных в таблице 4, дикий штамм A/Russia/01/2009 чувствителен ко всем современным противогриппозным лекарственным препаратам, за исключением римантадина. Адаптированный штамм чувствителен к арбидолу, виразолу, римантадину, озельтамивиру. Римантадин также подавляет репликацию вируса при обеих множественностях заражения, однако чувствительность к нему существенно снижена. В концентрации 1 мкг/мл он не эффективен вовсе, и даже при увеличении концентрации препарата до 10 мкг/мл процент подавления репродукции вируса не превышает 50% (данные не представлены). В то же время другие противогриппозные препараты подавляют репликацию вируса на 66-100% в зависимости от множественности заражения.

Результаты, полученные в экспериментах in vitro, подтверждаются данными молекулярно-генетического анализа. В 31-м положении белка M2 аминокислота серии замещена аспарагином. Эта мутация является молекулярным маркером резистентности вируса гриппа к препаратам адамантанового ряда. И хотя вирус не утратил полностью чувствительность к данному препарату, как показано в описанном нами эксперименте, при использовании нетоксичных для клеток концентраций препарата нам не удалось на 70-100% подавить вирусопродукцию. Молекулярно-генетический анализ генов нейраминидазы и гемагглютинина показал отсутствие мутаций, ответственных за развитие резистентности к ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.

Таким образом, в тесте in vitro все разрешенные на сегодняшний день к применению противогриппозные препараты в различной степени способны подавлять репродукцию штамма A/Russia/01/2009-ma.

Таблица 4
Действие противогриппозных препаратов на репродукцию штаммов вируса гриппа A/Russia/01/2009 и A/Russia/01/2009-ma в культуре клеток MDCK
Название штамма Процент подавления вирусной репродукции, %, m±S.D.
виразол, 10 мкг/мл арбидол, 10 мкг/мл римантадин, 5 мкг/мл озельтамивир, 0,001 мкг/мл озельтамивир, 10 мкг/мл
0,1 TCID 50/кл 1 TCID 50/кл 0,1 TCID 50/кл 1 TCID 50/кл 0,1 TCID 50/кл 1 TCID 50/кл 0,1 TCID 50/кл 1 TCID 50/кл 0,1 TCID 50/кл 1 TCID 50/кл
A/Russia/01/2009 100±6,2 85±12,6 100±6,4 88±10,6 36±12,7 22±8,1 85±5,4 65±12,8 87±12,5 70±7,9
A/Russia/01/2009-ma 100±3,1 87±15,1 83±18,1 54±13,9 44±12 39,5±13,4 69±10,7 55±7,8 89±11,5 66±11,5

Поскольку A/Russia/01/2009-ma является чувствительным к озельтамивиру, который даже в конценрации 0,001 мкг/мл существенно угнетает репликацию вируса, а также к арбидолу, и не содержит мутаций, отвечающих за устойчивость к данным препаратам, штамм можно использовать в качестве референс-штамма (положительный контроль) при мониторинге чувствительности к озельтамивиру и арбидолу вновь выделенных штаммов вируса гриппа.

Пример 3. Использование штамма A/Russia/01/2009-ma для моделирования летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c при оценке эффективности лечебной схемы введения α-интерферона

Предварительно взвешенных мышей (самки линии BALB/c, средний вес 12,5±2 г) инфицировали интраназально под легким эфирным наркозом вирусом гриппа A/Russia/01/2009-ma. Доза вируса составляла 10MLD50 в 50 мкл.

Лечебная схема заключалась в следующем: интерферон («Вектор-Медика», Россия) в дозе 104, 105 и 106 ЕД/кг/сут вводили за 24 часа до инфицирования, за 1 час до инфицирования и далее - через каждые 24 часа после инфицирования в течение 4 дней. Препарат вводили внутримышечно в объеме 100 мкл. В каждой опытной группе и в группах контроля было по 10 животных. Использовали следующие контроли: 1) вирусный контроль (мыши, зараженные вирусом в дозе 10 MLD50 и не леченые препаратом); 2) контроль токсичности интерферона (мыши, которым в те же сроки, что и опытным животным, вводили 106 ЕД/кг/сут интерферона); 3) интактные мыши. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение в течение 16 дней. Химиотерапевтическую активность соединений на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защиты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней продолжительности жизни и уменьшение снижения веса в группах животных, леченных препаратом по сравнению с контрольной группой. Взвешивание мышей проводили на 2, 3, 4, 5 сут после инфицирования, а далее - через день. Уменьшение или увеличение массы тела животных рассчитывали отдельно для каждой мыши и выражали в процентах. При этом за 100% принималась масса животного перед инфицированием. Среднее уменьшение или увеличение массы тела животных представляет собой среднее арифметическое процента уменьшения или увеличения веса животных в исследуемой группе. Для определения статистической достоверности различий между группами применяли критерий Манна-Уитни. Расчет проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0. Значение p<0,05 расценивали как статистически значимое.

Данные по средней продолжительности жизни, а также по изменению массы тела мышей, зараженных вирусом A/Russia/01/2009-ma и леченных интерфероном, представлены на фиг.2 и 3. В группе вирусного контроля (мыши, зараженные вирусом в дозе 10 MLD50 и не леченые препаратом) все мыши погибли в течение 9 дней после инфицирования (MSD - 6,1 день). Интерферон в дозе 104 и 106 ЕД/кг/сут не влиял на продолжительность жизни животных, а в дозе 105 ЕД/кг/сут достоверно увеличивал среднюю продолжительность жизни мышей по сравнению с контролем до 9,8 дней. Кроме того, 20% мышей, леченных интерфероном, выздоровели после заражения 10 MLD50.

На фигуре 2 представлена диаграмма средней продолжительности жизни мышей, зараженных 10 MLD50 вируса A/Russia/01/2009-ma (H1N1) и леченных α-интерфероном. * - достоверность отличия с группой вирусного контроля (p<0,05)

Потеря массы тела животным является одним из клинических признаков проявления гриппозной пневмонии, который можно выразить количественно. Большее снижение массы животного свидетельствует о более тяжелом протекании заболевания. Снижение массы тела мышей в группе вирусного контроля достигало 35%. Нужно отметить, что даже дозы интерферона, менее эффективно защищавшие мышей от летальной гриппозной инфекции, уменьшали потерю массы тела животных по сравнению с контролем (p<0,05). А в группе животных, леченных интерфероном в дозе 105 ЕД/кг/сут, максимальное снижение массы тела в среднем не превышало 17%.

На фигуре 3 представлен график изменения массы тела животных, зараженных вирусом A/Russia/01/2009-ma и леченных интерфероном по лечебной схеме. Данные представлены как m±S.D. По оси X - дни после инфицирования.

Таким образом, при помощи модели гриппозной пневмонии мышей, созданной с использованием адаптированного штамма A/Russia/01/2009-ma, можно осуществлять более адекватную оценку эффективности противогриппозных лекарственных препаратов in vivo.

Штамм вируса гриппа A/Russia/01/2009-ma субтип H1N1 для исследования активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа in vivo и in vitro, депонированный в Коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером V-511.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к новому комплексному антигену вируса кори для использования в качестве компонента иммуноферментной диагностической тест-системы и может быть использовано в медицинской вирусологии и микробиологии.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к способу получения гриппозной вакцины. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и микробиологии, а именно к штамму вируса гриппа H13N8 - субтипа. .

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается реассортантного диагностического штамма RN1/09-swine A(H7N1). .
Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и касается способа получения биологически активного комплекса. .
Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии. .
Наверх