Производное индола, проявляющее антигипертензивное действие, и способ его получения
Владельцы патента RU 2451670:
Общество с ограниченной ответственностью "Уникорм" (RU)
Изобретение относится к новому соединению (2Е)-2-[(2-Этокси-1H-индол-3-ил)метилен]гидразинкарбоксимидамида гидрохлориду формулы:
который проявляет антигипертензивное и антигипоксическое действие. Описан способ его получения. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 табл., 8 пр.
Изобретение относится к области химии, медицины и фармакологии.
Одним из важных факторов в развитии гипертензии считается нейрогенный механизм в повышении давления. Поскольку реализация психоэмоционального перенапряжения происходит в основном через увеличение продукции и выброс катехоламинов, тесно связанной с ней можно считать и концепцию повышения тонуса симпатической нервной системы как ведущего механизма развития артериальной гипертензии (АГ). Убедительным подтверждением этой теории является успех β-адреноблокаторов, доказавших свою эффективность в течение длительного времени. Однако однозначно говорить о том, что простое повышение активности симпатической нервной системы является причиной гипертензии нельзя, хотя бы потому, что уровень катехоламинов в плазме крови увеличен только у 40% больных АГ и в большей степени зависит от возраста [1].
В центральной нервной системе также имеются мощные депрессорные механизмы. К настоящему времени достаточно хорошо изучены гипотензивные эффекты, обусловленные стимуляцией имидазолиновых, дофаминергических, серотониновых и α2-адренорецепторов. Сюда же могут быть отнесены и мозговые натрийуретические пептиды [2].
Гипертензия является симптомом, связанным с различными другими нарушениями органов или систем, такими как стеноз почечной артерии феохромоцитома. Из уровня техники известны производные индола, которые могут применяться при гипертензии.
В частности, известны гидразиды индолкарбоновой кислоты [10]
Однако они проявляют свойства ингибиторов гликогенфосфорилазы и таким образом действуют опосредованно при определенных нарушениях.
Важным нейромедиатором, регулирующим сосудистый тонус, является оксид азота (NO). Источником NO в центральной и периферической нервной системе являются неадренергические - нехолинергические нервы и глутаматные нейроны, а также эндотелициты сосудов, клетки микроглии и астроциты. NO, продуцируемый в мозге, является одним из важнейших рычагов, с помощью которых нервная система управляет тонусом сосудов, снабжающих кровью все системы организма. Этот рычаг может действовать и через систему трансмиссий, модулируя, например, взаимоотношения в системе гипоталамус-эпифиз-надпочечники или прямо стимулируя высвобождение вазопрессина [2, 3].
С тех пор как был обнаружен эндогенный синтез NO, ведется изучение его роли в формировании артериального давления. Известно, что дисфункция эндотелия сосудов, которая сопровождает такие заболевания, как гипертензия [4], идиопатическая гипертензия [5] диабет I и II типа, атеросклероз, сердечная недостаточность, хроническая почечная недостаточность, характеризуется уменьшением эндотелий-зависимого расслабления сосудов, а следовательно, тесно связана с нарушением NO-цГМФ-зависимого пути. Основным акцептором NO в гладкомышечной клетке является фермент - растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) [6]. При активации рГЦ концентрация циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в клетке нарастает, что приводит к расслаблению гладкомышечной стенки сосуда [7]. В настоящее время идет поиск веществ, способных активировать цГМФ-зависимый путь расслабления сосудов. Указанными свойствами обладают давно известный антигипертензивный препарат гуанобенз, нитроглицерин, в клиническую практику вошел препарат молсидомин, который является производным сиднонимина.
Целью и основной задачей предлагаемого изобретения является изыскание новых типов гетероциклических систем, способных оказывать депрессорное действие на сосуды по механизму действия, обусловленному генерацией NO и, таким образом, эффективных при гипертензии.
Задача решается новым соединением - производным индола, представляющим собой (2Е)-2-[(2-этокси-1H-индол-3-ил)метилен]гидразин-карбоксимидамида гидрохлорид (соединение I) формулы I.
Соединение I проявляет антигипертензивное и антигипоксическое действие и может найти применение для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Способ получения соединения I заключается в том, что борфторид лактимного эфира оксиндола (II)
путем добавления к смеси N,N-диметилформамида (ДМФА) и оксихлорида фосфора (POCl3) преобразуют в соединение формулы (III)
смесь полученного соединения (III) и карбоната аминогуанидина кипятят в среде этанола (абсолютный спирт), фильтруют, упаривают, добавляют раствор натрия гидрооксида, полученную реакционную массу экстрагируют этилацетатом, отделяют органический слой, упаривают, выделяют целевой продукт добавлением к остатку этилацетата в присутствии хлористоводородной кислоты.
Возможность осуществления изобретения подтверждается ниже представленными примерами.
Пример 1
Синтез заявляемого соединения I реализован из описанного ранее борфторида лактимного эфира оксиндола (II).
К 66 мл ДМФА при 6-90°C при перемешивании прибавляют по каплям 7 мл POCl3 и далее при 100°C порциями прибавляют 3,94 г II, перемешивают 2 часа, отфильтровывают 3,42 г III (выход 86%). Смесь 10,75 г III и 7,52 г карбоната аминогуанидина кипятят 3,5 часа в 290 мл абсолютного спирта, добавляют еще 0,58 г карбоната аминогуанидина, кипятят еще 2,5 часа, фильтруют, упаривают, прибавляют 300 мл воды и 16,5 мл 40%-ного раствора NaOH; полученную массу экстрагируют этилацетатом, отделяют органический слой. Этилацетат упаривают, к остатку добавляют 200 мл этилацетата и прибавляют по каплям 12 мл 15%-ного раствора HCl в этилацетате, получают 10,02 г I (выход 84%), т.пл. 179-1840 (ацетонитрил). Масс-спектр М+=245; Спектр 1Н ЯМР (d6-ДМСО) δ мд: 1,45, 4,41 (Et), 7,03, 7,25, 8,02 (аром. протоны), 8,22 (с. CH), 7,21, 11,57, 11,84 (уш. с., 6H, амино- и имино-группы).
Пример 2
Изучение влияния полученного соединения на системное артериальное давление (АД) в острых опытах на наркотизированных животных
1. Влияние на АД у нормотензивных животных
Опыты проведены на белых беспородных крысах-самцах массой 250-270 г с исходным АД, равным 140±25 мм рт.ст.
Регистрацию АД осуществляли с помощью системы MacLab-400 ADInstruments (Австралия), состоящей из датчика давления Statcham, блока усилителя Bridge Amplifeir и АЦП MacLab-400, соединенных с компьютером. Сигнал, обработанный АЦП и записанный на компьютер с частотой 517 Гц, обсчитывали с помощью программы Chart v. 4.2.3.
Использован метод прямой регистрации АД в левой общей сонной артерии у наркотизированных уретаном (1,5 г/кг внутрибрюшинно) крыс. Соединение I вводили внутривенно в дозах 5,1 и 0,5 мг/кг, составляющих 1/10, 2/100 и 1/100 от ЛД50, рассчитанной при внутривенном введении. По результатам исследования АД определяли среднеэффективную дозу - ЭД50. В качестве препаратов сравнения использовали в терапевтических дозах гипотензивные препараты гуанобенз и изосорбид-5-мононитрат.
2. Влияние на АД у гипертензивных животных
Использована модель гипертензии, вызываемая введением ингибитора NO-синтазы. Гипертензию вызывали по методу [7].
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах массой тела 120-140 г с исходным АД, равным 120-130 мм рт.ст. Подопытным животным в течение 21 дня внутрь в желудок вводили 1% раствор ингибитора NO-синтазы (нитро-L-аригинин) из расчета 3,0 мг на животное в день. Через 3 недели у животных наступало устойчивое повышение АД до 180-185 мм рт.ст.
АД измеряли при прямой регистрации в левой общей сонной артерии у наркотизированных уретаном (1,5 г/кг внутрибрюшинно) крыс. Соединение I и препараты сравнения гуанобенз и изосорбид-5-моногидрат вводили по той же схеме, как и нормотензивным животным.
Результаты исследования
Как видно из результатов исследования (Табл.1), соединение I снижает системное АД у нормальных животных и животных с экспериментальной гипертензией, вызывая гипотензивный эффект, сходный с таковым у гипотензивных лекарственных препаратов.
Соединение I при внутривенном введении снижает АД в дозах 0,5, 1,0 и 5,0 мг/кг и имеет короткий период действия. Как было показано в модельных экспериментах по высвобождению NO, по механизму действия данное соединение является донором оксида азота.
| Таблица 1 | |||
| Антигипертензивный эффект соединения I в сравнении с другими гипотензивными препаратами в экспериментах на нормотензивных крысах и крысах с гипертензией, вызванной N-нитро-l-аргинином | |||
| Исследуемые препараты и соединения | Дозы мг/кг, в/в | Снижение системного АД Δ М±m мм рт.ст | |
| Нормотензивные крысы | Гипертензивные крысы | ||
| Соединение I | 0,5 | 8,7±0,5 | 12,6±0,4 |
| Соединение I | 1,0 | 13,3±0,4 | 14,7±0,4 |
| Соединение I | 5,0 | 17,3±0,4 | 17,3±0,4 |
| Гуанобенз | 5,0 | - | 18,0±0,1 |
| Изосорбид-5-мононитрат | 10,0 | 18,0±0,7 | 22,5±0,5 |
Пример 3
Изучение влияния на системное артериальное давление (АД) в острых опытах при введении бодрствующим животным
Исследования проводились на самцах крыс линий Wistar массой 350-400 г, с неограниченным доступом в воде и корму. С началом эксперимента после вживления катетеров животных рассаживали по отдельным клеткам, чтобы избежать повреждения катетеров соседями по клетке.
За 1 сутки до эксперимента под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг, 20 мг/мл, в/б) проводили операцию по вживлению сосудистых катетеров (Мурашев А.Н и др., 1992 «Руководство по экспериментальной физиологии кровообращения»).
Животным для измерения гемодинамики катетеризовали брюшную аорту через бедренную артерию с помощью спаянных полиэтиленовых трубок РЕ10 и РЕ50, внутренний/наружный диаметр которых составил 0,28/0,61 и 0,58/0,96 мм соответственно. Введение препаратов производилось через венозный бедренный катетер, состоящий из спаянных отрезков трубок РЕ10 и РЕ50, длиной 16-17 и 5-6 см соответственно. Для регистрации системного артериального давления катетер имплантировался в левую бедренную артерию на глубину 4-5 см. Для введения веществ - в левую бедренную вену на глубину 3-4 см.
В конце операции наружные концы катетеров выводились под кожей в межлопаточную область и закрепляли там с помощью ниток. Для предотвращения необратимого тромбообразования перед операцией и после нее катетеры промывали физиологическим раствором с растворенным в нем гепарином. Периферические концы катетеров закрывали подходящими по диаметру отрезками лески из пластмассы. Раны зашивали и дезинфицировали. Перед началом эксперимента катетеры также промывались раствором гепарина (100 М.Е./мл).
На следующий день после вживления катетеров у крыс измеряли системное артериальное давление (АДср). Бодрствующим животным внутривенно вводили неселективный ингибитор NO-синтаз L-NAME (L-нитроаргинин метиловый эфир) в дозе 5 мг/кг постепенно в течение всего эксперимента со скоростью 1,5 дозы/ч и через 20 минут соединение I. Контрольной группе вводился раствор нитроглицерина в дозе 1 мкг/кг.
Результаты исследования
Как показали исследования (Табл. 2), исходный уровень среднего артериального давления в группе крыс составил 109 и 111 мм рт.ст. После первого введения L-NAME в дозе 5 мг/кг среднее АД в группах - 148 и 159 мм рт.ст. Изменение среднего АД в ответ на введение L-NAME в контрольной группе составило 39 мм рт.ст, в опытной - 48 мм рт.ст. Различия в реакции на L-NAME статистически не значимы.
Введение на фоне L-NAME нитроглицерина (0,1 мг/кг) привело к значительному депрессорному эффекту, изменение среднего АД составило 24,7 мм рт.ст. Соединение I (0,5 мг/кг), введенное на фоне L-NAME, оказывало депрессорное действие на гемодинамику, изменение среднего АД составило 19 мм рт.ст.
Таким образом, соединение I обладает антигипертензивным эффектом на бодрствующих животных в условиях экспериментальной гипертензии.
| Таблица 2 | ||
| Антигипертензивный эффект соединения I в экспериментах на бодрствующих крысах с гипертензией, вызванной L-NAME | ||
| Препараты | Снижение системного АД, М±m мм рт.ст. | |
| Средние значения АД n=5 | Δ Изменение среднего АД n=6 | |
| Исходный уровень АД | 109±3,2 | - |
| 148,5±5,28* | 24,7±1,08 | |
| НГ, 0,1 мг/кг, в/в + L-NAME | 123,8±5,97 | - |
| Исходный уровень АД | 111,2±2,5 | - |
| L-NAME | 159,5±4,4* | 19±1,63 |
| Соед. I, 0,5 мг/кг, в/в + L-NAME | 140,5±5,26* | - |
| Примечание: * - различия с исходным уровнем достоверны при р<0,05. | ||
| НГ - нитроглицерин, L-NAME - L-нитроаргинин метиловый эфир. |
Пример 4.
Изучение влияния соединения I на системное артериальное давление (АД) при хроническом введении бодрствующим животным
В исследовании использовали 3 группы половозрелых крыс линии Wistar обоего пола массой 300-350 г. За сутки до начала эксперимента животным вживляли катетеры в бедренную вену и артерию для измерения системного артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС). Регистрацию проводили с помощью АЦП на компьютере.
Результаты представлены в виде изменения АД и ЧСС в норме и реакции этих показателей на внутривенное введение исследуемых препаратов. Кроме того, подсчитывали коэффициент барорефлекса (отношение изменения ЧСС к изменению АД) на внутривенное введение исследуемых препаратов.
Результаты исследования.
Как показали исследования (Табл.3), в группе животных с соединением I (10 мг/кг) наблюдали достоверное снижение уровня САД на 3-й день эксперимента - на 7,5 мм рт.ст., а на 7-й - на 14 мм рт.ст. При этом ЧСС достоверно повышалось на 3-й день - на 42 уд/мин, а на 7-й - на 68 уд/мин.
В группе с соединением I (20 мг/кг) реакция САД достоверно снижалась в 1-й день на 7,3 мм рт.ст., на 3-й день на 30,8 мм рт.ст., на 7-й на 28 мм рт.ст. Однако ЧСС в этой группе достоверно повышалась только на 1-й день введения препарата.
В группе животных, хронически в течение 7 дней принимавших нитроглицерин в дозе 10 мкг/кг, достоверных изменений САД в ходе всего эксперимента не наблюдалось, ЧСС снижалась на 70-80 уд/мин.
Таким образом, хроническое введение соединения I в течение 7 дней приводит к достоверному снижению САД у нормотензивных животных. В группе животных, принимавших препарат в дозе 10 мг/кг, наблюдали достоверное снижение уровня САД на 3-й день эксперимента на 7,5 мм рт.ст., а на 7-й - на 14 мм рт.ст. В группе животных, принимавших препарат в дозе 20 мг/кг, снижение САД наблюдалось уже в 1-й день на 7,3 мм рт.ст., на 3-й день на 30,8 мм рт.ст., а на 7-й на 28 мм рт.ст. Препарат сравнения - нитроглицерин не вызывал достоверных изменений САД при хроническом применении в течение 7 дней, снижая частоту сердечных сокращений.
Оценка изменения барорефлекторной регуляции сердечно-сосудистой системы (показатель ЧСС) в ходе хронического приема исследуемых препаратов свидетельствует о значительном увеличении коэффициента барорефлекса на нитроглицерин в 1, 3 и 7 день исследования. В то время как при приеме препарата нитроглицерин в дозе 10 мг/кг коэффициент барорефлекса в ходе всего эксперимента достоверно не изменялся.
| Таблица 3 | |||||
| Влияние соединения I и нитроглицерина на показатели АД и ЧСС экспериментальных животных в течение эксперимента | |||||
| Препараты | Параметры | Динамика изменений САД и ЧСС | |||
| Исходный | 1 день | 3 день | 7 день | ||
| Соед. I - 10 мг/кг | САД | 115±3,1 | 118±0,9 | 107,5±2,2* | 101,2±2,7* |
| ЧСС | 344±20,3 | 354±18,2 | 385,9±11* | 411,9±4,7* | |
| Соед. 1-20 мг/кг | САД | 112±3,2 | 104,7±4,1* | 81,2±1,1* | 84±2,6* |
| ЧСС | 352±18 | 373±5,6* | 356±14 | 355,4±11,2 | |
| НГ - 10 мкг/кг | САД | 113±2,1 | 112,2±0,7 | 110,6±0,1 | 112,8±0,7 |
| ЧСС | 392±6,2 | 321,5±2,7* | 310,7±6,1* | 356,9±4,4* | |
| Примечание: * - различия с исходным уровнем достоверны при p<0,05. |
Пример 5
Исследование влияния соединения I на тонус изолированных перфузируемых сосудов in vitro
Методика
Эксперименты проведены на сосудах большого круга кровообращения, выделенных у декапитированных животных. Выделяли вентральную хвостовую артерию (arteria caudalis ventralis), помещали ее в перфузионную камеру объемом 10 мл с раствором Кребса-Хенселяйта (состав в мМ: NaCl - 118, KCl - 4.7, CaCl2 - 3.3, MgSO4 - 2.4, KH2PO4 - 1.18, глюкоза - 5.05, NaHCO3 - 24.9; pH 7.4). Раствор аэрировали карбогеном (5% CO2, 95% O2) в течение 20 минут перед опытом; температуру раствора поддерживали на уровне 37-37,5°C.
Установка для перфузии состояла из системы насосов, камеры для перфузии сосуда, манометра, тензодатчика и аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) (рис.2). Обработанный АЦП сигнал записывали на компьютере с частотой оцифровки 16 Гц. Сосуды перфузировали с постоянным расходом, который составлял 2 мл/мин для внутреннего протока и 4 мл/мин для внешнего протока. О реакции сосуда судили по изменению перфузионного давления.
Констрикторную реакцию сосуда вызывали перфузией α-адреномиметика фенилэфрина в концентрации 5·10-6 М (используемые концентрации NO-донора: 1·10-8 М, 1·10-7 М, 1·10-6 М, 1·10-5 М, 1·10-4 М). Тонус сосуда, создаваемый фенилэфрином, принят за 100%.
Обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Статистический анализ результатов проводили, используя непараметрические критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллеса ANOVA. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования.
Изучение дозозависимого расслабления изолированных перфузируемых сегментов сосудов на исследуемое соединение I проводили на фоне тонуса, создаваемого перфузией 5·10-6 М раствора фенилэфрина.
Добавление соединения I в концентрациях 1·10-8-1·10-7 М вызывало зависимое от концентрации уменьшение сосудистого тонуса, реакция составила в среднем 46,2%. При концентрации NO-донора 1·10-4 М расслабление хвостовых артерий максимально - полностью снимается констрикторная реакция, создаваемая фенилэфрином. Исходя из кривой дозозависимости ED50 соединения I должна находиться в диапазоне концентраций 1·10-6-1·10-5 М.
Добавление к раствору фенилэфрина препарата сравнения нитроглицерина в тех же концентрациях, в которых вводили исследуемый препарат (1·10-8-1·10-4 М) вызывает дозозависимое расслабление изолированных перфузируемых сосудов. При концентрации нитроглицерина 1·10-4 М расслабление хвостовых артерий достигает в среднем 54,5%.
При сравнении полученных кривых дозозависимости соединения I с аналогичными кривыми препарата сравнения нитроглицерина были получены достоверные различия для концентраций 1·10-5 М и 1·10-4 М (p<0,01).
Таким образом, соединение I обладает дозозависимым вазорелаксирующим действием на тонус изолированных перфузируемых сосудов (хвостовая артерия крысы), создаваемый агонистом альфа-1 адренорецепторов - фенилэфрином.
Пример 6
Исследование острой токсичности соединения I
Опыты проведены на мышах-самцах массой 18-20 г. Соединение I растворяли в воде и вводили разными способами (внутривенно, внутрибрюшинно, внутрь). Каждую дозу вводили десяти животным. Наблюдали за поведением и состоянием животных в течение 5 дней. Величину ЛД50 рассчитывали по методу Кербера (М.Л.Беленький, 1959).
При расчете величины ЛД50 для соединения I при разных способах введения получены следующие результаты:
ЛД50 при однократном введении внутрь - 450 мг/кг,
ЛД50 при внутривенном введении - 45 мг/кг,
ЛД50 при внутрибрюшинном введении - 50 мг/кг.
По классификации Hodge et Sterner, а также по классификации К.К.Сидорова, представленной в книге Саноцкого И.В., 1997, соединение I относится к умеренно токсичным соединениям.
Пример 6
Исследование антигипоксических свойств соединения I
Одной из главных причин гипоксии является ишемия сосудов и нарушение метаболических процессов в тканях, поэтому антигипоксические свойства имеют большое значение для лечения сердечно-сосудистых патологий.
Методы исследования
Фармакологическое исследование антигипоксических свойств соединения I проводили по методике, описанной H.G.Vogel [11].
1. Модель нормобарической гипоксии с гиперкапнией.
Нормобарическая гипоксия с гиперкапнией возникает из-за понижения содержания кислорода в крови, связанного с убылью кислорода в воздухе при нормальном атмосферном давлении в условиях помещения животных в герметически закрытый сосуд. Опыты проведены на белых беспородных мышах-самцах массой 20-22 г; в каждой группе использовали по 10 животных. Животных помещали по одному в замкнутый сосуд объемом 80,0 см3. О наличии у исследуемого соединения I антигипоксической активности судили по изменению времени до наступления апноэ у животных в условиях гипоксии. Исследуемое соединение вводили внутрь однократно за час до тестирования в дозах 25,0 и 50,0 мг/кг, что соответствует 1/20 и 1/10 ЛД50.
Результаты статистически обработаны с использованием t-критерия Стьюдента.
2. Модель гемической гипоксии.
Опыты проведены на белых беспородных мышах-самцах массой 20-22 г; в каждой группе использовали по 10 животных. Гемическую гипоксию вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия в дозе 400 мг/кг. Показателем антигипоксической активности являлось изменение времени жизни животных в условиях острой нитритной интоксикации. Исследуемые соединения вводили однократно за час до тестирования, при дозе 25,0 и 50,0 мг/кг внутрь, что соответствует 1/20 и 1/10 ЛД50.
Результаты обработаны статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Исследование показало, что соединение I при введении внутрь на модели гемической гипоксии обладает антигипоксическими свойствами, более выраженными в дозе 50,0 мг/кг.
| Таблица 4 | |||
| Влияние соединения I на продолжительность жизни мышей при экспериментальной гипоксии | |||
| Модель гипоксии | Доза исследуемого соединения | Среднее время жизни животных (М±m) | Относительная активность в %, в сравнении с контролем |
| Нормобарическая гипоксия с гиперкапнией | 25,0 мг/кг | 858,0±28,0 | 103,0 |
| 50,0 мг/кг | 895,0±36,0* | 107,0* | |
| Контроль | 834,0±21,6 | 100,0 | |
| Гемическая гипоксия | 25,0 мг/кг | 895,0±16,8* | 107,0* |
| 50,0 мг/кг | 934,0±24,0* | 112,0* | |
| Контроль | 836,0±7,2 | 100,0 | |
| Примечание: * - различия с контролем достоверны при p<0,05. |
Пример 7
Методика определения содержания нитрита, образующегося при окислении синтезированного соединения I
Окисление. К точной навеске вещества, составляющей количество, обеспечивающее концентрацию около 10-3 М в 5 мл раствора, добавляют 2,5 мл раствора м-хлор-надбензойной кислоты, полученной растворением 0,0932 г соединения с концентрацией 50% в 13,5 мл этилового спирта (≈0,02 М), 1 мл фосфатного буферного раствора с рН 9,6 и 1,5 мл воды. Сосуды с полученными суспензиями встряхивают до растворения твердой фазы (в течение не более 2 мин) и оставляют на четверо суток.
В полученном растворе определяют содержание NO2 - по методу Грисса (по образованию азокрасителя в его присутствии). Раствор для определения получают, приливая в мерную колбу объемом 5 мл 0,04 мл раствора сульфаниловой кислоты (0,22 г в 25 мл воды), 0,25 мл 2 N раствора HCl и 3,5 мл воды. В этот раствор добавляют 0,5 мл восстановленного раствора. Через 15 мин добавляют 0,1 мл N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорида (0,03 г в 10 мл воды) и доводят объем раствора до метки. Параллельно проводят реакцию с добавкой к пробе восстановленного раствора 0,2 мл стандартного раствора NaNO2 с концентрацией 10-4 М. Оптическую плотность измеряют при длине волны 542 нм. Расчет концентрации NO2 - в восстановленном растворе осуществляется по методу добавок. Выход NO2 - рассчитывается по формуле
X=0,4(D1-Dхолост)/(D1-D2),
где Х - выход NO2 -,
D1 - оптическая плотность раствора без добавки NO2 -,
D2 - оптическая плотность раствора с добавкой NO2 -,
Dхолост - оптическая плотность раствора, полученного в результате холостого опыта (в отсутствие исследуемого вещества).
Полученное значение образующегося в этих условиях NO равно 11%.
Пример 8
Получение комплекса с соединением I и изучение влияния соединения I на системное артериальное давление (АД) при хроническом введении бодрствующим животным
Соединение I может образовывать комплексы с веществами, обладающими следующими свойствами:
- имеющими торобразную или иную сходную с ней структуру либо способность образовывать торообразные структуры, у которых внешняя поверхность гидрофильна, а внутренняя липофильна;
- способными образовывать с гидрофильной стороны комплексообразователя сравнительно непрочные Ван-дер-Ваальсовы или водородные связи с соединением I.
Например, такими свойствами обладают циклодекстрины и глицирризиновая кислота (ГК).
1. Получение комплексных соединений
А) 5 г γ-циклодекстрина растворяют в 50 мл дистиллированной воды. В полученном растворе при температуре 35-40°C под действием ультразвука растворяют 250 мг соединения I. Воду удаляют лиофилизацией и остаток сушат в вакууме 1 мм рт.ст. при температуре 20°C. Получают 5,2-5,3 г комплексного соединения с содержанием основного вещества около 5%.
Об образовании комплекса свидетельствует смещение сигналов ароматических протонов в спектрах 1H ЯМР на 0,15-0,2 м.д.
Б) 7,5 г глицирризиновой кислоты растворяют в 50 мл дистиллированной воды. В полученном растворе при температуре 35-40°C под действием ультразвука растворяют 500 мг соединения I. Воду удаляют лиофилизацией и остаток сушат в вакууме 1 мм рт.ст. при температуре 20°C. Получают 7,9-8,1 г комплекса с содержанием основного вещества около 6,2%.
Об образовании комплекса свидетельствует смещение сигналов ароматических протонов в спектрах 1H ЯМР на 0,1-0,2 м.д.
2. Изучение влияния соединения I на системное артериальное давление (АД) при хроническом введении бодрствующим животным
В исследовании использовали 2 группы половозрелых крыс линии Wistar обоего пола массой 300-350 г. За сутки до начала эксперимента животным вживляли катетеры в бедренную вену и артерию для измерения системного артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС). Регистрацию проводили с помощью АЦП на компьютере.
Комплекс соединения I с циклодекстрином вводили в виде раствора 332 мг комплекса в 10 мл дистиллированной воды. Раствор комплекса вводили крысам в бедренную вену в объемах 0,15 и 0,3 мл, что эквивалентно 10 и 20 мг/кг соединения I соответственно. Комплекс соединения I с глицирризиновой кислотой вводили в виде раствора 265 мг комплекса в 10 мл дистиллированной воды. Раствор комплекса вводили в бедренную вену в объемах 0,15 и 0,3 мл, что эквивалентно 10 и 20 мг/кг соединения I соответственно. Соединение I вводили в дозах 10 и 20 мг/кг в бедренную вену.
Результаты исследования
Результаты представлены в виде изменения САД и ЧСС на введение исследуемых соединений и приведены в таблице 5.
Таблица 5
Влияние комплексов соединения I с циклодекстрином и глицирризиновой кислотой в сравнении с соединением I на показатели САД и ЧСС экспериментальных животных в хроническом эксперименте
| Препараты | Параметры | Динамика изменений САД и ЧСС | |||
| Исходный | 1 день | 3 день | 7 день | ||
| Комплекс соединения I с циклодекстрином, 10 мг/кг | САД | 115±3,1 | 118±0,9 | 107,5±2,2* | 101,2±2,7* |
| ЧСС | 344±20,3 | 354±18,2 | 385,9±11* | 411,9±4,7* | |
| Комплекс соединения I с ГК, 10 мг/кг | САД | 114±3,0 | 116±0,8 | 108,5±2,1* | 102,2±2,7* |
| ЧСС | 345±20,1 | 353±18,0 | 386,0±10* | 412,0±4,6* | |
| Соединение I -10 мг/кг | САД | 113±2,1 | 112,2±0,7 | 110,6±0,1 | 112,8±0,7 |
| ЧСС | 392±6,2 | 321,5±2,7* | 310,7±6,1* | 356,9±4,4* | |
| Комплекс соединения I с циклодекстрином, 20 мг/кг | САД | 112±3,2 | 104,7±4,1* | 81,2±1,1* | 84±2,6* |
| ЧСС | 352±18 | 373±5,6* | 356±14 | 355,4±11,2 | |
| Комплекс соединения I с ГК, 20 мг/кг | САД | 114±3,0 | 117±0,8 | 109,0±2,3* | 102,2±2,88* |
| ЧСС | 346±20,3 | 353±18,2 | 386,1±11* | 412,5±4,8* | |
| Соединение I -20 мг/кг | САД | 113±2,2 | 105,2±4,0* | 80,2±1,1* | 86,0±2,4* |
| ЧСС | 352±18 | 373±5,6* | 356±14 | 355,4±11,2 | |
| Примечание: * - различия с исходным уровнем достоверны при p<0,05. |
Представленные данные указывают на наличие у комплексного соединения способности снижать системное артериальное давление, присущей самому активному соединению.
Таким образом, соединение I обладает выраженным коротким гипотензивным и антигипертензивным действием у нормальных животных и на модели гипертензивного состояния, вызванного введением ингибитора образования оксида азота нитроаргинина. Способность высвобождать NO в модельных опытах in vitro и оказывать антигипертензивное действие на соответствующей модели гипертензии позволяет судить об NO-индуцируемом механизме антигипертензивного действия соединения I. Выраженный и короткий антигипертензивный эффект соединения I, обусловленный, как показали исследования, дилатацией периферических сосудов создает перспективу применения его в качестве препарата скорой помощи для терапии гипертензивных кризов, отека легких при острой сердечной недостаточности и т.д.
Все выявленные виды фармакологической активности соединения I сохранялись также при использовании его в виде других фармацевтически приемлемых солей и комплексных соединений с приемлемыми в фармацевтике комплексонами (например, с циклодекстрином и глицирризиновой кислотой).
Литература
1. Rodriguez-Gómez I., Sainz J., et al. // Hypertension. 2003, 42, 220.
2. Alien W., Cowley Jr., Takefumi M., et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2003, 284. P.1355-1369.
3. Каштанов С.И., Звягинцева М.А., Кошарская И.Л., Мезенцева Л.В., Гурин В.Н. // Вестник РАМН. 2000, №4 С.21-25.
4. Schifrin E.L., Park J.B, et al. // Circulation. 2000, 101. P. 1653-59.
5. Park J., Schifrin E. // J.Hypertens. 2001, 19. P.921-930.
6. Hofman F., Ammendola A., Schlossmann. // J. Cell. Sci. 2000, 113. P.1671-1676.
7. Hofman F. // J. Biol. Chem. 2005, Jan 7, 280(1). P.1-4.
8. Ribeiro M., Antunes E., de Nucci G., et al. // Hypertension. 1992, Sep; 20(3). P.298-303.
9. Головко Т.В., Смирнова О.Б., Соловьева Н.П. и др. // Изв. Академии наук. Серия химическая. 2008, №1. С.171-179.
10. Патент США 2008188472.
11. Vogel H.G. // Drug Discovery and evaluation: Pharmacological assays. Springer, 2008.
1. Производное индола, представляющее собой (2Е)-2-[(2-Этокси-1H-индол-3-ил)метилен]гидразинкарбоксимидамида гидрохлорид формулы I
или его фармацевтически приемлемая соль, или комплексное производное.
2. Производное индола по п.1, проявляющее антигипертензивное и антигипоксическое действие.
3. Способ получения производного индола по п.1, характеризующийся тем, что борфторид лактимного эфира оксиндола (II)
путем добавления к смеси N,N-диметилформамида (ДМФА) и оксихлорида фосфора (POCl3) преобразуют в соединение формулы (III)
смесь полученного соединения (III) и карбоната аминогуанидина кипятят в среде этанола, фильтруют, упаривают, добавляют раствор натрия гидрооксида, полученную реакционную массу экстрагируют этилацетатом, отделяют органический слой, упаривают, выделяют целевой продукт добавлением к остатку этилацетата в присутствии хлористоводородной кислоты.
