Способ гомогенизации биологических образцов, содержащих магнитные наночастицы, при выделении днк в процессе автоматической пробоподготовки для пцр анализа

Авторы патента:

Трофимов Юрий Дмитриевич (RU)

Михалёв Владимир Леонидович (RU)

C12N15 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

B82B3 - Изготовление или обработка наноструктур

Владельцы патента RU 2451747:

Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (RU)

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Предложен способ гомогенизации раствора магнитных частиц с адсорбированной на них ДНК. Данное изобретение применяется в лабораторной диагностике при подготовке пробы к постановке ПЦР, для экстракции ДНК из биопрепаратов и удаления или нейтрализации посторонних примесей, что позволяет получить ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации. 7 ил., 1 пр.

1. Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Данное изобретение применяется в лабораторной диагностике для подготовки пробы к постановке ПЦР, в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепаратов и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации. Изобретение представляет способ растирания концентрационных неоднородностей, образующихся при смешивании в лизирующем растворе образца крови с магнитными наночастицами оксида железа, покрытыми адсорбентом SiO₂.

2. Уровень техники

Использование магнитных частиц ничем принципиальным не отличается от использования других типов сорбентов (латексы, полимерные сорбенты, стекло), но позволяет применять магнитное разделение вместо центрифугирования и фильтрации. В основе магнитных частиц используются получаемые наночастицы оксида железа, обладающие суперпарамагнитными свойствами. Частицы на основе оксида железа с суперпарамагнитными свойствами обладают целым рядом преимуществ, наиболее важные из которых следующие:

- такие частицы имеют практически нулевую степень остаточной намагниченности, то есть после снятия внешнего магнитного поля (переноса из магнитного штатива в обычный) эти частицы не слипаются и могут быть легко ресуспендированы;

- такие частицы химически инертны и могут долго храниться в водных растворах, не ингибируют ферментативные реакции, их можно использовать в экспериментах in vitro и in vivo без риска нежелательных последствий;

- такие частицы открывают широкие возможности для автоматизирования процессов выделения нуклеиновых кислот, белков, клеток.

Из уровня техники известны следующие способы получения нуклеиновых кислот с использованием магнитных частиц:

A. Способ очистки с применением магнитных частиц (патент №WO 00/42432 от 20.07.2000)

Данный способ очистки вещества состоит в том, что материал, содержащий вещество и магнитные частицы, покрытые и обработанные реагентом, который связывает частицы с веществом, размещают в первой среде, создают возможность для протекания связывающей реакции, в которой вещество связывается с частицами, и вводят в среду магнитный зонд, в результате чего частицы прилипают к зонду, и зонд вместе с частицами и веществом, связанным с ними, переносят во вторую среду и, если нужно, выделяют из второй среды и переносят в третью среду, отличающийся тем, что в нескольких средах предпочтительно по меньшей мере в первой среде, а наиболее предпочтительно во всех средах, до того как зонд и частицы перенесут из соответствующей среды, размещают агент, ослабляющий поверхностное натяжение.

Основным недостатком этого способа очистки является необходимость переноса магнитного зонда с прилипшими к нему магнитными частицами между различными средами, что резко увеличивает риск контаменации исследуемого образца.

Б. Магнитные полимерные частицы на основе поливинилового спирта, способ их получения (патент №WO 97/04862 от 13.02.1997)

Изобретение относится к магнитным гранулообразным носителям, которые получают суспендированием содержащей магнитные коллоиды поливинилового спирта - полимерной фазы в органической фазе, которая содержит специальную смесь эмульгаторов. Получают частицы с размером частиц 1-8 мкм, которые могут химически связывать лиганды. Носители можно применять для выделения и обнаружения биомолекул, клеток, антител и нуклеиновых кислот.

B. Способ обнаружения анализируемого вещества при помощи коллоидных магнитных частиц (патент №WO 03/04453 от 30.05.2003)

Данный способ обнаружения и количественного определения характеризуется тем, что в нем используют магнитные коллоидные частицы, функционализированные по поверхности одним специфическим лигандом, подлежащим обнаружению или количественному определению анализируемого вещества. Для магнитного разделения используют сильные магниты на основе редкоземельных элементов. Чтобы полностью собрать магнитные частицы в магнитном штативе, требуется, как правило, от нескольких секунд до нескольких минут. Время разделения зависит от объема и вязкости жидкости, из которой собираются магнитные частицы.

Проблема, которая возникает при использовании магнитных частиц (после адсорбции - «прилипания» ДНК на поверхности магнитных частиц и сбора магнитных частиц магнитным полем на одной из стенок пробирки), - это образование «клубка» магнитных частиц, «опутанных» ДНК, что затрудняет проведение дальнейших этапов промывки и исключает в дальнейшем возможность проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени для анализа ДНК.

Задача

Задачей настоящего изобретения является создание способа гомогенизации-ресуспендирования раствора адсорбированных на магнитных частицах ДНК посредством частичной ее дефрагментации и уменьшения сверхспиральности, эффективной промывки и эллюирования - отделения ДНК от магнитных частиц без переноса магнитного зонда, с риском контаменации, между различными объемами, и обеспечения наиболее благоприятных условий для флюоресцентного анализа выделенной и очищенной ДНК приборами «PCR RealTime» и, таким образом, автоматизирования всего цикла проведения анализа ДНК.

3. Раскрытие изобретения

Поставленная задача создания однородного раствора магнитных наночастиц с адсорбированными на них образцами ДНК, выделенными из клеток крови, решается новым способом частичной дефрагментации молекул ДНК, а именно растиранием любых неоднородностей концентрации магнитных частиц, зажатых сильным неоднородным магнитным полем между внутренней поверхностью пробирки и вращающимся вокруг своей оси магнитным зондом. Вращение магнитного зонда с одновременным его прижимом к внутренней стенке пробирки осуществлялось вращающимися магнитными (1.2-1.3 Тл) шариками штатива.

В пробирку, стандартно используемую для выделения ДНК, объемом 1.5 мл вводилось:

1) 5 мкл магнитных частиц в концентрации 5 мг/мл;

2) 50 мкл крови для выделения ДНК;

3) 150 мкл лизирующего раствора;

4) магнитный цилиндрический зонд.

Вращение магнитного зонда вокруг своей оси, коллинеарной оси пробирки и создание микротурбулентных течений способствовало максимально полной адсорбции - «прилипанию» ДНК на поверхности магнитных частиц. После остановки вращательного движения зонда и сбора магнитных наночастиц с ДНК сильным неоднородным магнитным полем шариков штатива на внутренней поверхности пробирки и, частично, на поверхности магнитного зонда магнитные частицы, «опутанные» ДНК, образуют «клубок», представляющий собой очень эластичную пористую среду с высокой прочностью на разрыв, что и было основной преградой на пути использования стандартного метода выделения ДНК с использованием магнитных частиц и магнитного штатива.

Предпринимались различные неудачные попытки для устранения (разбиения) комкования магнитных частиц, такие как многократное пипетирование, разрезание ножами миксера при оборотах более 50 Гц, разбиение более крупными ферромагнитными частицами по принципу работы шаровых мельниц. Таким образом, становилось невозможным проведение дальнейших стандартных стадий пробоподготовки - три промывки и элюирование ДНК от магнитных частиц, и следовательно, невозможность выделения чистых, пригодных для ПЦР анализа образцов ДНК.

Положительный результат - создание гомогенного раствора магнитных частиц с ДНК - был получен лишь с использованием принципа растирания микронеоднородностей, зажатых между двумя поверхностями. Микронеоднородности с магнитными частицами - «комки» втягиваются в область высокого магнитного поля, прижимаясь к стенкам пробирки, как это реализуется в стандартном магнитном штативе со стационарным магнитным полем. В качестве магнитов штатива нами используются магнитные (Nd-Fe-B) шарики диаметром 5 мм (B_{остаточное}≈1.2-1.3 Тл), расположенные с внешней стороны пробирки, способные свободно вращаться вокруг любой из своих осей. Второй, прижимающей, поверхностью в предлагаемой нами методике является вводимый внутрь пробирки магнитный зонд - цилиндрик диаметром 1.5-2.0 мм и длиной 6-8 мм, намагниченный поперек оси цилиндра (параллельно оси пробирки) и имеющий B_{остаточное}0.2-0.3 Тл на поверхности. В качестве материала для изготовления магнитного цилиндрика использовался магнитопласт, получаемый методом литья (силикон с добавлением 80% быстрозакаленного магнитного порошка неодимового сплава), с последующим намагничиванием его с помощью индуктора.

Магнитный цилиндрик-зонд, притягиваемый сильным магнитом, зажимал «комки» между собой и внутренней стенкой пробирки. Вращаясь вокруг своей оси и оставаясь всегда прижатым к внутренней стенке пробирки, магнитный зонд эффективно растирает «комки» магнитных частиц «опутанных» ДНК, частично (как показал последующий электрофорез) дефрагментируя саму ДНК.

В пробирке при этом образуется суспензия из магнитных частиц с адсорбированными на них ДНК.

4. Осуществление изобретения

4.1 Описание конструкции модели прибора, с помощью которого проводились испытания.

16 пробирок с одноразовыми магнитными цилиндрическими зондами внутри располагались равномерно по окружности в штативе. Между каждой из 8 пар пробирок в цилиндрические полости (диаметром 5.1 мм) штатива помещались 8 супермагнитных (1.2-1.3 Тл) шариков диаметром 5 мм, имеющих возможность свободно вращаться вокруг любой своей оси. Вид модели без пробирок представлен на фиг.1. Вращение восьми супермагнитных шариков штатива осуществлялось посредством создания вращающегося в горизонтальной плоскости вектора индукции магнитного поля в плоскости окружности их расположения. Создание вращающегося с частотой 10-30 Гц магнитного поля в нашей модели обеспечивалось вращением в радиальной плоскости одного стержневого магнита, расположенного вдоль диаметра окружности пробирок.

На фиг.2, изображен вид модели снизу, где показано расположение стержневого магнита, создающего вращающееся магнитное поле. Приводом служил электромотор, питаемый от батареек (3-6 В), с частотой вращения 30-50 Гц. Лунки штатива для пробирок прокладывались гибким нагревательным элементом (нихром в карбоновой ленте, мощность около 10 Вт), для нагрева до 50-60°С после третьей стадии промывки - сушки (5 минут), а также для нагрева до 60-65°С (10 минут) в эллюирующем растворе для отделения ДНК от сорбента на поверхности магнитных частиц. Гибкая нагревательная карбоновая лента с двумя нихромовыми нитями, также видна на фиг.1 и фиг.2.

Последней стадией пробоподготовки является сбор магнитных частиц на стенке пробирки и магнитном зонде. Выделенная и очищенная ДНК остается в растворе.

Этапы выделения ДНК из биологического образца с использованием изобретения

ДНК выделяют из образцов крови при помощи стандартного набора реагентов. На одну пробирку 1.5 мл используют:

1 этап

- 50 мкл крови + 150 мкл лизирующего раствора + 5 мкл стандартной концентрации магнитных частиц;

- Промывка;