Антитело против pannrpa (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии, к получению антитела к нейропилину, которое связывается как с Nrp1, так и с Nrp2. Полученное антитело обладает способностью ингибировать биологическую активность семафорина и может быть использовано в терапевтических целях. 14 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 пр., 2 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к кристаллическим структурам фрагментов нейропилина 1 (Nrp1) и нейропилина 2 (Nrp2) как в виде одиночных фрагментов, так и в комплексе с антителами к нейропилину, а также к их применению. Дополнительно в изобретении предлагаются антитела, связывающиеся с Nrp1 и/или Nrp2, и способы их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Развитие сосудистой системы является фундаментальной потребностью для многих физиологических и патологических процессов. Активно растущие ткани, например эмбриональные и опухолевые, требуют достаточного кровоснабжения. Они удовлетворяют эту потребность, вырабатывая проангиогенные факторы, которые стимулируют образование и поддержание новых кровеносных сосудов посредством процесса, обычно называемого ангиогенезом. Образование сосудов представляет собой сложное, но упорядоченное биологическое явление, включающее все или многие из следующих этапов: a) эндотелиальные клетки (EC) пролиферируют из существующих EC или дифференцируются из клеток предшественников; b) EC мигрируют и сливаются, образуя тяжевидные структуры; c) затем сосудистые тяжи проходят тубулогенез, формируя сосуды с центральным просветом; d) существующие тяжи или сосуды выпускают отростки, формируя вторичные сосуды; e) примитивное сосудистое сплетение проходит дальнейшее ремоделирование и структурную перестройку; и f) привлекаются периэндотелиальные клетки, заключающие в оболочку эндотелиальные трубки, что обеспечивает сосудам поддерживающую и модулирующую функцию: такие клетки включают перициты для мелких капилляров, гладкие мышечные клетки для более крупных сосудов и миокардиальные клетки в сердце. Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112: 19-28 (2003).

В настоящее время точно установлено, что ангиогенез участвует в патогенезе множества нарушений. К таким нарушениям относятся солидные опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальная фиброплазия, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение пересаженной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); and Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.

В случае опухолевого роста ангиогенез критически важен для перехода от гиперплазии к неоплазии, а также для обеспечения питания, необходимого для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al, Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризация позволяет опухолевым клеткам достичь эффективности роста и пролиферативной автономии, сравнимых с нормальными клетками. Опухоль обычно начинается с одной аберрантной клетки, которая может пролиферировать только до размера нескольких кубических миллиметров вследствие удаленности от доступного капиллярного ложа и может длительное время пребывать в "спящем" состоянии без дальнейшего роста и диссеминации. Те же опухолевые клетки впоследствии переключаются на ангиогенный фенотип, активируя эндотелиальные клетки, которые пролиферируют и созревают в новые капиллярные кровеносные сосуды. Такие вновь сформированные кровеносные сосуды создают возможность не только для продолжения роста первичной опухоли, но и для рассеивания и реколонизации метастатических опухолевых клеток. В соответствии с этим наблюдается корреляция между плотностью микрососудов в срезах опухолей и выживаемостью больных при раке молочной железы и ряде других опухолей. Weidner et al, N. Engl. J. Med 324: 1-6 (1991); Horak et al, Lancet 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340: 145-146 (1992). Точные механизмы, регулирующие переключение на ангиогенез, не вполне понятны, но полагают, что неоваскуляризация опухолевой массы обусловлена прямым балансом по численности между стимуляторами и ингибиторами ангиогенеза (Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31).

Процесс развития сосудов строго регулируется. К настоящему времени выявлено большое число молекул, главным образом секретируемых окружающими клетками, которые регулируют дифференциацию, пролиферацию, миграцию и слияние EC в тяжевидные структуры. Например, в качестве ключевого фактора, вовлеченного в стимуляцию ангиогенеза и в индуцирование сосудистой проницаемости, был идентифицирован фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Ferrara et al, Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Обнаружение того факта, что утрата даже одного аллеля VEGF приводит к летальнеому исходу эмбриона, указывает на незаменимую роль этого фактора в развитии и дифференциации сосудистой системы. Кроме того, было продемонстрировано, что VEGF является ключевым медиатором неоваскуляризации, связанной с опухолями и внутриглазными заболеваниями. Ferrara et al., Endocr. Rev. выше. Проведенные исследования показали, что большинство опухолей человека сверхэкспрессируют мРНК VEGF. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91: 153-159 (1993); Brown et al, Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al, Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al, Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak et al, Am. J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995).

Уровни концентрации VEGF в глазной жидкости проявляют высокую корреляцию с наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у больных с диабетической и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Aiello et al, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994). Кроме того, исследования продемонстрировали, что у больных, пораженных AMD, VEGF локализован в хориоидальных неоваскулярных мембранах. Lopez et al, Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 37:855-868 (1996).

Нейтрализующие антитела против VEGF подавляют рост множества клеточных линий опухолей человека у голых мышей (Kim et al, Nature 362:841-844 (1993); Warren et al, J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström et al, Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al, Cancer Res. 56:921-924 (1996)), а также подавляют внутриглазной ангиогенез в моделях ишемических нарушений сетчатки. Adamis et al, Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Следовательно, моноклональные антитела против VEGF или другие ингибиторы действия VEGF являются перспективными кандидатами на роль средств для лечения опухолей и различных внутриглазных неоваскулярных нарушений. Такие антитела описаны, например, в документах EP 817648, опубликованном 14 января 1998 г., и WO98/45331, и WO98/45332, опубликованных 15 октября 1998 г. Одно из антител против VEGF, бевацизумаб (bevacizumab), было разрешено FDA для применения в комбинации с химиотерапией для лечения метастатического колоректального рака (CRC) и немелкоклеточного рака легких (NSCLC). Бевацизумаб в настоящее время также исследуется во многих продолжающихся клинических испытаниях по лечению различных раковых заболеваний.

В ходе развития нервной системы нейроны выпускают аксоны (типа кабелей), которые мигрируют на большие расстояние, чтобы достичь своих мишеней. Смотри обзор Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005) Nature 436:193-200. На переднем конце растущего аксона имеется высокоподвижная сенсорная структура, называемая конусом роста. Через динамические циклы вытягивания и втягивания филоподиальных удлинений конус роста постоянно воспринимает и оценивает сигналы от мириад направляющих раздражителей в окружающем его пространстве, точно выбирая правильный маршрут для удлинения по направлению к своей конечной мишени.

За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании механизма направленного движения аксонов. Смотри обзор Dickson (2002) Science 298:1959-64. Направляющие раздражители существуют в четырех разновидностях: аттрактанты и репелленты, которые могут действовать или на коротком расстоянии (то есть ассоциированы с клетками или матриксом) или на более дальнем расстоянии (то есть способны к диффузии). До сих пор были идентифицированы четыре основных семейства молекул, направляющих аксоны: нетрины, семафорины, эфрины и белки, носящие название slit-протеины. Смотри обзор Huber et al (2003) Annu Rev Neurosci 26:509-63.

Семафорины (Sema), также называемые коллапсинами, относятся к большому семейству филогенетически консервативных секретируемых и связанных с мембранами белков. Члены семейства семафоринов способны в процессе развития нервной системы опосредовать как отталкивающие, так и притягивающие импульсы в наведении аксонов. Raper (2000) Curr Opin Neurobiol 10:88-94. К настоящему времени идентифицированы более тридцати семафоринов, причем все они имеют общий консервативный N-концевой домен Sema, состоящий приблизительно из 500 аминокислот. Члены семейства семафоринов классифицируются на восемь подсемейств в зависимости от их структурного сходства и биологического (видового) происхождения. Для более подробной информации об унифицированной номенклатуре семафоринов, смотри Semaphorin Nomenclature Committee (1999) Cell 97:551-552.

Семейство нейропилина (NRP) состоит из двух гомологичных белков, нейропилина-1 (NRP1) и нейропилина-2 (NRP2). NRP1 был впервые идентифицирован как трансмембранный гликопротеин типа I с молекулярной массой 130 кДа, экспрессируемый на конусах роста растущих аксонов. Позднее на основе экспрессионного клонирования был идентифицирован NRP2. Fujisawa and Kitsukawa (1998) Curr Opin Neurobiol 8:587-592. Обнаружено, что NRP являются рецепторами подгруппы семафоринов (семафоринов класса 3). Было высказано предположение о том, что NRP функционируют как несигнальные корецепторы, наряду с другим семейством рецепторов семафоринов, плексинами.

Хотя первоначально NRP были описаны как медиаторы направления аксонов, было также обнаружено, что они играют критически важную роль в развитии сосудов. Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005). Они идентифицированы как изоформспецифические рецепторы VEGF, экспрессируемые на опухолевых и эндотелиальных клетках, что свидетельствует о необходимости направить значительные усилия на выяснение роли NRP в сосудистой и опухолевой биологии. Soker et al (1998) Cell 92:735-745; Klagsbrun et al (2002) Adv Exp Med Biol 515:33-48. Генетические исследования дали строгие доказательства того, что Nrp1 необходим для сосудистого морфогенеза. Утрата функции Nrp1 приводит к ремоделированию сосудов и дефектам ветвления, фенотипу, который дополнительно усиливается при утрате функции Nrp2. Kawasaki et al. (1999) Development 126:4895- 4902; Takashima et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662. Эти результаты позволяют предположить, что на ранних этапах развития Nrp1 и Nrp2 могут иметь перекрывающиеся функции. Однако на более поздних этапах развития экспрессия каждого Nrp разделяется, причем Nrp1 экспрессируется, главным образом, в артериях, а Nrp2 в венах и лимфатических сосудах. Yuan et al (2002) Development 129:4797-4806; Herzog et al. (2001) Mech Dev 109:115-119. Примечательно, что изолированная утрата функции Nrp2 специфическим образом нарушает развитие лимфатической системы.

Поскольку Nrp1 в период развития экспрессируется во многих других типах клеток, роль сосудистого Nrp1 изучали посредством генерирования EC-специфического генного нокаута, который приводил к развитию сходных сосудистых дефектов с нулевым аллелем. Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57. Интересно, что это исследование также показало, что связывание Sema3A с NRP1 не обязательно для развитие сосудистой системы. Еще в одном исследовании наблюдались дефекты направления верхней части эндотелиальных клеток при развитии заднего мозга у эмбрионов Nrp1 KO. Gerhardt et al. (2004) Dev Dyn 231:503-509.

Несмотря на обширные исследования роли NRP1 в развитии сосудистой системы, остается неясным, реализует ли NRP1 свою сосудистую функцию исключительно через метаболический путь рецептора VEGF-VEGF 2 (VEGFR2), действуя как усилитель связывания VEGF с VEGFR2 и, следовательно, как сигнальный фактор для VEGFR2, или через сигнальный путь, независимый от VEGFR2, или через комбинацию обоих указанных метаболических путей.

Моноклональные антитела можно получать, применяя технологию рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела, особенно полученные от грызунов, нашли самое широкое применение, однако антитела нечеловеческого происхождения часто оказываются антигенными для человека. В данной области техники предпринимались попытки для преодоления этой проблемы, связанные с конструированием "химерных" антител, в которых антигенсвязывающий домен нечеловеческого происхождения сочленен с константным доменом человека (Cabilly et al., патент США № 4816567). Изотип константного домена человека можно выбирать с таким расчетом, чтобы придать химерному антителу способность участвовать в антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности. В дальнейших попытках разрешить антигенсвязывающие функции антител и свести к минимуму применение гетерологичных последовательностей в антителах человека, к различным антигенам были генерированы гуманизированные антитела, в которых значительно меньшая часть последовательности, чем интактный вариабельный домен человека, была замещена в некоторых участках соответствующей последовательностью от биологических видов, отличных от человека. Например, остатки из последовательностей грызунов подставлялись в соответствующие сегменты антител человека. В практическом аспекте гуманизированные антитела представляют собой типичные антитела человека, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка (CDR) и, возможно, некоторые остатки каркасного участка (FR) замещены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов. Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

Перед тем как терапевтическое антитело будет вводиться человеку, желательно провести доклинические исследования на млекопитающих, отличных от человека, с тем, чтобы оценить эффективность и/или токсичность антитела. В идеальном случае антитела, являющиеся предметом таких исследований, способны распознавать целевой антиген, эндогенный для животного хозяина, например мыши или нечеловекообразного примата, и взаимодействовать с ним с высокой эффективностью.

Технология фагового дисплея предоставила мощный инструмент для генерирования и отбора новых белков, способных связываться с таким лигандом как антиген. Применяя методику фагового дисплея, можно создавать большие библиотеки вариантов белков и быстро сортировать их для отбора тех последовательностей, которые с высокой аффинностью способны связываться с целевым антигеном. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариантные полипептиды, сливают с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих оболочечный белок вируса, например белок гена III или белок гена VIII. Были разработаны моновалентные системы фагового дисплея, в которых последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок или полипептид, слита с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. (Bass, S. (1990) Proteins 8:309; Lowman and Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3:205). В моновалентной системе фагового дисплея слияние генов экспрессируется на низком уровне, а белки гена III дикого типа также экспрессируются таким образом, что сохраняется инвазионная способность частиц. Способы создания библиотек пептидов и скрининга этих библиотек были раскрыты во многих патентах (например, патент США № 5723286, патент США № 5432 018, патент США № 5580717, патент США № 5427908 и патент США № 5498530).

Важной для разработки библиотек фагового дисплея антител оказалась демонстрация экспрессии пептидов на поверхности нитевидного фага и экспрессии функциональных фрагментов антител в периплазме E. Coli. (Smith et al. (1985) Science 228:1315; Skerra and Pluckthun (1988) Science 240:1038). Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов были получены множеством способов, включая изменение единичного гена путем инсерции случайных последовательностей ДНК или посредством клонирования семейства родственных генов. Способы демонстрации антител или антигенсвязывающих фрагментов с применением фагового дисплея были описаны в патентах США №№ 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. Затем библиотеку скринируют на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков, обладающих желаемыми свойствами.

Технология фагового дисплея имеет несколько преимуществ перед традиционными гибридомными и рекомбинантными методами в получении антител с желаемыми характеристиками. Эта технология позволяет создавать большие библиотеки антител с разными последовательностями за меньшее время и без использования животных. Для подготовительных работ с целью получения гибридом или гуманизированных антител, бесспорно, может потребоваться несколько месяцев. В дополнение к этому, поскольку не требуется иммунизация, можно создавать фаговые библиотеки антител для тех антигенов, которые токсичны или обладают низкой антигенностью (Hogenboom (1988) Immunotechniques 4:1-20). Фаговые библиотеки антител также можно использовать для создания и идентификации новых терапевтических антител.

Библиотеки фагового дисплея были использованы для создания антител человека из иммунизированных и неиммунизированных последовательностей зародышевых линий человека или из репертуара Ig не подвергавшихся каким-либо воздействиям B-клеток (Barbas & Burton(1996) Trends Biotech 14:230; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245; Vaughan et al. (1996) Nat. Biotech. 14:309; Winter EP 0368 684 B1). Не подвергавшиеся каким-либо воздействиям антигенсвязывающие библиотеки создавались с применением разнообразных лимфоидных тканей. Некоторые из этих библиотек имеются в продаже, например библиотеки, разработанные компанией Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan et al. (1996) Nature Biotech 14:309; Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57). Однако многие из этих библиотек имеют ограниченное разнообразие.

Способность идентифицировать и выделять высокоаффинные антитела из библиотеки фагового дисплея важна для получения новых антител в целях их терапевтического применения. Возможность выделения высокоаффинных антител из библиотеки зависит от размера библиотеки, эффективности продуцирования в бактериальных клетках и от разнообразия библиотеки. Смотри, например, Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57. Размер библиотеки уменьшается при неэффективности продукции вследствие неправильного свертывания антитела или антигенсвязывающего белка или из-за наличия стоп-кодона. Экспрессия в бактериальных клетках может быть подавлена, если антитело или антигенсвязывающий домен свернуты неправильно. Экспрессию можно улучшить за счет мутирования остатков на границе вариабельного и константного доменов или избранных остатков CDR. (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9533, Ulrich et al. (1995) PNAS, 92:11907-11911; Forsberg et al. (1997) J Biol. Chem. 272:12430). Если фаговые библиотеки антител продуцируются в бактериальных клетках, то важным фактором в обеспечении правильного свертывания является последовательность каркасной области.

Для выделения высокоаффинных антител также важно создавать разнообразные библиотеки антител или антигенсвязывающих белков. Библиотеки с разнообразием с ограниченных CDR создавались с применением разнообразных подходов. Смотри, например, Tomlinson (2000) Nature Biotech. 18:989-994. Области CDR3 отчасти представляют интерес потому, что нередко обнаруживается их участие в связывании антигенов. Области CDR3 тяжелой цепи значительно варьируются по размеру, последовательности и структурной конформации.

Другие специалисты также генерировали разнообразие посредством рандомизации CDR вариабельных областей тяжелых и легких цепей с использованием всех 20 аминокислот в каждом положении. Полагали, что использование всех 20 аминокислот может привести к большому разнообразию последовательностей вариантных антител и к увеличению шансов на идентификацию новых антител. (Barbas (1994) PNAS 91:3809; Yelton, DE (1995) J. Immunology 155:1994; Jackson, J.R. (1995) J. Immunology 154:3310 and Hawkins, RE (1992) J. Mol. Biology 226:889).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к кристаллическим структурам фрагментов нейропилина-1 и нейропилина-2 (Nrp1 и Nrp2) в виде одиночных фрагментов или в комплексе в антителами, которые селективно блокируют связывание или семафорина, или VEGF. Nrp воспринимают неожиданное расположение доменов, при котором домены a2, b1 и b2 образуют плотно упакованный кор. Варианты расположения эпитопов антител, наряду с экспериментами in vitro, показывают, что VEGF и семафорины не конкурируют напрямую за связывание с Nrp. Основываясь на кристаллографическом димере Nrp, опосредованном доменом a1, настоящее изобретение дополнительно предлагает модели для димеризации рецептора и связывания лиганда.

Основываясь на этих результатах, в одном из аспектов настоящее изобретение предлагает кристалл, образованный фрагментом Nrp1_b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=65,9 Å, b=66,7 Å, c=74,7 Å и пространственную группу P2₁2₁2₁.

В следующем аспекте изобретение относится к кристаллу, образованному фрагментом Nrp1_a2b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=53,2 Å, b=68,2 Å, c=66,6 Å и пространственную группу P2₁.

Еще в одном аспекте изобретение относится к кристаллу комплекса, образованного фрагментом Nrp1_b1 и Fab-фрагментом антитела против Nrp1^B (YW107.4.87), который подавляет связывание фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) с Nrp1, причем указанный кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=213 Å, b=213 Å, c=45,3 Å и пространственную группу H3.

В следующем аспекте изобретение относится к кристаллу, образованному фрагментом Nrp2_b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=36,5 Å, b=70,5 Å, c=122 Å и пространственную группу P2₁2₁2₁.

Еще в одном аспекте изобретение относится к кристаллу, образованному фрагментом Nrp2_a2b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=50,1 Å, b=193 Å, c=66,2 Å и пространственную группу P2₁.

Еще в одном аспекте изобретение относится к кристаллу комплекса, образованного фрагментом Nrp2_a1a2b1b2 и Fab-фрагментом антитела против panNrp^A, который подавляет связывание семафорина с Nrp2, причем указанный кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=148 Å, b=106 Å, c=92,4 Å и пространственную группу C2.

Далее изобретение относится к кристаллу комплекса, образованного фрагментом Nrp2_a1a2b1b2 и Fab-фрагментом антитела против panNrp^A, который подавляет связывание семафорина с Nrp2, причем указанный кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=121 Å, b=121 Å, c=203 Å и пространственную группу P3₂21.

Еще в одном аспекте изобретение относится к антителу против panNrp^A, содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи, показанную на фиг.7, и/или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, показанную на фиг.8, или к его фрагменту.

Еще в одном аспекте изобретение относится к Fab-фрагменту антитела против panNrp^A YW68.11, содержащему последовательность, показанную на фиг.9A.

В следующем аспекте изобретение относится к Fab-фрагменту антитела против panNrp^A YW68.11.26, содержащему последовательность, показанную на фиг.9B.

Еще в одном из дальнейших аспектов изобретение относится к антителу против Nrp, которое конкурирует за связывание Nrp с антителом против panNrp^A.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело против Nrp связывается, по существу, с тем же эпитопом, что и антитело против panNrp^A.

В другом варианте осуществления изобретения антитело против Nrp связывается с эпитопом, содержащим, по меньшей мере, часть поверхности взаимодействия, определяемую аминокислотными остатками Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 и R138 аминокислотной последовательности Nrp2_a1a2b1b2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp связывается как с Nrp1, так и с Nrp2.

В следующих вариантах осуществления изобретения антитело против Nrp имеет аффинность связывания по меньшей мере, приблизительно 0,10 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,15 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,20 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,25 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,30 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp блокирует связывание Sema3 как с Nrp1, так и с Nrp2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp не блокирует связывание VEGF с Nrp1 или Nrp2.

В особом варианте осуществления изобретения антитело против Nrp подавляет биологическую активность семафорина in vitro.

В дополнительном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp подавляет биологическую активность семафорина in vivo.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения антагониста семафорина, включающему конструирование молекулы, связывающейся с сайтом, содержащим, по меньшей мере, часть поверхности взаимодействия, определяемой аминокислотными остатками Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 и R138 аминокислотной последовательности Nrp2_a1a2b1b2, синтез соединения и подтверждение того, что соединение блокирует связывание семафорина с Nrp1 и Nrp2.

В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист не препятствует связыванию VEGF с Nrp1 или Nrp2, а способ может включать дополнительный этап подтверждения того, что указанный антагонист не препятствует связыванию VEGF с Nrp1 или Nrp2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает этап подтверждения того, что антагонист не препятствует биологической активности VEGF.

Антагонист может, например, быть выбран из группы, состоящей из антител, фрагментов антител, связывающих полипептидов, пептидов, и низкомолекулярных непептидных молекул, и, предпочтительно, представляет собой антитело или фрагмент антитела, причем фрагменты антитела включают (без ограничений) Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, минитела, димерные антитела (diabodies) и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения антагониста VEGF, включающему применение трехмерной структуры, полученной из кристалла комплекса, образованного фрагментом Nrp1_b1 и Fab-фрагментом антитела против Nrpl^B (YW107.4.87), в котором кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=213 Å, b=213 Å, c=45,3 Å и пространственную группу H3, для конструирования молекулы, связывающейся с сайтом, содержащим, по меньшей мере, часть эпитопа, связанного с указанным антителом Nrpl^B, синтез соединения и подтверждение того, что соединение подавляет связывание VEGF с Nrp1.

В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист не препятствует связыванию семафорина с Nrp1, а способ может дополнительно включать этап подтверждения этого факта.

В другом варианте осуществления изобретения антагонист подавляет биологическую активность VEGF.

Еще в одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает этап подтверждения того, что антагонист подавляет биологическую активность VEGF.

В следующем варианте осуществления изобретения антагонист подавляет сосудистое ремоделирование.

Еще в одном из дальнейших вариантов осуществления изобретения антагонист выбран из группы, состоящей из антител, фрагментов антител, связывающих полипептидов, пептидов и низкомолекулярных непептидных молекул, и, предпочтительно, представляет собой антитело или фрагмент антитела, причем фрагмент антитела может представлять, например, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, линейное антитело, одноцепочечную молекулу антитела, минитело, димерное антитело или полиспецифическое антитело, которые образованы из фрагментов антитела.

Далее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества антагониста VEGF, полученного описанным выше способом, который предлагается настоящим изобретением. Рак может быть, например, выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы (NHL), рака почки, рака предстательной железы, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы и множественной миеломы.

В другом варианте осуществления изобретения лечение дополнительно включает второе лечебное средство, причем второе лечебное средство может быть выбрано (без ограничений) из группы, состоящей из антиангиогенного средства, антинеопластической композиции, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства, например, такого как дополнительный антагонист VEGF.

В следующем варианте осуществления изобретения дополнительный антагонист VEGF представляет собой антитело против hVEGF или его фрагмент.

Антитело против hVEGF может, например, быть способным связываться с тем же эпитопом VEGF, что и антитело A4.6.1, и, более конкретно, бевацизумаб или ранибизумаб.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения вторым терапевтическим средством является ингибитор рецептора тирозинкиназы, выбранный из группы, состоящей из ваталаниба (PTK787), эрлотиниба (TARCEVA^®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA^®), ZD6126 (ANG453), ZDl839, сунитиниба (SUTENT^®), семаксаниба (SU5416), AMG706, AG013736, иматиниба (GLEEVEC^®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, лапатиниба (GSK572016), VELCADE^®, AZD2171, сорафениба (NEXAVAR^®), XL880 и CHIR-265.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Таблица 1 - Сбор данных и статистика детализации

Фиг.1 - VEGF не блокирует индуцированный Sema3A коллапс конуса роста нейронов DRG

A) Изображения конусов роста аксонов. Необработанные DRG имеют крупные и богатые актином конусы роста (острие стрелки), которые значительно уменьшаются при добавлении Sema3A. Антитела против Nrp были добавлены в дозе 50 мкг/мл.

B) Количественная оценка коллапса конусов роста, индуцированного Sema3A. Процентный показатель спавшихся конусов роста вычисляли путем подсчета спавшихся и не спавшихся конусов роста (N=4 эксплантата на состояние). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку средней.

Фиг.2 - Сводка данных по структуре кристалла нейропилина.

A) Эктодомен Nrp состоит из тандема CUB (a1a2), тандема фактора коагуляции V/VIII (b1b2) и одного домена MAM (c1). Упрощенное схематическое представление семи структур кристалла, представленных в этом сообщении с пределами разрешения, перечисленными ниже. Оранжевые сферы показывают связанный ион кальция в домене a2.

B) Выравнивание последовательности доменов a1a2b1b2 в Nrp1 и Nrp2 человека. Элементы вторичной структуры относятся к структуре Nrp2-a1a2b1b2 (синий - a1, зеленый - a2, желтый - b1, красный - b2) и названы согласно договоренности, принятой для домена CUB спермадгезина (Romero, A. et al., Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)) и домена C2 фактора коануляции V (Macedo-Ribeiro, S. et al., Nature 402, 434-9 (1999)). Остатки, ограниченные синими и желтыми рамками, обрисовывают эпитопы антитела для анти-panNrp^A и анти-Nrp1^B соответственно. Аминокислоты, выделенные оранжевым цветом, показывают сайт связывания Ca²⁺ в a2, а остатки, выделенные красным цветом, представляют предполагаемый сайт связывания Ca²⁺ в домене a1. Остатки, затушеванные зеленым цветом, выделяют положения аминокислотных замещений, которые разрывают взаимодействие между Sema3A и Nrp1 (Gu, C. et al., J Biol Chem 277, 18069-76 (2002)). Это выравнивание было проведено с применением компьютерной программы EsPript (Gouet, P. et al., Nuclei Acids Res 3l, 3320-3 (2003)).

Фиг.3 - общая доменная архитектура нейропилинов.

A) доменная организация Nrp2 (синий - a1, зеленый - a2, желтый - b1, красный - b2) в комплексе с Fab-фрагментом антитела против panNrp^A (светло-оранжевый - тяжелая цепь, серый - легкая цепь). N-гликозилированные остатки выделены пурпурным цветом (маджента).

B) Ленточное отображение структур a2b1b2 Nrp1 и Nrp2; оранжевые сферы выделяют связанный ион кальция.

C) Совмещение комплекса Nrp2/Fab из двух разных кристаллических форм на основе доменов a2b1b2. Обратите внимание на плохое совмещение доменов a1 по сравнению с областью a2b1b2. Все рисунки структур получены при помощи компьютерной программы PyMol (http://www.pymol.org).

Фиг.4 - молекулярные детали доменов CUB нейропилина.

A) В структурах a2b1b2 домен a2 включает связанный ион кальция (оранжевый). Домены Nrp a1 (смотри панель C) и a2 утрачивают нить b1, обнаруживаемую у спермадгезина (Romero et al, выше).

B) Ион кальция в домене a2 Nrp1 координирован тремя отрицательно заряженными аминокислотами, двумя карбонильными кислородами основной цепи и молекулой воды. Эти взаимодействия высоко консервативны для Nrp (смотри фиг.S2-S3).

C) (Левая панель) Аминокислоты раскрашены в соответствии с процентным содержанием доступной для растворителя поверхности, которая скрыта на границе раздела Nrp2/Fab (красный - 75-100%, оранжевый - 50-74%, желтый - 25-49%). Антитело против panNrp^A перекрестно реактивно с Nrp1 и Nrp2, а одиннадцать из четырнадцати остатков в структурном эпитопе идентичны (черный текст - идентичные, белый текст - не консервативные, звездочками отмечены остатки, в которых боковая цепь направлена в сторону белкового стержня a1). Остатки, выделенные зеленым цветом, показывают положения аминокислотных замещений, которые необходимы для взаимодействий между Nrp1 и Sema3A²³. (Правая панель) Атомы Ca в этих аминокислотных замещениях показаны в виде зеленых сфер. Атомы Ca, затушеванные пурпурным цветом, показывают предполагаемый сайт связывания кальция.

D) Поверхность раздела против panNrp^A/Nrp2. Nrp2 показан как молекулярная поверхность в соответствии с электростатическим потенциалом (красный - кислотный, синий - щелочной). Контактные остатки антитела управляются ароматическими остатками из CDR H2, H3 и L3.

Фиг.5 - Признаки доменов Nrp, связывающихся с VEGF и с гепарином.

A) Совмещение кристаллических структур Nrp b1b2 (Nrp1 - желтый (b1) и красный (b2), Nrp2 - серый). Синие (Nrp1) и зеленые (Nrp2) остатки подчеркивают конформационные различия в "пиках" b2, но не b1.

B) Молекулярные поверхности крысиной (инвентарный номер PDB 2ORZ) (Vancer Kooi, C. W., et al., Proc Natl Acad Sci USA (2007)) и человеческой кристаллических структур b1b2 окрашены в соответствии с электростатическим потенциалом. Желтые стрелки указывают на кислотный желобок, который образован "пиками" в домене b1 и представляет сайт связывания тафтсина в крысиной структуре (Vander Kooi et al., выше). Зеленые стрелки показывают приблизительное расположение участка связывания гепарина.

C) Относительный консерватизм последовательности (зеленый - 100%, желтый - ≥75%) доменов b1b2 среди двенадцати Nrp (фиг.S3) был картирован на поверхности структуры Nrp1 b1b2 человека. Два высококонсервативных участка выделены оранжевым цветом. Остатки, выделенные голубым цветом (циан), означают те остатки, которые контактируют с Fab в комплексе анти-Nrp1^B-Fab/b1. Домен a2 (пшеничный) показан с применением совмещения структур b1b2 и a2b1b2 из Nrp1.

D) Ленточное представление комплекса анти-Nrp1^B-Fab/b1 (желтый - b1, оранжевый - тяжелая цепь, серый - легкая цепь).

E) Поверхность раздела анти-Nrp1^B/b1. Домен b1 упрощенно изображен как молекулярная поверхность в соответствии с электростатическим потенциалом: желтая стрелка указывает желобок для связывания хвоста VEGF. Только CDR H3 и Ll контактируют с b1.

Фиг.6 - Кристаллографический димер Nrp2 предполагает модели связывания VEGF и семафорина

A) Nrp2 образует седловидный димер в обеих кристаллических формах комплекса Nrp2/Fab. Эта фигура выделяет домены Nrp2 a1a2b1b2 из моносимметричной формы комплекса Fab. Указаны предполагаемые сайты связывания хвоста VEGF, гепарина и семафорина.

B) Потенциальные модели комплексов VEGF/Nrp и семафорин/Nrp, основанные на Nrpa1-опосредованном димере в кристаллических структурах.

Фиг.7 - Выравнивание последовательности вариабельного домена легкой цепи антитела против panNrp ^A (клоны YW68.11 и YW68.11.26).

Фиг.8 - Выравнивание последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антитела против panNrp ^A (клоны YW68.11 и YW68.11.26).

Фиг.9A - Полная последовательность антитела IgG1 человека против panNrp ^A YW68.11.

Фиг.9B - Полная последовательность антитела IgG1 человека против panNrp ^A YW68.11.26.

Таблица S1 - Условия, использованные для кристаллизации и криопротекции.

Фиг.S1 - Анализ кинетики связывания антитела против Nrp.

Кинетический анализ антитела против panNrp^A методом BIAcore. Сенсограммы впрыскивания 500 нМ каждого белка NRP человека при 25°C над иммобилизованным IgG сенсорным чипом BIAcore демонстрируют специфичность связывания: антитело против panNrp^A связывает домены a1a2b1b2 Nrp1 и Nrp2, но не домены b1b2 Nrp2.

Фиг.S2 - Домены CUB Nrp включают консервативный сайт связывания кальция.

A) Плотность электронов вокруг иона кальция в структуре Nrp1 a2b1b2 (конечная карта 2F_O-F_C map вычерчена при 1,5σ).

B) Ион кальция домена a2 Nrp2.

C) Три отрицательно заряженные аминокислоты (затушеваны оранжевым цветом), которые очерчивают сайт связывания кальция, консервативны в доменах CUB из Nrp1 и Nrp2.

Фиг.S3 - Выравнивание последовательностей нейропилинов.

Выравнивание полноразмерной последовательности доменов a1a2b1b2 из Nrp1 и Nrp2 человека, мыши, крысы, рыбки данио (BRARE), лягушки (XENLA) и курицы. Эта фигура раскрашена по той же схеме, что и фиг.2B, и была получена при помощи компьютерной программы EsPript (Gouet P. et al., выше).

Фиг.S4 - Сравнение структур Nrp1/тафтсин и b1/Fab

A) В комплексе Nrp1-b1/против Nrp1^B-Fab C-концевой хвост (пурпурный) тяжелой цепи из симметрично связанной молекулы занимает сайт связывания тафтсина (Nrp2, молекулярная поверхность в соответствии с электростатическим потенциалом: оранжевый - тяжелая цепь антитела, серый - легкая цепь антитела).

B) Локализация тафтсина (зеленый) в комплексе с крысиным Nrp1 b1b2 (инвентарный номер PDB 2ORZ)(Vander Kooi, et al., выше).

C) Совмещение двух структур, выделенных на панели A. Антитело и пептид тафтсина окрашены так же, как и на предыдущих панелях: Nrp1 b1 человека окрашен желтым, а Nrp1 b1b2 крысы окрашен голубым (циан).

Фиг.S5 - Поверхность раздела димера Nrp2

A) Ленточное представление димера Nrp2-a1a2b1b2/Fab, как оно видится в моносимметричной форме структуры.

B) Наложение кристаллической структуры Nrp1-b1/против Nrpl^B-Fab на кристаллическую структуру Nrp2/Fab.

C) Аминокислоты, скрытые на границе раздела a1/a1, раскрашены в соответствии с процентным содержанием доступной для растворителя поверхности, которая скрыта в результате димеризации (красный - 75-100%, оранжевый - 50-74%, желтый - 25-49%).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым кристаллическим структурам, композициям, способам для модулирования опосредованной NRP биологической активности и к скринирующим анализам для идентификации кандидатов, способных модулировать опосредованную NRP биологическую активность.

Определения

"Нейропилин" или NRP - собирательный термин, относящийся к нейропилину-1 (NRP1), нейропилину-2 (NRP2), а также к их изоформам и вариантам, как это описано в ссылке Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222. Нейропилины являются нетирозинкиназными рецепторами с молекулярной массой от 120 до 130 кДа. Существует множество вариантов сплайсинга и растворимых изоформ NRP-1 и NRP-2. Базисная структура нейропилинов содержит пять доменов: три внеклеточных домена(a1a2, b1b2 и c), трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Домен a1a2 гомологичен компонентам комплемента C1r и C1s (CUB), который обычно содержит четыре цистеиновых остатка, образующих два дисульфидных мостика. Домен b1b2 гомологичен факторам коагуляции V и VIII. Центральная часть домена обозначается как MAM вследствие гомологии с меприном, A5 и рецепторными μ-белками тирозинфосфатазы. Домены a1a2 и b1b2 ответственны за связывание лиганда, тогда как домен c имеет критическое значение для гомодимеризации или гетеродимеризации. Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:18069-76; He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-51.

Терминологическое определение "опосредованная нейропилином биологическая активность" относится, в целом, к физиологическим или патологическим явлениям, в которых нейропилин-1 и/или нейропилин-2 играют существенную роль. Не ограничивающими примерами такой активности являются направление аксонов в эмбриональный период развития нервной системы или при регенерации нейронов, ангиогенез (включая сосудистое моделирование), туморогенез и метастазирование опухолей.

Термин "антитело" употребляется в самом широком смысле и специфически охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при том условии, что они проявляют желательную биологическую активность.

Термин "моноклональное антитело" в настоящем документе относится к антителу, полученному из совокупности, по существу, однородных антител, т.е. индивидуальные антитела, содержащиеся в общей совокупности, идентичны за исключением возможных спонтанных мутаций, которые могут быть представлены в минимальном количестве. Моноклональные антитела высоко специфичны, будучи направленными против одного единственного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность традиционным (поликлональным) препаратам антител, которые в типичном случае включают разные антитела, направленные против разных детерминантов (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одного детерминанта или антигена. Модификатор "моноклональный(ое)" указывает на характер антитела, которое получено из, по существу, однородной совокупности антител и не должно конструироваться, то есть не требовать выработки каким-либо особым способом. Например, моноклональные антитела, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены способом гибридомы, впервые описанным в ссылке Kohler et al. (1975) Nature 256:495, или могут быть получены с применением методов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из фаговых библиотек антител, например, с использованием методик, описанных в ссылках Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 и Marks et al. (1991) J Mol. Biol. 222:581-597.

В этом описании моноклональные антитела специфически включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от конкретного биологического вида либо принадлежащих к особому классу или подклассу антител, наряду с тем, что остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от другого биологического вида либо принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител при том условии, что они проявляют желательную биологическую активность (патент США № 4816567 и ссылка Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).

"Гуманизированные" формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, извлеченную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентные антитела), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента замещены остатками из гипервариабельной области биологического вида, отличного от человека (донорские антитела), например мыши, крысы, кролика или нечеловекообразного примата, при том условии, что они обладают желательной специфичностью, аффинностью и производительностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека замещены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации осуществляют для того, чтобы дополнительно повысить рабочую производительность антитела. Обычно гуманизированное антитело содержит, по существу, все или, по меньшей мере, один, а в типичном случае два вариабельных домена, в которых все или, по существу, все гипервариабельные петли соответствуют таковым в иммуноглобулине нечеловеческого происхождения, а все или, по существу, все области FR являются участками последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может необязательно содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), в типичном случае происходящего из иммуноглобулина человека. Для получения более подробных сведений смотри ссылки Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329 и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

"Видозависимое антитело" это такое антитело, которое обладает более сильной аффинностью связывания с антигеном первого биологического вида млекопитающего по сравнению с гомологом этого антигена от второго биологического вида млекопитающего. В норме видозависимое антитело "специфически связывается" с антигеном человека (то есть обладает величиной аффинности связывания (K_d) не более чем приблизительно, 1×10^-7M, предпочтительно, не более чем приблизительно 1×10^-8M, наиболее предпочтительно, не более чем приблизительно 1×10^-9M), но обладает аффинностью связывания с гомологом антигена от второго, отличного от человека, биологического вида млекопитающего, которая, по меньшей мере, в 50 раз или, по меньшей мере, в 500 раз или, по меньшей мере, в 1000 раз слабее его аффинности связывания с антигеном человека. Видоспецифическим антителом может быть любое из антител разных типов, определенных выше, но, предпочтительно, это может быть гуманизированное антитело или антитело человека.

В настоящем документе термин "мутант антитела" или "вариант антитела" относится к варианту аминокислотной последовательности видозависимого антитела, в котором были модифицированы один или более аминокислотных остатков видозависимого антитела. Такие мутанты обязательно имеют менее 100% идентичности или сходства последовательности с видозависимым антителом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутант антитела имеет аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности вариабельного домена или тяжелой, или легкой цепи видозависимого антитела (либо сходна с ней), по меньшей мере, на 75%, предпочтительнее, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95%. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется здесь как процентная доля аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны (т.е. точно совпадают) или сходны (т.е. являются аминокислотными остатками из той же группы на основе общих свойств боковой цепи, смотри ниже) с остатками видоспецифического антитела после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внесения «пропусков» для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Никакие из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или инсерций в последовательности антитела за пределами вариабельного домена не должны истолковываться как влияющие на идентичность или сходство последовательности.

"Выделенное" антитело представляет собой такое антитело, которое было идентифицировано и отделено от и/или восстановлено из компонентов его природного окружения. Загрязняющими компонентами из природного окружения антитела являются такие материалы, которые служат препятствием для его диагностического или лечебного применения: они могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело будет очищено (1) более чем до 95% по весу антитела, определяемому по методу Лоури или, наиболее предпочтительно, более чем до 99% по весу, (2) в такой степени, которая достаточна для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, с применением секвенатора с вращающимся стаканом или (3) до гомогенности способом SDS-PAGE в редуцирующих или нередуцирующих условиях с применением окрашивания кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в пределах рекомбинантных клеток, поскольку в этом случае не будет представлен, по меньшей мере, один компонент природного окружения антитела. Однако обычно выделенное антитело будет получено с применением, по меньшей мере, одного этапа очистки.

В настоящем документе терминологическое определение "вариабельный домен антитела" относится к частям легких и тяжелых цепей молекул антитела, которые включают аминокислотные последовательности гипервариабельных областей (CDR, то есть CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасных областей (FR). Аббревиатура V_H относится к вариабельному домену тяжелой цепи. Аббревиатура V_L относится к вариабельному домену легкой цепи. В соответствии со способами, использованными в этом изобретении, аминокислотные положения, приписанные к CDR и FR, могут быть определены по Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991)). Нумерация аминокислот в антителах или антигенсвязывающих фрагментах также проводится в соответствии с классификацией Kabat.

В настоящем документе термин "гипервариабельные области" (CDR, то есть CDR1, CDR2 и CDR3) относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которых необходимо для связывания антигена. Каждый типичный вариабельный домен имеет три участка CDR, идентифицированных как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждый гипервариабельный участок может содержать аминокислотные остатки из "определяющей комплементарность области" по Kabat (то есть приблизительно остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи. Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (то есть приблизительно остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи. Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). В некоторых случаях гипервариабельный участок может включать аминокислоты как из области CDR по определению Kabat, так и из гипервариабельной петли. Например, CDRH1 тяжелой цепи антитела 4D5 включает аминокислоты с 26 по 35.

"Каркасные области" (далее FR) представлены другими остатками вариабельного домена по сравнению с остатками CDR. Каждый типичный вариабельный домен имеет четыре FR, идентифицированных как FR1, FR2, FR3 и FR4. При определении CDR по Kabat остатки FR легкой цепи приблизительно позиционируются как остатки 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4) в легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи приблизительно позиционируются как остатки 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) в тяжелой цепи. Если CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, то остатки FR легкой цепи приблизительно позиционируются как остатки 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи приблизительно позиционируются как остатки 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в тяжелой цепи. В некоторых случаях, когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по определению Kabat, так и из гипервариабельной петли, остатки FR будут скорректированы соответствующим образом. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты H26-H35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1-25, а остатки FR2 - в положениях 36-49.

В настоящем документе терминологическое определение "набор кодона" относится к набору разных последовательностей триплета нуклеотидов, кодирующего желательные варианты аминокислот. Олигонуклеотидный набор можно синтезировать, например, посредством твердофазного синтеза, включая те последовательности, которые представляют всевозможные комбинации нуклеотидных триплетов, содержащиеся в наборе кодона и будут кодировать желательную группу аминокислот. Стандартной формой обозначения кодона является код IUB (Международного биохимического союза), который известен в данной области техники и будет описан здесь. Типичный набор кодона представлен 3 заглавными (прописными) буквами, набранными курсивом, например, NNK, NNS, XYZ, DVK и т.п. Таким образом, в настоящем документе понятие "неслучайный набор кодона" относится к набору кодона, который кодирует избранные аминокислоты, которые частично, или, предпочтительно, полностью удовлетворяют критериям выбора аминокислот, как это описано в настоящем документе. Синтез олигонуклеотидов с подобранной "вырожденностью" в определенных положениях хорошо известен в данной области техники, например подход TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Такие олигонуклеотидные наборы, содержащие определенные наборы кодона, можно синтезировать, используя промышленные синтезаторы нуклеиновых кислот (например, от компании Applied Biosystems, Фостер Сити, штат Калифорния), или закупить в готовом виде (например, от компании Life Technologies, Роквилл, штат Мэриленд). Следовательно, синтезированный олигонуклеотидный набор, содержащий особый набор кодона, в типичном случае будет включать множество олигонуклеотидов с разными последовательностями, причем различия устанавливаются набором кодона в пределах общей последовательности. При использовании в соответствии с настоящим изобретением олигонуклеотиды имеют последовательности, которые позволяют им гибридизироваться с шаблоном нуклеиновых кислот вариабельного домена, а также могут, хотя и не обязательно, включать сайты рестрикционных ферментов, полезные, например, в целях клонирования.

Фрагмент "Fv" представляет собой такой фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера вариабельных доменов одной тяжелой и одной легкой цепи, находящихся в тесной ассоциации, которая по своей природе может быть ковалентной, например, в scFv. Для этой конфигурации характерно, что три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя сайт связывания антигена на поверхности димера V_H-V_L. Все вместе шесть CDR или их подмножество придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных по антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя, как правило, с меньшей аффинностью, чем полный сайт связывания.

Фрагмент "Fab" содержит вариабельный и константный домен легкой цепи, а также вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты антитела F(ab')₂ содержат пару фрагментов Fab, которые, как правило, ковалентно связаны друг с другом в районе своих карбоксильных концов шарнирными цистеинами. В данной области техники также известны другие химические связи между фрагментами антител.

Фрагменты антитела "одноцепочечный Fv" или "scFv" содержат домены антитела V_H и V_L, причем эти домены представлены в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит между доменами V_H и V_L полипептидный линкер, который дает возможность scFv сформировать желательную структуру для связывания антигена. Обзор по scFv смотри в ссылке Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "димерные антитела" относится к маленьким фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H и V_L). Посредством применения линкера, который слишком короток для того, чтобы допустить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены принудительно спариваются с комплементарными доменами другой цепи, благодаря чему создаются два антигенсвязывающих сайта. Димерные антитела более подробно описаны, например, в ссылках EP 404097, WO 93/11161 и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.

Выражение "линейные антитела" относится к антителам, описанным в ссылке Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.

В настоящем документе термин "библиотека" относится к множеству последовательностей антител или фрагментов антител (например, полипептидов по изобретению) или нуклеиновых кислот, которые кодируют эти последовательности, причем указанные последовательности различаются по комбинации вариантных аминокислот, вводимых в эти последовательности в соответствии со способами, предлагаемыми изобретением.

"Фаговый дисплей" представляет собой методику, посредством которой вариантные полипептиды демонстрируются как гибридные белки, слитые, по меньшей мере, с частью оболочечного белка на поверхности фага, например нитевидного фага, фаговых частиц. Возможность полезного применения фагового дисплея основана на том факте, что большие библиотеки рандомизированных вариантов белка можно быстро и эффективно сортировать на те последовательности, которые связываются с целевым антигеном на высоком уровне аффинности. Демонстрация пептидных и белковых библиотек на фаге была использована для скрининга миллионов полипептидов на специфические свойства связывания. Способы поливалентного фагового дисплея были использованы для демонстрации мелких случайных пептидов и мелких белков через их слияние или с геном III, или с геном VIII нитевидного фага. Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362 и цитируемые там ссылки. При моновалентном фаговом дисплее белковая или пептидная библиотека, гибридизированная с геном III или его частью, экспрессируется на низком уровне в присутствии белка дикого типа, кодируемого геном III, так, что фаговые частицы демонстрируют одну копию гибридизированных белков или не демонстрируют ни одной копии. Эффекты авидности ограничены по сравнению с поливалентным фагом так, что можно использовать сортировку на основе природной аффинности к лиганду и фагемидные векторы, которые упрощают манипуляции с ДНК. Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216.

"Фагмида" представляет собой плазмидный вектор, имеющий бактериальное происхождение репликации, например ColE1, и копию межгенной области бактериофага. Фагмиду можно использовать на любом известном бактериофаге, включая нитевидный бактериофаг и ламбдовидный бактериофаг. Плазмида также, как правило, содержит селектируемый маркер устойчивости к антибиотикам. Сегменты ДНК, клонированные в этих векторах, можно размножать как плазмиды. Когда клетки, содержащие эти векторы, оснащаются всеми генами, необходимыми для выработки фаговых частиц, способ репликации плазмиды изменяется на репликацию по типу "катящегося кольца", благодаря которой создаются копии одной нити плазмидной ДНК с последующей упаковкой фаговых частиц. Фагмида может образовывать инфекционные или неинфекционные фаговые частицы. Этот термин включает фагмиды, которые содержат ген оболочечного белка фага или его фрагмент, сцепленный с геном гетерологичного пептида по типу слияния генов, благодаря чему гетерологичный полипептид демонстрируется на поверхности фаговой частицы.

Термин "фаговый вектор" означает двунитевую репликативную форму бактериофага, содержащего гетерологичный ген и способного к репликации. Фаговый вектор имеет фаговое происхождение репликации, что позволяет фагу реплицироваться и образовывать фаговые частицы. Предпочтительным фагом является нитевидный бактериофаг, например фаг M13, fl, fd, Pf3, или их производные, либо ламбдовидный фаг, например ламбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 и т.д., или их производные.

В настоящем документе терминологическое определение "доступное для растворителя положение" относится к положению аминокислотного остатка в вариабельных областях тяжелых и легких цепей исходного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, подлежащего определению, которое основано на структуре, ансамбле структур и/или смоделированной структуре антитела или антигенсвязывающего фрагмента и является потенциально доступным для растворителя и/или для контракта с молекулой, например, антителоспецифического антигена. В типичном варианте такие положения находятся в CDR и на внешней поверхности белка. Доступные для растворителя положения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как это указано здесь, можно определить с применением любого из множества алгоритмов, известных в данной области техники. Предпочтительно, чтобы доступные для растворителя положения определялись с использованием координат из 3-мерной модели антитела, а также с применением компьютерной программы, например программы InsightII (Accelrys, Сан-Диего, штат Калифорния). Доступные для растворителя положения можно также определить, применяя алгоритмы, известные в данной области техники (например, Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 и Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). Определение доступных для растворителя положений можно провести, используя программное обеспечение, пригодное для моделирования белков, и 3-мерную структурную информацию, полученную для антитела. Программное обеспечение, которое можно использовать в этих целях, включает программу SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Обычно и предпочтительно, если алгоритм (программа) требует от пользователя входных параметров размера, то "размер" зонда, который используется в расчетах, устанавливают приблизительно на уровне радиуса 1,4 ангстрема или менее. В дополнение к этому, способы определения доступных для растворителя участков и областей с применением программного обеспечения для персональных компьютеров были описаны в ссылке Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4):377-386.

"Ангиогенный фактор или агент" представляет собой фактор роста, который стимулирует развитие кровеносных сосудов, например способствует ангиогенезу, росту эндотелиальных клеток, стабильности кровеносных сосудов и/или васкулогенезу и т.д. Например, ангиогенные факторы включают, но, не ограничиваясь ими, VEGF и членов семейства VEGF, PIGF, семейство PDGF, семейство фактора роста фибробластов (FGF), лиганды TIE (ангиопоэтины), эфрины, Del-1, факторы роста фибробластов: кислотный (aFGF) и щелочной (bFGF), фоллистатин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), фактор роста гепатоцитов (HGF)/рассеивающий фактор (SF), интерлейкин-8 (IL-8), лептин, мидкин, нейропилины, плацентарный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста, особенно PDGF-BB или бета-PDGFR, плейотрофин (PTN), програнулин, пролиферин, трансформирующий альфа-фактор роста (TGF-альфа), трансформирующий бета-фактор роста (TGF-бета), альфа-фактор опухолевого некроза (TNF-альфа) и т.д. Они также включают факторы, которые ускоряют заживление ран, например гормон роста, инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и членов его семейства, а также альфа-TGF и бета-TGF. Смотри, например, Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (например, таблица 1, в которой перечислены известные ангиогенные факторы), и Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.

Термин "средство против ангиогенеза" или "ингибитор ангиогенеза" относится к веществам небольшого молекулярного веса (полинуклеотиду, полипептиду, выделенному белку, рекомбинантному белку, антителу), а также к их конъюгатам или гибридным белкам, которые подавляют ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов прямым или непрямым образом. Следует понимать, что термин "средство против ангиогенеза" охватывает те средства, которые связывают и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, средством против ангиогенеза является антитело или другой антагонист ангиогенного средства, как таковое было определено выше, например антитела к VEGF-A или к рецептору VEGF-A (например, рецептор KDR или рецептор Flt-I), ингибиторы анти-PDGFR, например, Gleevec™ (иматиниба мезилат). Средства против ангиогенеза также включают природные ингибиторы ангиогенеза, например ангиостатин, эндостатин и т.д. Смотри, например, Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39, Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (например, таблица 3, в которой перечислены способы противоангиогенной терапии при злокачественной меланоме), Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364, Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (например, таблица 2, в которой перечислены известные противоангиогенные факторы), а также Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (например, таблица 1, в которой перечислены средства против ангиогенеза, проходящие оценку в клинических испытаниях).

Термин "VEGF" или "VEGF-A" в настоящем документе относится к клеточному фактору роста эндотелия сосудов человека, состоящему из 165 аминокислот, а также к родственным клеточным факторам роста эндотелия сосудов человека, состоящим из 121, 189 и 206 аминокислот, как это описано в ссылках Leung et al. (1989) Science 246:1306 и Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806, наряду с их встречающимися в природе аллельными и процессированными формами. Термин "VEGF" также относится к вариантам VEGF от других биологических видов, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF от конкретного биологического вида обозначается такими терминами как hVEGF для VEGF человека, mVEGF для мышиного VEGF и т.д. Термин "VEGF" также используется для ссылки на усеченные формы полипептида, содержащего аминокислоты с 8-й по 109-ю или с 1-й по 109-ю клеточного фактора роста эндотелия сосудов человека, состоящего из 165 аминокислот. Ссылку на любую из таких форм VEGF в настоящей заявке можно идентифицировать, например, по аббревиатурам "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" или "VEGF₁₆₅." Положения аминокислот в "усеченном" природном VEGF пронумерованы так, как это указано в природной последовательности VEGF. Например, положение 17-й аминокислоты (метионина) в усеченном природном VEGF также является положением 17 (метионин) в природном (полноразмерном) VEGF. Усеченный природный VEGF имеет аффинность связывания с рецепторами KDR и Flt-1, сравнимую с природным (полноразмерным) VEGF.

"Антитело против VEGF" представляет собой антитело, которое связывается с VEGF с достаточно высокой аффинностью и специфичностью. В предпочтительном варианте антитело против VEGF по изобретению используется как терапевтическое средство, нацеленное в качестве помехи на заболевания или состояния, в которые вовлечена активность VEGF. Антитело против VEGF обычно не связывается ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF. Предпочтительное антитело против VEGF представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против VEGF A4.6.1, продуцируемое гибридомой ATCC HB 10709. Более предпочтительное антитело против VEGF представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, генерированное в соответствии со ссылкой Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включая, но, не ограничиваясь им, антитело, известное под названием бевацизумаб (BV; Avastin™).

Антитело против VEGF "бевацизумаб (BV)", также известное как "rhuMAb VEGF" или "Avastin^®, представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, генерированное в соответствии со ссылкой Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антигенсвязывающие гипервариабельные области из мышиного моноклонального антитела против hVEGF A4.6.1, которое блокирует связывание VEGF человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, получены из IgG1 человека, а приблизительно 7% этой последовательности происходят из мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 Да и гликозилирован.

Термин "антагонист VEGF" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, подавлять, аннулировать, уменьшать проявления активностей VEGF или служить помехой для проявлений активности VEGF, включая, но, не ограничиваясь им, связывание VEGF с одним или более рецепторов. Антагонисты VEGF включают, без ограничений, антитела против VEGF и их антигенсвязывающие фрагменты, рецепторные молекулы и производные, которые специфически связываются с VEGF, тем самым блокируя его связывание с одним или более рецепторов, антитела против рецепторов VEGF и антагонисты рецепторов VEGF, такие как мелкие молекулы-ингибиторы тирозинкиназ VEGFR. Термин "антагонист VEGF" в настоящем документе специфически включает молекулы, в том числе антитела, фрагменты антител, другие связывающие полипептиды, пептиды и низкомолекулярные непептидные молекулы, которые связываются с нейропилином-1 и/или нейропилином-2 (Nrp-1 и/или Nrp-2) и способны нейтрализовать, блокировать, ингибировать, аннулировать, уменьшить проявления активности VEGF или препятствовать проявлениям активности VEGF, включая, но, не ограничиваясь ими, антитела против Nrp1 и против Nrp2 и антитела, перекрестно реагирующие с Nrp1 и Nrp2, при том условии, что они способны нейтрализовать, блокировать, ингибировать, аннулировать, уменьшать проявления активности VEGF или препятствовать проявлениям активности VEGF. Таким образом, термин "проявления активности VEGF" специфически включает опосредованные нейропилином проявления биологической активности VEGF (как это было определено здесь выше).

Термин "антагонисты семафорина" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, подавлять, аннулировать, уменьшать проявления активности семафорина или препятствовать проявлениям активности семафорина, включая, но, не ограничиваясь им, связывание семафорина с одним или более его рецепторов. Антагонисты семафорина включают, без ограничений, антитела против семафорина и их антигенсвязывающие фрагменты, рецепторные молекулы и производные, которые специфически связываются с VEGF, тем самым блокируя его связывание с одним или более рецепторов, антитела против рецепторов семафорина и антагонисты рецепторов семафорина, такие как мелкие молекулы-ингибиторы семафоринов. Термин "антагонист семафорина" в настоящем документе специфически включает молекулы, включая антитела, фрагменты антител, другие связывающие полипептиды, пептиды и низкомолекулярные непептидные молекулы, которые связываются с нейропилином-1 и/или нейропилином-2 (Nrp-1 и/или Nrp-2) и способны нейтрализовать, блокировать, ингибировать, аннулировать, уменьшить проявления активности семафорина или препятствовать проявлениям активности семафорина, включая, но, не ограничиваясь ими, антитела против Nrp1 и против Nrp2 и антитела, перекрестно реагирующие с Nrp1 и Nrp2, при том условии, что они способны нейтрализовать, блокировать, ингибировать, аннулировать, уменьшать проявления активности семафорина или препятствовать проявлениям активности семафорина. Таким образом, термин "проявления активности семафорина" специфически включает опосредованные нейропилином проявления биологической активности семафоринов класса 3 (как это было определено здесь выше). Такие проявления биологической активности включают, например, ингибиторный эффект в отношении роста нейритов (аксонов) в эмбриональный период развития нервной системы, а также при регенерации нейронов.

Термин "лечение" относится как к терапевтическим воздействиям, так и к профилактическим или превентивным мероприятиям. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают как тех, кто уже поражен заболеванием, так и тех, у кого необходимо предупредить развитие заболевания.

"Нарушение" представляет собой любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения. Например, нарушения наблюдаются у млекопитающих, которые страдают аномалиями ангиогенеза (избыточным, неадекватным или неуправляемым ангиогенезом) или аномалиями проницаемости сосудов либо нуждаются в профилактике таких аномалий. Эта группа включает хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к нарушениям/заболеваниям, о которых идет речь. Неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению в соответствии с данным изобретением, включают злокачественные и доброкачественные опухоли, нелейкемические и лимфоидные злокачественные заболевания, нейронные, глиальные, астроцитарные, гипоталамические железистые, макрофагольные, эпителиальные, стромальные и связанные с бластоцелью нарушения, а также воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения.

Аномальный ангиогенез встречается тогда, когда новые кровеносные сосуды растут избыточно, недостаточно или неадекватно (например, локализация, время начала ангиогенеза нежелательны с медицинской точки зрения), что происходит или в состоянии заболевания, или в состоянии предрасположенности к заболеванию. Избыточный, неадекватный или неуправляемый ангиогенез встречается тогда, когда происходит рост новых кровеносных сосудов, дающий вклад в ухудшение болезненного состояния или приводящий к болезненному состоянию, такому как рак, особенно васкуляризированные солидные опухоли и метастатические опухоли (включая рак толстой кишки, рак легких (особенно мелкоклеточный рак легких) или рак предстательной железы), заболевания, обусловленные глазной неоваскуляризацией, особенно диабетическая слепота, ретинопатии, первичная диабетическая ретинопатия или возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), псориаз, псориатический артрит, гемангиобластома, например гемангиома, воспалительные заболевания почек, например гломерулонефрит, особенно мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитический уремический синдром, диабетическая нефропатия или гипертензивный нефросклероз, различные воспалительные заболевания, такие как артрит, особенно ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, саркоидоз, артериосклероз и заболевания, встречающиеся после трансплантации, эндометриоз, хроническая астма и еще более 70 других патологических состояний. Новые кровеносные сосуды могут питать болезненные (измененные патологией) ткани, разрушать нормальные ткани, а в случае рака новые кровеносные сосуды дают возможность опухолевым клеткам осуществить эвакуацию в систему кровообращения и попасть в другие органы (опухолевые метастазы). Недостаточный ангиогенез встречается тогда, когда происходит неадекватно уменьшенный рост кровеносных сосудов, дающий вклад в ухудшение болезненного состояния, например, при таких патологических состояниях как болезнь коронарных артерий, инсульт и медленное заживление ран. Кроме того, язвы, инсульты и сердечные приступы могут развиваться как результат отсутствия ангиогенеза, необходимого в норме для естественного заживления повреждений. Настоящее изобретение рассматривает лечение таких больных, у которых повышен риск развития вышеупомянутых заболеваний/патологических состояний.

Другие больные, которые являются кандидатами на получение антител или других молекул, предлагаемых этим изобретением, уже больны или имеют повышенный риск развития таких заболеваний/нарушений как аномальная пролиферация сосудисто-волокнистой ткани, красные угри, синдром приобретенного иммунодефицита, закупорка артерии, атопический кератит, бактериальные язвы, болезнь Бехчета, гематогенные опухоли, обструктивное заболевание сонных артерий, хориоидальная неоваскуляризация, хроническое воспаление, хроническая отслойка сетчатки, хронический увеит, хронический витрит, переутомление глаз при ношении контактных линз, отторжение трансплантата роговицы, неоваскуляризация роговицы, неоваскуляризация трансплантата роговицы, болезнь Крона, болезнь Илза, эпидемический кератоконъюнктивит, грибковые язвы, инфекции вирусом простого герпеса, инфекции вирусом опоясывающего лишая, синдромы повышенной вязкости (крови), саркома Капоши, лейкоз, жировая дегенерация, лаймская болезнь, краевой кератолиз, язва Мурена, микобактериальные инфекции помимо лепры, миопия, неоваскулярная болезнь глаз, ямки диска зрительного нерва, синдром Ослера-Вебера (Осдера-Вебера-Рендю), остеоартрит, болезнь Педжета, pars planitis (хронический циклит или периферический увеит), пемфигоид, фликтенулезный конъюнктивит, полиартериит, осложнения после лазерных процедур, протозойные инфекции, эластическая псевдоксантома, птеригиум при сухом кератите, радиальная кератотомия, неоваскуляризация сетчатки, ретинопатия недоношенных, ретролентальные фибродисплазии, саркоид, склерит, серповидно-клеточная анемия, синдром Сьегрена (Шегрена), солидные опухоли, болезнь Старгардта, болезнь Стивена-Джонсона, верхний лимбический кератит, сифилис, системная (красная) волчанка, краевая дегенерация Терьена, токсоплазмоз, травма, опухоли при саркоме Юинга, опухоли при нейробластоме, опухоли при остеосаркоме, опухоли при ретинобластоме, опухоли при рабдомиосаркоме, язвенный колит, закупорка вен, дефицит витамина A и саркоидоз (гранулематоз) Вегенера, нежелательный ангиогенез при диабете, паразитарные заболевания, аномальное заживление ран, гипертрофия после хирургического вмешательства, повреждение или травма, подавление роста волос, подавление овуляции и образования желтого тела, подавление имплантации и угнетение развития эмбриона в матке.

Способы терапии, направленные против ангиогенеза, полезны при общем лечении отторжения трансплантата, воспаления легких, нефротического синдрома, преэклампсии, выпота в перикард, например, при эксудативном перикардите, и плеврального выпота, заболеваний и расстройств, характеризующихся нежелательной сосудистой проницаемостью, например отека, связанного с опухолями мозга, асцитов при злокачественных заболеваниях, синдрома Мейгса, воспаления легких, нефротического синдрома, выпота в перикард, плеврального выпота, проницаемости, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями, например с состоянием после перенесенного инфаркта миокарда, инсультов и т.п.

Другие заболевания, зависимые от ангиогенеза, в соответствии с настоящим изобретением включают ангиофиброму (аномальное скопление крови из сосудов, склонных к кровотечению), неоваскулярную глаукому (рост кровеносных сосудов в глазу), артериовенозные пороки развития (аномальное сообщение между артериями и венами), несрастающиеся переломы (переломы, которые не заживают), атеросклеротические бляшки (затвердение артерий), пиогенная гранулема (частое повреждение кожи, состоящее из кровеносных сосудов), склеродермию (форму заболевания соединительной ткани), гемангиому (опухоль, состоящую из кровеносных сосудов), трахому (основную причину слепоты в странах третьего мира), гемофилическую артропатию, сосудистые спайки и гипертрофические рубцы (аномальное образование рубцов).

Термины "рак" и "раковый" относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое типично характеризуется неуправляемым ростом клеток. Примеры рака включают, но, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раков включают плоскоклеточный рак, рак легких (включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, гастральный рак или рак желудка (включая желудочно-кишечный рак), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (включая низкозлокачественную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL), мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL, фолликулярную/средней злокачественности NHL, диффузную NHL средней злокачественности, высокозлокачественную лимфобластную NHL, высокозлокачественную мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами клеток, NHL с массивным поражением, лимфому из клеток мантии, лимфому, связанную со СПИДом, и макроглобулинемию Вальденстрема), хронический лимфолейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), лейкоз ворсистых клеток, хронический миелобластный лейкоз и послетрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), а также аномальную сосудистую пролиферацию, связанную с факоматозами, отек (например, связанный с опухолями мозга) и синдром Мейгса.

Термин "противонеопластическая композиция" относится к композиции, полезной для лечения рака и содержащей, по меньшей степени одно активное терапевтическое средство, например "противораковое средство". Примеры терапевтических средств (противораковых средств) включают, но, не ограничиваясь ими, химиотерапевтические средства, ингибиторы роста (клеток), цитотоксические средства, средства, применяемые в лучевой терапии, средства против ангиогенеза, апоптотические средства, антитубулиновые средства и другие средства для лечения рака, такие как антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™), ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, Gleevec™ (иматиниба мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или более следующих целей: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA или рецептор(ы) VEGF, TRAIL/Apo2 и другие биологически активные и органические химические средства и т.д. В изобретение также включены их комбинации.

Термин "цитотоксическое средство" в настоящем документе относится к веществу, которое подавляет или предупреждает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. По своему предназначению термин охватывает радиоактивные изотопы (например, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ и Re¹⁸⁶), химиотерапевтические средства и токсины, в частности ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения либо их фрагменты.

"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, полезное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают химические соединения, полезные для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают такие алкилирующие агенты как тиотепа и CYTOXAN^® циклофосфамид, такие алкилсульфонаты как бусульфан, импросульфан и пиросульфан, такие азиридины как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа, этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин, ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон), камптотецин (включая синтетический аналог топотекан), бриостатин, каллистатин, CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин), криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8), доластатин, дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1), элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, такие азотистые иприты как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт, такие нитрозомочевины как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин, такие антибиотики как энедииновые антибиотики, например калихеамицин, особенно калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew (1994) Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186), динемицин, включая динемицин A, такие бисфосфонаты как клодронат, эсперамицин, а также неокарциностатина хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN^® доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубуцин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, такие митомицины как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, такие антиметаболиты как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU), такие аналоги фолиевой кислоты как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, такие аналоги пуринов как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, такие аналоги пиримидинов как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, такие андрогены как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, такие антиадреналовые средства как аминоглутетимид, мимотан, трилостан, такой дополнитель фолиевой кислоты как фролиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамида гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиниум ацетат, эпотилон, этоглуцид, галлия нитрат, гигроксимочевина, лентинан, лонидаинин, такие майтансиноиды как майтансин и ансамитоцины, митогуазон, митоксантрон, мопиданмол, нитраэрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, комплекс полисахаридов PSK^® (JHS Natural Products, Юджин, штат Орегон), разоксан, ризоксин, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, 2,2',2"-трихлортриэтиламин, трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин), уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, арабинозид ("Ara-C"), циклофосфамид, тиотепа, таксоиды, например TAXOL^® паклитаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Принсттон, штат Нью-Джерси), свободный от кремофоров ABRAXANE™, альбумин-инженерная конструкция наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Шомберг, штат Иллинойс) и TAXOTERE^® доксетаксел (Rhone-Poulenc Rorer, Антони, Франция), хлоранбуцил, GEMZAR^® гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат, такие аналоги платины как цисплатин и карбоплатин, винбластин, платина, этопозид (VP-16), ифосфамид, митоксантрон, винкристин, NAVELBINE^® винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, иринотекан, (кампомстар, CPT-11) (включая схему лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином), ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин (DMFO), такие ретиноиды как ретиноевая кислота, капецитабин, комбретастатин, лейковорин (LV), оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX), ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™)) и VEGF-A, которые уменьшают клеточную пролиферацию, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных веществ.

В это определение также включены антигормональные средства, которые действуют, регулируя или подавляя воздействие гормонов на опухоли, в частности, антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая препарат тамоксифена NOLVADEX^®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON-торемифен, ингибиторы ароматазы, которые подавляют фермент ароматазу, регулирующую выработку эстрогена в надпочечниках, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, MEGASE^® мегестрол ацетат, AROMASIN^® экземестан, форместан, фадрозол, RIVISOR^® ворозол, FEMARA^® летрозол и ARIMIDEX^® анастрозол, а также такие антиандрогены как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин, а также троксацитабин (аналог 1,3-диоксолан нуклеозида цитозина), антисмысловые олигонуклеотиды, особенно такие, которые подавляют экспрессию генов в сигнальных путях, вовлеченных в нарушенную пролиферацию клеток, например PKC-альфа, Raf и H-Ras, такие рибозимы как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME^®) и ингибитор экспрессии HER2, такие вакцины как вакцины для генотерапии, например вакцина ALLOVECTIN^®, вакцина LEUVECTIN^® и вакцина VAXID^®, PROLEUKIN^® rIL-2, ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN^®, ABARELIX^® rmRH, винорелбин и эсперамицины (см. патент США № 4675187), а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных выше веществ.

Термин "пролекарство" в настоящем документе относится к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества, которая менее цитотоксична для опухолевых клеток по сравнению с исходным лекарственным веществом и способна к ферментативной активации или превращению в более активную исходную лекарственную форму. Смотри, например, Wilman (1986) "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast и Stella et al. (1985). "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al, (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Продукты, предлагаемые этим изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, D-аминокислотные модифицированные пролекарства, гликозилированные пролекарства, β-лактамсодержащие пролекарства, факультативно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или факультативно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть преобразованы в более активные свободные цитотоксические лекарства. Примеры цитотоксических лекарств, которые могут быть дериватизированы в пролекарственную форму для применения в этом изобретении, включают, но не ограничиваясь ими, те химиотерапевтические средства, которые были описаны выше.

Заболевания и состояния, которые можно лечить антагонистами семафорина, включают, без ограничений, неврологические заболевания и заболевания, требующие нейрорегенерации или улучшающиеся от нейрорегенерации.

"Низкомолекулярная молекула" определяется здесь как молекула, имеющая приблизительный молекулярный вес менее 500 дальтонов.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой такую молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, по меньшей мере, от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или от того окружения, с которыми она может быть обнаружена в природе. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекул нуклеиновой кислоты, существующих в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которая обычно экспрессирует антитело, например молекула нуклеиновой кислоты находится в другом хромосомном положении, нежели молекула, встречающаяся в природных клетках.

Выражение "регуляторные последовательности" относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, которые пригодны для прокариот, включают, например, промотор, необязательно последовательность оператора, а также сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота "функционально связана", если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида. Промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности, а сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Обычно "функциональная связь" означает, что связанные последовательности ДНК смежны, а в случае секреторного лидера смежны и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Сцепление осуществляется посредством сшивания в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов нет, то в соответствии с общепринятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

В настоящем документе терминологические понятия "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" употребляются взаимозаменяемо, причем все такие обозначения включают потомство. Таким образом, понятия "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают первичные клетки-объекты и полученные из них культуры без учета числа переносов. Также следует понимать, что все потомство может не быть полностью идентичным по информационному содержанию ДНК вследствие умышленных или неумышленных мутаций. Включается мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, как и те, которые были выявлены при скрининге первоначальных трансформированных клеток. В тех местах, где запланированы четкие обозначения, это будет ясно из контекста.

Способы осуществления изобретения

Основываясь на архитектуре и функциональных свойствах доменов, внеклеточные домены Nrps можно типично подразделить на три функциональные единицы: a1a2, b1b2 и c, представляющие их первичные области связывания семафорина, связывания VEGF и димеризации соответственно (Ellis, L.M., Mol Cencer Ther 5, 1099-107 (2006)). Хотя структурно-функциональные исследования позволяют очертить общие требования к доменам для функции нейропилина, молекулярные детали этих комплексов рецептор/лиганд остаются малопонятными. В настоящее время структурная информация о Nrp ограничена доменом b1b2 Nrp1 (Vander Kooi et al., выше; Lee, C. et al., J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)). Кристаллическая структура домена b1b2 Nrp1 в комплексе с тафтсином, тетрапептитдным гомологом C-конца VEGF₁₆₅, дала первую структурную информацию о взаимодействии Nrp с его партнером связывания VEGF (Vander Kooi, et al., выше; von Wronski, M.A., et al, J. Biol Chem 281, 5702-10 (2006)).

Настоящее изобретение предлагает такую кристаллическую структуру доменов a1a2b1b2 Nrp2 в комплексе с фрагментом Fab антитела, которая способна блокировать связывание Sema3, как с Nrp1, так и с Nrp2 in vitro. Также сравнены и противопоставлены структуры фрагментов a2b1b2 и b1b2 обеих изоформ Nrp. В дополнение к этому, также предложена и оценена структура домена b1 Nrp1, скомбинированного с фрагментом Fab недавно описанного антитела, полученного из фага, которая специфически подавляет связывание VEGF₁₆₅ с Nrp1 in vivo (Liang, W.C., et al., J Mol Biol 366, 815-29 (2007); Pan, Q et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007). Вместе эти структуры представляют детальную картину значительной части внеклеточного домена Nrp и предполагают модели для связывания VEGF и семафорина. Основываясь на димере Nrp2, представленном в двух разных кристаллических формах, предложен новый механизм димеризации Nrp и связывания лиганда.

Подробности кристаллографических исследований представлены в приведенных ниже примерах. Общие способы продукции антител против NRP описаны здесь ниже и в примере 1.

Продукция антител против NRP

Описанное здесь изобретение включает продукцию и применение антител против NRP. Типичные способы генерирования антител более подробно описаны в следующих разделах.

Антитела против NRP отобраны с применением антигена NRP (например, NRP1 и/или NRP2), полученного от разных биологических видов млекопитающих. Предпочтительным антигеном является NRP человека (hNRP). Однако в качестве антигена-мишени могут быть использованы NRP от других биологических видов, например мышиный NRP (mNRP). Антигены NRP разных биологических видов млекопитающих могут быть выделены из природных источников. В других вариантах осуществления изобретения антиген получают рекомбинантным способом или изготовляют другими синтетическими способами, известными в данной области техники.

Отобранное антитело обычно имеет достаточно сильную аффинность связывания с антигеном NRP. Например, антитело может связывать hNRP с величиной K_d не более чем приблизительно 5 нМ, предпочтительно, не более чем приблизительно 2 нМ, и более предпочтительно, не более чем приблизительно 500 нM. Аффинность антител можно определять анализом на основе поверхностного плазмонного резонанса, например, такого как анализ BIAcore, описанный в примерах, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и анализов на основе конкуренции (например, RIA).

Антитело также можно подвергать другим анализам на биологическую активность, например, чтобы оценить его эффективность в качестве лечебного средства. Такие анализы известны в данной области техники и зависят от целевого антигена, а также от предназначения антитела. Примеры включают ингибиторный анализ HUVEC (описанный в примерах ниже), анализы на подавление роста опухолевых клеток (например, описанного в документе WO 89/06692), анализы на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC) (патент США № 5500362), а также анализы на агонистическую активность или гемопоэз (смотри документ WO 95/27062).

Для скрининга на антитела, связывающиеся с конкретным эпитопом на представляющем интерес антигене, можно провести стандартный эпитоп-перекрестный конкурентный анализ, такой, как описано в ссылке Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). В альтернативном варианте можно провести эпитопное картирование, например, как это описано в ссылке Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, чтобы определить, связывает ли антитело представляющий интерес эпитоп.

Генерирование антител против NRP из синтетических библиотек фаговых антител

В предпочтительном варианте осуществления изобретения отбор антител против NRP проводят с применением подхода уникального фагового дисплея. Указанный подход включает генерирование синтетических библиотек фаговых антител на основе единственного шаблона каркасной области, конструирование достаточного разнообразия в пределах вариабельных доменов, отбор антител-кандидатов с высокой аффинностью к целевому антигену NRP и выделение отобранных антител.

Методические подробности способов фагового дисплея можно найти, например, в документе WO03/102157, опубликованном 11 декабря 2003 г.

В одном из аспектов библиотеки антител можно генерировать посредством мутирования доступных для растворителя и/или в высокой степени несходных положений, по меньшей мере, в одном CDR вариабельного домена антитела. Некоторые или все CDR можно мутировать, применяя описанные здесь способы. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным генерирование разнообразных библиотек антител посредством мутирования положений в CDRH1, CDRH2 и CDRH3 для формирования единой библиотеки или посредством мутирования положений в CDRL3 и CDRH3 для формирования единой библиотеки, или посредством мутирования положений в CDRL3 и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 для формирования единой библиотеки.

Библиотеку вариабельных доменов антител можно генерировать, например, получая мутации в доступных для растворителя и/или в высокой степени несходных положениях CDRH1, CDRH2 и CDRH3. Другую библиотеку такого рода можно генерировать, получая мутации в CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Эти библиотеки также можно использовать в сочетании друг с другом для генерирования связующих элементов с желательной аффинностью. Например, после одного или нескольких циклов отбора библиотек тяжелых цепей на связывание с целевым антигеном можно подставить библиотеку легких цепей в совокупность связующих элементов тяжелых цепей для последующих циклов отбора с целью повышения аффинности связующих элементов.

Предпочтительно, чтобы библиотека создавалась посредством замещения исходных аминокислот на другие (вариантные) аминокислоты в участке CDRH3 вариабельной области последовательности тяжелой цепи. Полученная в результате библиотека может содержать множество последовательностей антитела, причем разнообразие последовательностей, в основном, затрагивает участок CDRH3 в последовательности тяжелой цепи.

В одном из аспектов библиотеку создают в контексте последовательности гуманизированного антитела 4D5 или аминокислотной последовательности каркасной области гуманизированного антитела 4D5. Предпочтительно, чтобы для создания библиотеки было использовано замещение, по меньшей мере, остатков 95-100a в аминокислотной последовательности тяжелой цепи, кодируемых набором кодона DVK, причем набор кодона DVK используется для кодирования вариантных аминокислот в каждом из этих положений. В примерном варианте олигонуклеотидного набора, полезного для некоторых вариантов осуществления изобретения, библиотеку создают посредством замещения остатков 95-100a на аминокислоты, кодируемые наборами кодона как DVK, так и NNK. Примером олигонуклеотидного набора, который полезен для осуществления таких замещений, является последовательность (DVK)₆(NNK). Еще в одном варианте осуществления изобретения библиотеку создают посредством замещения, по меньшей мере, остатков 95-100a аминокислотами, кодируемыми наборами кодона как DVK, так и NNK. Примером олигонуклеотидного набора, который полезен для осуществления таких замещений, является последовательность (DVK)₅(NNK). Еще один пример олигонуклеотидного набора, который полезен для осуществления таких замещений, включает последовательность (NNK)₆. Другие примеры подходящих олигонуклеотидных последовательностей вполне может определить компетентный в данной области техники специалист, основываясь на описанных здесь критериях.

Еще в одном варианте осуществления изобретения различные конструкции CDRH3 используются для выделения высокоаффинных связующих элементов, а также для выделения связующих элементов к множеству эпитопов. Диапазон длины CDRH3, генерированного в этой библиотеке, обычно составляет от 11 до 13 аминокислот, хотя могут быть генерированы конструкции и другой длины. Применяя наборы кодона NNK, DVK и NVK, можно увеличить разнообразие H3 так же, как и более ограниченное разнообразие в N- и/или C-концевых участках.

Также можно генерировать разнообразие в CDRH1 и CDRH2. Конструкции разнообразия CDR-H1 и -H2 следуют стратегии нацеливания на имитацию природного репертуара антител, как это описано, с модификацией, которая сфокусирована на разнообразии, более близко соответствующем естественному разнообразию, чем предыдущее конструирование.

Для разнообразия CDRH3 можно по отдельности конструировать множественные библиотеки с различной длиной H3, а затем комбинировать их для отбора связующих элементов с целевыми антигенами. Множественные библиотеки можно объединять и сортировать, применяя способы отбора на твердофазной подложке и сортировки растворов, как это было описано ранее и будет описано здесь ниже. Можно использовать стратегии множественной сортировки. Например, одна из вариаций включает сортировку на цели, связанной с твердой опорой, и последующую сортировку на метку, которая может быть представлена на гибридном полипептиде (например, метка против gD), что сопровождается еще одной сортировкой на цели, связанной с твердой опорой. В альтернативном варианте библиотеки сначала можно сортировать на цели, связанной с твердой опорой, затем сортируют элюированные связующие элементы, применяя связывание в жидкой фазе с понижением концентрации целевого антигена. Использование комбинаций различных способов сортировки позволяет свести к минимуму отбор, ограничиваясь только высокоэкспрессированными последовательностями, и обеспечивает отбор значительного числа различных клонов с высокой аффинностью.

Из библиотек можно выделять высокоаффинные связующие элементы, нацеленные на антиген NRP. Ограниченное разнообразие в области H1/H2 снижает вырожденность приблизительно от 10⁴ до 10⁵ раз, а возможное большее разнообразие H3 предусматривает более высокоаффинные связующие элементы. Использование библиотек с различными типами разнообразия в CDRH3 (например, использование DVK или NVT) предусматривает выделение связующих элементов, которые могут связываться с разными эпитопами целевого антигена.

По связующим элементам, выделенным из объединенных библиотек, как это описано выше, было установлено, что аффинность можно дополнительно улучшить за счет ограниченного разнообразия легкой цепи. В этом варианте осуществления изобретения разнообразие легкой цепи генерируют следующим образом, в CDRL1: аминокислотное положение 28 кодируется RDT, аминокислотное положение 29 кодируется RKT, аминокислотное положение 30 кодируется RVW, аминокислотное положение 31 кодируется ANW, аминокислотное положение 32 кодируется THT, факультативно аминокислотное положение 33 кодируется CTG, в CDRL2: аминокислотное положение 50 кодируется KBG, аминокислотное положение 53 кодируется AVC, и факультативно аминокислотное положение 55 кодируется GMA, в CDRL3: аминокислотное положение 91 кодируется TMT или SRT или обоими, аминокислотное положение 92 кодируется DMC, аминокислотное положение 93 кодируется RVT, аминокислотное положение 94 кодируется NHT, а аминокислотное положение 96 кодируется TWT или YKG или обоими.

Еще в одном варианте осуществления изобретения генерируют библиотеку или библиотеки с разнообразием в областях CDRH1, CDRH2 и CDRH3. В этом варианте осуществления изобретения разнообразие в CDRH3 генерируют, применяя разные по длине области H3, а также, главным образом, наборы кодона XYZ и NNK или NNS. Библиотеки могут быть сформированы с применением индивидуальных олигонуклеотидов с последующим объединением либо олигонуклеотиды могут быть объединены для формирования подмножества библиотек. В этом варианте осуществления изобретения библиотеки можно сортировать по целевому объекту, связанному с твердой опорой. Клоны, выделенные в результате множественных сортировок, можно скринировать на специфичность и аффинность, применяя анализы ELISA. Клоны можно скринировать на специфичность по отношению к желательным целевым антигенам, а также к другим нецелевым антигенам. Затем такие связующие элементы с целевым антигеном NRP1 можно скринировать на аффинность в конкурентном анализе ELISA со связыванием в жидкой фазе или в конкурентном спот-анализе. Связующие элементы с высокой аффинностью можно выделять из библиотеки, используя наборы кодона XYZ, изготовленные так, как это было описано выше. Эти связующие элементы легко можно получить с высоким выходом в клеточной культуре как антитела или антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным генерировать библиотеки с бóльшим разнообразием области CDRH3 по длине. Например, может быть желательно генерировать библиотеки с областями CDRH3, варьирующимися по длине в приблизительном диапазоне от 7 до 19 аминокислот.

В этих вариантах осуществления изобретения высокоаффинные связующие элементы, выделенные из библиотек, легко продуцируются с высоким выходом в бактериальной или эукариотической клеточной культуре. Можно сконструировать векторы для легкого удаления таких последовательностей как хвосты gD, последовательность компонента вирусного оболочечного белка, и/или добавить последовательности в константную область для обеспечения выработки полноразмерных антител или антигенсвязывающих фрагментов с высоким выходом.

Библиотеку с мутациями в CDRH3 можно комбинировать с библиотекой, содержащей различные варианты других CDR, например CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 и/или CDRH2. Так, например, в одном из вариантов осуществления изобретения библиотеку CDRH3 комбинируют с библиотекой CDRL3, созданной в контексте последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами в положениях 28, 29, 30, 31 и/или 32 при использовании заданных наборов кодона. Еще в одном варианте осуществления изобретения библиотеку с мутациями CDRH3 можно комбинировать с библиотекой, содержащей разновидности вариабельных доменов тяжелой цепи CDRH1 и/или CDRH2. В одном из вариантов осуществления изобретения библиотеку CDRH1 создают на основе последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами в положениях 28, 30, 31, 32 и 33. Библиотеку CDRH2 можно создать на основе последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами в положениях 50, 52, 53, 54, 56 и 58, используя заданные наборы кодона.

Мутанты антитела против NRP

Антитело против NRP, генерированное из фаговых библиотек, можно дополнительно модифицировать, создавая мутанты антител с улучшенными физическими, химическими и/или биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом. Если используемый анализ представляет собой анализ биологической активности, то предпочтительный мутант антитела имеет биологическую активность в анализе выбора, которая превосходит биологическую активность исходного антитела в том же анализе, по меньшей мере, приблизительно в 10 раз, предпочтительнее, по меньшей мере, приблизительно в 20 раз, еще предпочтительнее, по меньшей мере, приблизительно в 50 раз, а иногда, по меньшей мере, приблизительно в 100 раз или в 200 раз. Например, предпочтительный мутант антитела против NRP1 имеет аффинность связывания с NRP, которая превосходит аффинность связывания исходного антитела против NRP, по меньшей мере, приблизительно в 10 раз, предпочтительнее, по меньшей мере, приблизительно в 20 раз, еще предпочтительнее, по меньшей мере, приблизительно в 50 раз, а иногда, по меньшей мере, приблизительно в 100 раз или в 200 раз.

Для того чтобы генерировать мутант антитела в одну или более гипервариабельных областей исходного антитела вводят одну или более изменений аминокислот (например, замещений). В альтернативном варианте или в дополнение к этому в исходное антитело можно ввести одно или более изменений (например, замещений) остатков каркасной области, если это приводит к улучшению аффинности связывания мутантного антитела с антигеном от млекопитающего другого биологического вида. Примеры остатков каркасной области для модификации включают те остатки, которые нековалентно связывают антиген прямым образом (Amit et al. (1986) Science 233:747-753), взаимодействуют с CDR/влияют на конформацию CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917) и/или участвуют в границе раздела VL-VH (EP 239 400B1). В некоторых вариантах осуществления изобретения модификация одного или более таких остатков каркасной области приводит к усилению аффинности связывания антитела с антигеном от млекопитающего другого биологического вида. Например, в этом варианте осуществления изобретения могут быть изменены приблизительно от одного до пяти остатков каркасной области. Иногда этого может быть достаточно для получения мутанта антитела, пригодного для применения в доклинических испытаниях, даже если не был изменен ни один из остатков гипервариабельной области. Однако обычно мутант антитела будет содержать дополнительную альтерацию (альтерации) гипервариабельной области.

Подвергающиеся изменению остатки гипервариабельной области могут быть изменены случайным образом, особенно тогда, когда начальная аффинность связывания исходного антитела такова, что случайно полученные мутанты антитела такого рода можно легко скринировать.

Одна полезная процедура для генерирования таких мутантов антитела носит название "аланин-сканирующий мутагенез" (Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085). В этом случае один или более остатков гипервариабельной области замещаются остатком (остатками) аланина или полиаланина для того, чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот с антигеном от млекопитающего другого биологического вида. Те остатки гипервариабельной области, которые демонстрируют функциональную чувствительность к замещениям, позже усовершенствуются посредством внесения добавочных или других мутаций в сайтах замещения. Таким образом, хотя заранее определен сайт для внесения вариаций в аминокислотную последовательность, природа мутации, как таковая, не нуждается в предварительном определении. Полученные таким образом аланиновые мутанты (ala-мутанты) проходят скрининг на их биологическую активность, как это описано в настоящем документе.

Обычно можно начать с консервативного замещения, например, такого, как показано ниже под заголовком "предпочтительные замещения". Если такие замещения приводят к изменению биологической активности (например, аффинности связывания), то вносят более существенные изменения, обозначаемые "типичные замещения" в приведенной ниже таблице или далее в ссылке на классы аминокислот.

Предпочтительные замещения:

Еще более существенные модификации в биологических свойствах антител достигаются посредством отбора замещений, которые существенно разнятся по своему влиянию на поддержание (a) скелетной структуры полипептида в области замещений, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (c) массы боковой цепи. Встречающиеся в природе (аминокислотные) остатки подразделяются на группы на основе общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: norleucine (норлейцин), met, ala, val, leu, ile;

(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr, asn, gln;

(3) кислые: asp, glu;

(4) основные: his, lys, arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и

(6) ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замещения повлекут за собой замену члена одного из этих классов на другой класс.

Еще в одном варианте осуществления изобретения сайты, отобранные для модификации, созревают по аффинности с применением фагового дисплея (смотри выше).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие мутанты аминокислотных последовательностей, получают разными способами, известными в данной области техники. Эти способы включают, но, не ограничиваясь ими, олигонуклеотид-опосредованный (или сайтспецифический) мутагенез, мутагенез PCR и кассетный мутагенез ранее полученного мутанта или немутантного варианта исходного антитела. Предпочтительным способом получения мутантов является сайтспецифический мутагенез (смотри, например, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488).

В некоторых вариантах осуществления изобретения мутант антитела будет иметь только одно замещение остатка в гипервариабельной области. В других вариантах осуществления изобретения будут замещены два или более остатков гипервариабельной области исходного антитела, например могут иметь место приблизительно от двух до десяти замещений в гипервариабельной области.

Обычно мутант антитела с улучшенными биологическими свойствами будет иметь аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности вариабельного домена или тяжелой, или легкой цепи исходного антитела (либо сходна с ней), по меньшей мере, на 75%, предпочтительнее, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95%. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется здесь как процентная доля аминокислотных остатков в последовательности кандидатов, которые идентичны (т.е. точно совпадают) или сходны (т.е. являются аминокислотными остатками из той же группы на основе общих свойств боковой цепи, смотри выше) с остатками исходного антитела после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внесения гэпов для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Никакие из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или инсерций в последовательности антитела за пределами вариабельного домена не должны истолковываться как влияющие на идентичность или сходство последовательности.

После продукции мутанта антитела определяют биологическую активность этой молекулы по отношению к исходному антителу. Как было отмечено выше, это может включать определение аффинности связывания и/или других проявлений биологической активности антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения изготовляют панель мутантов антитела и скринируют мутанты на аффинность связывания с таким антигеном как NRP1 или его фрагмент. Один или более мутантов антитела, отобранных по результатам этого первичного скрининга, факультативно подвергают одному или более дополнительных анализов на биологическую активность для подтверждения того, что мутант (мутанты) антитела с усиленной аффинностью связывания, действительно, полезны, например, для доклинических исследований.

Отобранный таким образом мутант (мутанты) антитела можно подвергнуть дальнейшим модификациям, что зачастую зависит от предназначения антитела. Такие модификации могут включать дальнейшие изменения аминокислотной последовательности, слияние с гетерологичным полипептидом (полипептидами) и/или ковалентные модификации, например те, которые будут подробно разобраны ниже. Что касается изменений аминокислотной последовательности, то типичные модификации были рассмотрены выше. Например, любой цистеиновый остаток, не вовлеченный в поддержание правильной конформации мутанта антитела, также может быть замещен, как правило, серином для улучшения окислительной стабильности молекулы и предупреждения аберрантного формирования поперечных связей. И наоборот, для улучшения стабильности антитела к нему можно добавить цистеиновый мостик (мостики), особенно в том случае, если антитело представлено фрагментом антитела, например фрагментом Fv. Еще один тип аминокислотного мутанта имеет измененный характер гликозилирования. Этого можно достичь за счет делеции одного или более углеводных компонентов, обнаруживаемых в антителе, и/или добавления одного или более сайтов гликозилирования, которые не представлены в антителе. Гликозилирование антител обычно бывает или N-связанным, или O-связанным. N-связанность относится к присоединению углеводного компонента к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности типа аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X может быть представлен любой аминокислотой кроме пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводного компонента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие в полипептиде любой из этих двух трипептидных последовательностей создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров (N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы) к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут быть использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление сайтов гликозилирования к антителу легко осуществляется посредством такого изменения аминокислотной последовательности, которое заключается во введении в нее одной или более описанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение также может быть произведено посредством дополнительного вставления или заместительной подстановки в последовательность исходного антитела одного или более сериновых или треониновых остатков (для O-связанных сайтов гликозилирования).

Векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные способы

Антитела против Nrp, предлагаемые изобретением, можно произвести рекомбинантным способом, применяя легкодоступные методики и материалы.

Для рекомбинантной продукции антитела против NRP выделяют кодирующую нуклеиновую кислоту и вставляют эту нуклеиновую кислоту в реплицируемый вектор для последующего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. Кодирующую антитело ДНК можно легко выделить или синтезировать, применяя общепринятые процедуры (например, используя олигонуклеотидные зонды, способные специфически связываться с молекулами ДНК, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Доступны многие векторы. Векторные компоненты обычно включают, но не ограничиваясь ими, один или более из следующих: сигнальная последовательность, начало репликации (репликатор), один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции.

(i) Компонент сигнальной последовательности

Антитело, предлагаемое этим изобретением, может быть произведено рекомбинантным способом не только напрямую, но так же как гибридный полипептид с гетерологичным полипептидом, который, предпочтительно, является сигнальной последовательностью другого полипептида, имеющего специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида. Предпочтительно, чтобы отобранная гетерологичная сигнальная последовательность распознавалась и поддавалась процессингу (то есть расщеплению сигнальной пептидазой) клетки-хозяина. Для прокариотических клеток, которые не распознают и не обрабатывают сигнальную последовательность природного антитела, сигнальная последовательность замещается на отобранную прокариотическую сигнальную последовательность, например, из группы лидеров щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II. Для дрожжевой секреции природная сигнальная последовательность может быть замещена, например, лидером дрожжевой инвертазы, лидером α-фактора (включая лидеры α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces) или лидером кислой фосфатазы, лидером глюкоамилазы C. albicans или сигналом, описанным в документе WO 90/13646. Для экспрессии в клетках млекопитающих доступны сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидеры, например сигнал gD вируса простого герпеса.

ДНК для такой области предшественника лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей антитело.

(ii) Компонент начала репликации

Как векторы экспрессии, так и векторы клонирования содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицироваться в одной или более отобранных клеток-хозяев. Обычно в векторах клонирования эта последовательность такова, что позволяет вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина и включает начальные элементы репликации (репликаторы) или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для множества бактерий, дрожжей и вирусов. Репликатор плазмиды pBR322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий, репликатор плазмиды 2μ пригоден для дрожжей, а различные вирусные репликаторы (SV40, полиомы, аденовируса, VSV или BPV) полезны для векторов клонирования в бактериальных клетках. Обычно компонент репликатора не нужен для векторов экспрессии млекопитающих (репликатор SV40 может типично использоваться только потому, что он содержит ранний промотор).

(iii) Компонент гена отбора

Векторы экспрессии и клонирования могут содержать ген отбора, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены отбора кодируют белки, которые (a) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) комплектуют ауксотрофную недостаточность или (c) поставляют критически важные питательные вещества, недоступные из составных питательных сред, например ген, кодирующий D-аланинрацемазу для бацилл.

В одном из примеров схемы отбора используется лекарство для задержки роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, вырабатывают белок, придающий лекарственную устойчивость, то есть способность к выживанию в схеме отбора. Примеры этого доминирующего отбора используют такие лекарства как неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин.

Еще одним примером пригодных селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются гены, позволяющие идентифицировать клетки, которые способны принимать нуклеиновую кислоту антитела, например гены DHFR, тимидинкиназы, металлотионеина-I и -II, предпочтительно гены металлотионеина приматов, аденозиндезаминазы, орнитиндекарбоксилазы и т.д.

Например, клетки, трансформированные геном отбора DHFR, прежде всего идентифицируют, культивируя все трансформанты в питательной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Соответствующей клеткой-хозяином, в которой задействована DHFR дикого типа, является линия клеток яичника китайского хомячка (CHO) с недостаточностью по активности DHFR.

В альтернативном варианте клетки-хозяева (особенно хозяева дикого типа, содержащие эндогенную DHFR), которые трансформированы или котрансформированы последовательностями ДНК, кодирующими антитело, белок DHFR дикого типа и другой селектируемый маркер, например аминогликозид 3'-фосфотрансферазу (APH), могут быть отобраны посредством выращивания в питательной среде, содержащей соответствующий агент отбора для селектируемого маркера, например аминогликозидный антибиотик (канамицин, неомицин или G418). Смотри Патент США № 4965199.

Подходящим геном отбора для использования в дрожжах является ген trp1, представленный в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39). Ген trp1 обеспечивает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, утрачивающего способность роста в присутствии триптофана, например штамма ATCC № 44076 или PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85:12. Присутствие повреждения trp1 в геноме дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает эффективную окружающую среду для выявления трансформации при выращивании в питательной среде с отсутствием триптофана. Сходным образом, штаммы дрожжей с дефицитом Leu2 (ATCC 20622 или 38626) дополняются известными плазмидами, несущими ген Leu2.

В дополнение к этому, для трансформации дрожжей Kluyveromyces можно использовать векторы, полученные из кольцевой плазмиды pKD1 размером 1,6 мкм. Альтернативная система экспрессии для крупномасштабной выработки рекомбинантного телячьего химозина была описана для K.lactis. Van den Berg (1990) Bio/Technology 8:135. Также были раскрыты многокопийные векторы экспрессии для секреции зрелого рекомбинантного сывороточного альбумина человека промышленными штаммами Kluyveromyces. Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9:968-975.

(iv) Компонент промотора

Векторы экспрессии и клонирования обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с нуклеиновой кислотой антитела. Промоторы, пригодные для применения с прокариотическими хозяевами, включают промотор phoA, промоторные системы β-лактамазы и лактозы, щелочной фосфатазы, промоторную систему триптофана (trp) и такие гибридные промоторы как промотор tac. Однако пригодны и другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для применения в бактериальных системах также будут содержать последовательность Шайна-Далгарно (S.D.), функционально связанную в ДНК, кодирующей антитело.

Известны промоторные последовательности для эукариот. Практически все эукариотические гены имеют область с обильным содержанием AT, расположенного приблизительно на 25-30 оснований выше сайта, в котором инициируется транскрипция. Еще одна последовательность, расположенная на 70-80 оснований выше начала транскрипции многих генов, представляет собой участок CNCAAT, где символ N может быть представлен любым нуклеотидом. На 3'-конце большинства эукариотических генов имеется последовательность AATAAA, которая может служить сигналом для добавления хвоста поли-A к 3'-концу кодирующей последовательности. Все указанные последовательности удобным образом можно вставлять в эукариотические векторы экспрессии.

Примеры подходящих промоторных последовательностей для использования с дрожжами включают промоторы для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.

Другими дрожжевыми промоторами, которые представляют собой индуцируемые промоторы, имеющие дополнительное преимущество транскрипции, управляемой условиями роста, являются промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома C, кислой фосфатазы, дегидратирующих ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для использования в дрожжевой экспрессии дополнительно описаны в документе EP 73657. Вместе с дрожжевыми промоторами также преимущественно используются дрожжевые энхансеры.

Транскрипция антител из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих управляется, например, промоторами, полученными из геномов таких вирусов как вирус полиомы, вирус куриной оспы, аденовирус (например, аденовирус 2), вирус коровьей папилломы, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита-B и, наиболее предпочтительно, обезьяний вирус 40 (SV40), гетерологичными промоторами млекопитающих, например промотором актина или промотором иммуноглобулина, промоторами теплового шока, при том условии, что такие промоторы совместимы с системами клетки-хозяина.

Ранние и поздние промоторы вируса SV40 удобно получать в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит вирусный репликатор SV40. Непосредственный ранний промотор цитомегаловируса человека удобно получить в виде рестрикционного фрагмента HindIII E. Система для экспрессии ДНК в клетках-хозяевах млекопитающих с применением в качестве вектора вируса коровьей папилломы раскрыта в патенте США № 4419446. Модификация этой системы описана в патенте США № 4601978. Смотри также ссылку Reyes et al. (1982) Nature 297:598-601 по экспрессии кДНК β-интерферона человека в клетках мыши под управлением промотора тимидинкиназы из вируса простого герпеса. В альтернативном варианте в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.

(v) Компонент энхансерного элемента

Транскрипция ДНК, кодирующей антитело, предлагаемое этим изобретением, в клетках высших эукариот часто увеличивается при вставке в вектор энхансерной последовательности. Сейчас известны многие энхансерные последовательности из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Однако типичным является использование энхансера из вируса эукариотической клетки. Примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне репликатора (bp 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне репликатора и энхансеры аденовируса. Смотри также ссылку Yaniv (1982) Nature 297:17-18 по энхансерным элементам для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5' или 3' последовательности, кодирующей антитело, но, предпочтительно, располагается со стороны 5' от промотора.

(vi) Компонент терминации транскрипции

Векторы экспрессии, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжевых, грибковых, насекомых, растительных, животных, человека или ядерных клетках от других многоклеточных организмов), также будут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны из 5' и иногда из 3' нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело. Одним из полезных компонентов терминации транскрипции является полиаденилированная область коровьего гормона роста. Смотри документ WO94/11026 и векторы экспрессии, раскрытые там.

(vii) Отбор и трансформация клеток-хозяев

Подходящими клетками-хозяевами для клонирования и экспрессии ДНК в рассматриваемых в настоящем документе векторах являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Пригодные для этой цели прокариоты включают такие эубактерии как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, такие кишечные бактерии как Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans и Shigella, а также такие бациллы как B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, раскрытая в документе DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), такие представители рода Pseudomonas как P. aeruginosa, и Streptomyces. Предпочтительным хозяином для клонирования из E. coli является штамм E. coli 294 (ATCC 31446), хотя пригодны и другие штаммы, например E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) и E. coli W3110 (ATCC 27325). Эти примеры скорее являются иллюстративными, чем ограничительными.

В дополнение к прокариотам, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, являются такие эукариотические микробы как нитевидные грибы или дрожжи. Из числа низших эукариотических микроорганизмов в качестве хозяев чаще всего используются Saccharomyces cerevisiae или обыкновенные пекарские дрожжи. Однако здесь стоит упомянуть множество других общедоступных и полезных родов, видов и штаммов хозяев, таких как Schizosaccharomyces pombe, таких Kluyveromyces как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans и K. marxianus, yarrowia (EP 402226), Pichia pastoris (EP 183070), Candida, Trichoderma reesia (EP 244234), Neurospora crassa, такие Schwanniomyces как Schwanniomyces occidentalis и такие нитевидные грибы как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и такие Aspergillus как A. nidulans и A. niger.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных антител получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных организмов включают растительные клетки и клетки насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты, а также соответствующие пермиссивные клетки-хозяева от таких насекомых как Spodoptera frugiperda (листовертка), Aedes aegypti (вид комара), Aedes albopictus (вид комара), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori (шелкопряд). В свободном доступе имеется множество вирусных штаммов для трансфекции, например вариант L-1 NPV Autographa californica и штамм Bm-5 NPV Bombyx mori, и такие вирусы можно использовать в настоящем изобретении, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев также можно использовать культуры таких растительных клеток как клетки хлопка, хлебных злаков, картофеля, сои, петунии, томата и табака.

Однако наибольший интерес уже давно вызывают клетки позвоночных, а размножение таких клеток в культуре (получение тканевой культуры) стало рутинной процедурой. Примерами полезных клеточных линий млекопитающих для использования в качестве хозяев являются линия почечных клеток обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), линия эмбриональных почечных клеток человека (293 или клетки 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham et al. (1977) J. Gen Virol. 36:59), младенческие почечные клетки хомяка (BHK, ATCC CCL 10), клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216), мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather (1980) Biol. Reprod. 23:243-251), почечные клетки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70), почечные клетки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587), клетки цервикальной карциномы человека (HELA, ATCC CCL 2), почечные клетки собаки (MDCK, ATCC CCL 34), клетки печени крысы buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442), клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75), клетки печени человека (Hep G2, HB 8065), клетки мышиной опухоли молочной железы (MMT 060562, ATCC CCL51), клетки TR1 (Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68), клетки MRC 5, клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2).

Клетки-хозяева подвергают трансформации вышеуказанными векторами экспрессии или клонирования для выработки антител и культивируют в традиционных питательных средах, соответствующим образом модифицированных для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желательные последовательности.

(viii) Культивирование клеток-хозяев

Клетки-хозяева, используемые в настоящем изобретении для продукции антител, можно культивировать во многих разнообразных средах. Для культивирования клеток-хозяев пригодны такие поступающие в продажу среды как среда Хэма F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла в модификации Дульбекко ((DMEM), Sigma). В дополнение к этому, для культивирования клеток-хозяев можно использовать любую из сред, описанных в ссылках Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58:44, Barnes et al. (1980) Anal. Biochem. 102:255, патенты США №№ 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 и 5122469, WO 90/03430, WO 87/00195 или патент США Re. 30985. Любую из этих сред при необходимости можно дополнить гормонами и/или другими факторами роста (например, инсулином, трансферрином или эпидермальным фактором роста), солями (например, хлоридом натрия, солями кальция, магния и фосфатами), буферами (например, HEPES), нуклеотидами (например, аденозином и тимидином), антибиотиками (например, GENTAMYCIN™), следовыми элементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно представленные в конечной концентрации микромолярного диапазона), а также глюкозой или равноценным источником энергии. Кроме того, можно ввести в соответствующей концентрации любые другие необходимые добавки, которые могут быть известны компетентному специалисту. Такие условия культивирования как температура, pH и т.п., которые обычно используют при выращивании клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, должны быть очевидными для специалиста с обычным уровнем компетентности.

(ix) Очистка антител

При использовании рекомбинантных методик антитело может быть выработано внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретировано в культуральную среду. Если антитело выработано внутриклеточно, то на первом этапе очистки удаляют частицы обломков (клеток-хозяев или лизированных фрагментов), например, посредством центрифугирования или ультрафильтрации. Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167 описывают процедуру выделения антител, которые секретированы в периплазматическое пространство E. coli. Вкратце, клеточную пасту оттаивают в присутствии ацетата натрия (pH 3.5), EDTA и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) приблизительно в течение 30 минут. Клеточные обломки можно удалить посредством центрифугирования. Если антитело секретировано в культуральную среду, то супернатанты из таких систем экспрессии обычно, прежде всего, концентрируют, применяя доступный в продаже фильтр для белковой концентрации, например, Amicon или агрегат для ультрафильтрации Millipore Pellicon. На любом из предыдущих этапов можно подключить такой ингибитор протеазы как PMSF для ингибирования протеолиза, а также антибиотики для профилактики роста случайных загрязняющих микробиологических примесей.

Композицию антитела, приготовленную из клеток, можно очистить, используя, например, хроматографию на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ и аффинную хроматографию, причем аффинная хроматография является предпочтительной методикой очистки. Пригодность белка A в качестве аффинного лиганда зависит от биологического вида и изотипа любого домена Fc иммуноглобулина, который представлен в антителе. Белок A можно использовать для очистки антител, которые основаны на тяжелых цепях человека γl, γ2 или γ4 (Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13). Белок G рекомендуется для всех мышиных изотипов и для γ3 человека (Guss et al. (1986) EMBO J. 5:15671575). Матрицей, к которой прикрепляется аффинный лиганд, чаще всего является агароза, но доступны и другие матриксы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают ускоренные потоки и сокращают время процессинга по сравнению с агарозой. Если антитело содержит домен CH3, то для очистки полезно применять смолу Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Филипсбург, штат Нью-Джерси). В зависимости от антитела, подлежащего извлечению, доступны и другие методики очисти белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ЖХВР (HPLC), хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-сефарозе (SEPHAROSE™), хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония.

После проведения какого-либо этапа (этапов) предварительной очистки смесь, содержащую представляющее интерес антитело и загрязняющие примеси, можно подвергнуть гидрофобной хроматографии с низким pH, используя элюирующий буфер с приблизительным уровнем pH 2,5-4,5, предпочтительно, при низкой солевой концентрации (например, приблизительно 0-0,25M).

Фармацевтические составы

Терапевтические лекарственные составы с антителами готовят для хранения, смешивая антитело, имеющее желательную степень чистоты, с факультативными физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают такие буферы как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, такие алкилпарабены как метилпарабен или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и m-крезол), полипептид низкого молекулярного веса (менее приблизительно 10 остатков), такие белки как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, такие гидрофильные полимеры как поливинилпирролидон, такие аминокислоты как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, такие хелатообразующие агенты как EDTA, такие сахара как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, такие солеобразующие противоионы как натрий, комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или такие неионные сурфактанты, как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Рассматриваемая здесь лекарственная рецептура также может содержать более одного активного соединения, если это необходимо по соответствующим медицинским показаниям, причем предпочтительно, чтобы эти соединения проявляли комплементарную активность и не оказывали друг на друга отрицательного влияния. Например, может оказаться желательным ввести в рецептуру дополнительный иммунодепрессант. Такие молекулы удобно комбинировать в количествах, которые эффективны в отношении заданной цели.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулу, изготовленную, например, по методикам коацервации или полимеризации на границе фаз, например в микрокапсулу из гидроксиметилцеллюлозы, желатина или в микрокапсулу из (поли)метилметакрилата, соответственно, либо введены в коллоидные системы доставки лекарств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в ссылке Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Лекарственные составы, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достижимо посредством фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Можно изготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы или твердые гидрофобные полимеры, содержащие антитело, причем указанные матрицы имеют форму профилированных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, (поли)2-гидроксиэтилметакрилат или (поли) виниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ- этил-L-глутамата, нераспадающийся этиленвинилацетат, такие распадающиеся сополимеры молочной кислоты с гликолевой кислотой как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты с гликолевой кислотой и лейпролида ацетата), а также поли-D-(-)-3-гидроксибутировую кислоту. Если такие полимеры как этиленвинилацетат и молочная кислота - гликолевая кислота обеспечивают высвобождение молекул на протяжении более чем 100 дней, то некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких промежутков времени. Когда инкапсулированные антитела длительное время находятся внутри организма, они могут денатурироваться или агрегироваться в результате контакта с влажной средой при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Можно разработать рациональные стратегии стабилизации в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если выявленный механизм агрегации основан на образовании межмолекулярных связей S-S через тио-дисульфидный взаимообмен, то стабилизации можно достичь посредством модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, регулирования содержания влаги, применения соответствующих добавок и разработки специфических композиций полимерных матриц.

Возможности терапевтического применения

Рассматриваются возможности применения антител, предлагаемых настоящим изобретением, для лечения млекопитающих. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело вводят млекопитающему, неродственному человеку, например, в целях получения доклинических данных. Типичные неродственные человеку животные, используемые в исследованиях по лечению, включают нечеловекообразных приматов, собак, кошек, грызунов и других млекопитающих, на которых проводят доклинические исследования. Такими млекопитающими могут быть представители биологических видов, являющихся признанными моделями заболеваний, подлежащих лечению антителами, кроме того, млекопитающих можно использовать для изучения токсичности представляющих интерес антител. В каждом из этих вариантов осуществления изобретения на млекопитающих можно проводить исследования с повышением дозы. Например, если испытуемое антитело представляет собой антитело против NRP1, то его можно вводить в организм хозяина-грызуна, являющегося моделью сóлидной опухоли.

В дополнение или в альтернативе к этому, антитело применяют для лечения человека, например, больного, страдающего заболеванием или расстройством, которое может улучшиться в результате введения антитела.

Настоящее изобретение охватывает антиангиогенную терапию рака, новую стратегию лечения рака, направленную на подавление развития кровеносных сосудов в опухоли, необходимых для доставки питательных веществ, поддерживающих рост опухоли. Поскольку ангиогенез вовлечен в рост как первичной опухоли, так и метастазов, антиангиогенное лечение, предлагаемое изобретением, способно подавлять неопластический рост опухоли в первичном очаге, а также предупреждать метастазы опухолей во вторичных очагах, следовательно, помогать другим лекарствам атаковать опухоли. Примеры рака, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раков включают плоскоклеточный рак, рак легких (включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, гастральный рак или рак желудка (включая желудочно-кишечный рак), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (включая низкозлокачественную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL), мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL, фолликулярную/средней злокачественности NHL, диффузную NHL средней злокачественности, высокозлокачественную лимфобластную NHL, высокозлокачественную мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами клеток, NHL с массивным поражением, лимфому из клеток мантии, лимфому, связанную со СПИДом и макроглобулинемию Вальденстрема), хронический лимфолейкоз (CLL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), лейкоз ворсистых клеток, хронический миелобластный лейкоз и послетрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), а также аномальную сосудистую пролиферацию, связанную с факоматозами, отек (например, связанный с опухолями мозга) и синдром Мейгса. Более конкретно, раки, которые подлежат лечению антителами, предлагаемыми настоящим изобретением, включают рак молочной железы, колоректальный рак, рак прямой кишки, немелкоклеточный рак легких, неходжкинскую лимфому (NHL), почечноклеточный рак, рак предстательной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, саркому мягких тканей, саркому Капоши, карциноидную карциному, рак головы и шеи, меланому, рак яичников, мезотелиому и множественную миелому.

Предполагается, что при использовании для лечения различных заболеваний, таких как опухоли, антитела, предлагаемые изобретением, можно комбинировать с другими лекарственными средствами, пригодными для лечения того же заболевания или сходных заболеваний. Применительно к лечению рака антитела, предлагаемые настоящим изобретением, можно использовать в комбинации с традиционными способами лечения рака, такими как хирургия, лучевая терапия, химиотерапия или их комбинации.

В некоторых аспектах другие лекарственные средства, полезные для комбинированной противораковой терапии в сочетании с антителами, предлагаемыми изобретением, включают другие антиангиогенные средства. В данной области техники были идентифицированы и в настоящее время известны многие антиангиогенные средства, включая те, что перечислены в публикации Carmeliet and Jain (2000).

В одном из аспектов антитело, предлагаемое изобретением, применяют в комбинации с антагонистом VEGF или с антагонистом рецептора VEGF, например с антителами против VEGF, вариантами VEGF, растворимыми фрагментами рецептора VEGF, аптамерами, способными блокировать VEGF или VEGFR, нейтрализующими антителами против VEGFR, ингибиторами тирозинкиназ VEGFR и любыми комбинациями указанных средств. В альтернативе или в дополнение к этому, больному можно вводить совместно два или более антитела против NRP1. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело против NRP1^A или против NRP^B, предлагаемое изобретением, применяют в комбинации с антителом против VEGF для получения аддитивных или синергических эффектов. Предпочтительные антитела против VEGF включают такие антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело против hVEGF A4.6.1. Более предпочтительным антителом против VEGF является бевацизумаб или ранибизумаб.

В некоторых других аспектах терапевтические средства, полезные для комбинированной противоопухолевой терапии в сочетании с антителами, предлагаемыми изобретением, включают антагониста других факторов, вовлеченных в рост опухоли, таких как EGFR, ErbB2 (также известный как Her2) ErbB3, ErbB4 или TNF. Предпочтительно, чтобы антитело против NRP1 по изобретению можно было применять в комбинации с низкомолекулярными ингибиторами рецептора тирозинкиназы (RTKI), которые нацелены на один или более рецепторов тирозинкиназы, таких как рецепторы VEGF, рецепторы FGF, рецепторы EGF и рецепторы PDGF. В данной области техники известны многие низкомолекулярные RTKI, включая, но не ограничиваясь ими, ваталаниб (PTK787), эрлотиниб (TARCEVA^®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA^®), ZD6126 (ANG453), ZDl839, сунитиниб (SUTENT^®), семаксаниб (SU5416), AMG706, AG013736, иматиниб (GLEEVEC^®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, лапатиниб (GSK572016), VELCADE^®, AZD2171, сорафениб (NEXAVAR^®), XL880 и CHIR-265.

Антитело против Nrp по изобретению самостоятельно или в комбинации со вторым терапевтическим средством (таким как антитело против VEGF) можно далее использовать в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами. В способах комбинированного лечения, рассматриваемых изобретением, можно применять множество разнообразных химиотерапевтических средств. Примерный и не ограничивающий список химиотерапевтических средств, предлагаемых к применению в соответствии с изобретением, представлен здесь в разделе "Определение".

Если антитело против Nrp применяют совместно с другим терапевтическим средством, то другое терапевтическое средство можно вводить первым по очереди, после чего больному вводят антитело против Nrp. Однако также можно вводить оба лекарственных средства одновременно или вводить антитело против Nrp в первую очередь. Подходящие дозировки второго терапевтического средства вполне соответствуют его стандартным дозировкам, рекомендуемым в настоящее время, но могут быть снижены вследствие комбинированного эффекта (синергии) этого средства и антитела против Nrp.

Соответствующая доза антитела для профилактики или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, от тяжести и характера течения заболевания, от того, вводят ли антитело в терапевтических или профилактических целях, от проводившейся ранее терапии, от клинического анамнеза больного, от реакции больного на антитело и от решений лечащего врача. Антитело соответствующим образом вводят больному однократно или в виде серии лечебных доз.

В зависимости от типа и тяжести заболевания возможная начальная доза антитела для введения больному составляет приблизительно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), независимо от того, проводят ли однократное введение, несколько дробных введений или непрерывное вливание. Типичная ежедневная доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. При повторном введении в течение нескольких дней или более, в зависимости от клинического состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не будет достигнуто желательное подавление симптомов заболевания. Однако могут быть полезными и другие схемы дозирования. В предпочтительном аспекте антитело, предлагаемое изобретением, вводят регулярно с интервалом от двух до трех недель в дозе, варьирующейся приблизительно от 5 мг/кг до 15 мг/кг. Более предпочтительно, чтобы такой режим дозирования был использован в комбинации со схемой химиотерапии (как терапия первой очереди для лечения метастатического колоректального рака). В некоторых аспектах схема химиотерапии включает традиционное интермиттирующее введение высоких доз препаратов. В некоторых других аспектах химиотерапевтические средства вводят, применяя уменьшенные и более частые дозы без регламентированных по графику перерывов ("равномерная химиотерапия"). Прогресс терапии, проводимой в соответствии с настоящим изобретением, можно легко мониторировать с применением традиционных методик и анализов.

Композицию с антителом можно составить, дозировать и вводить в соответствии с принципами надлежащей медицинской практики. Факторы, заслуживающие рассмотрения в этом аспекте, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, получающее лечение, клиническое состояние больного индивида, причина заболевания, место доставки лекарства в организм, способ введения, временной график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. "Терапевтически эффективное количество" антитела для введения больному определяется указанными выше соображениями и представляет собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения заболевания/расстройства. Антитело не обязательно, но факультативно комбинируется в рецептурном составе с одним или более средств, применяемых в настоящее время для профилактики или лечения заболеваний, о которых здесь идет речь. Эффективное количество таких добавочных средств зависит от количества антитела, представленного в рецептурном составе, от типа заболевания или лечения, а также от других факторов, обсуждавшихся выше. Обычно их применяют в тех же дозах и с теми же способами введения, которые были указаны здесь выше, или приблизительно в количестве от 1 до 99% от применяемых ранее дозировок. Обычно облегчение или лечение заболевания/расстройства подразумевает уменьшение одного или более симптомов или медицинских проблем, связанных с заболеванием/расстройством. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарства может привести к достижению одной или более следующих целей: снижение количества раковых клеток, уменьшение размеров опухоли, подавление (то есть некоторое снижение и/или остановка) инфильтрации периферических органов раковыми клетками, подавление метастазирования опухоли, подавление в определенной степени роста опухоли и/или некоторое облегчение одного или более симптомов, связанных с раком. В той степени, в которой лекарство способно предупреждать рост опухоли и/или убивать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаемую им композицию можно использовать для предупреждения первичной или повторной вспышки заболевания/расстройства у субъекта или млекопитающего.

Возможности нетерапевтического применения

Антитела по изобретению можно применять в качестве средств аффинной очистки. В этом процессе антитела иммобилизуют на твердой фазе, например на смоле Sephadex или на фильтровальной бумаге, применяя способы, хорошо известные в данной области техники. Иммобилизованное антитело вводят в контакт с образцом, содержащим очищаемый антиген, после чего опору отмывают подходящим растворителем, который удаляет, по существу, весь материал образца за исключением очищаемого антигена, связанного с иммобилизованным антителом. Наконец, опору отмывают другим подходящим растворителем, например глициновым буфером, pH 5,0, который разъединяет антиген и антитело.

Антитела по изобретению также могут быть полезными в диагностических анализах, например, для выявления экспрессии представляющего интерес антигена в специфических клетках, тканях или сыворотке.

В типичных диагностических применениях антитело метят поддающимся выявлению компонентом. Доступны многочисленные метки, которые обычно группируют по следующим категориям.

(a) Радиоизотопы, такие как ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H и ¹³¹I. Антитело может быть мечено радиоизотопом с применением методик, описанных, например, в ссылке Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al. (1991) Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs, а радиоактивность можно измерить, применяя сцинтилляционный счетчик.

(b) Доступны также флуоресцентные метки, такие как хелаты редкоземельных элементов (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и техасский красный. Флуоресцентные метки могут быть конъюгированы с антителом при помощи методик, раскрытых, например, в ссылке Current Protocols in Immunology, выше. Флуоресценцию можно оценить количественно, используя флуориметр.

(c) Доступны различные метки типа фермент-субстрат, а обзор некоторых из них представлен в патенте США № 4275149. Фермент обычно катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно измерить разными методиками. Например, фермент может катализировать цветовое изменение субстрата, которое можно измерить способом спектрофотометрии. В альтернативном варианте фермент может изменить флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методики количественного определения изменений флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат становится электронно-возбужденным в результате химической реакции, после чего может испускать свет, который можно измерить (применяя, например, хемилюминометр), или передает энергию флуоресцентному акцептору. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу, патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, такие пероксидазы как пероксидазу хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридные оксидазы (например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (например, уриказу и ксантиноксидазу), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.д. Методики конъюгирования ферментов с антителами описаны в ссылке O'Sullivan et al. (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York 73:147-166.

Примеры комбинаций фермент-субстрат включают:

(i) пероксидазу хрена (HRPO) с перекисью водорода в качестве субстрата, где перекись водорода окисляет предшественника пигмента (например, ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'- тетраметилбензидина гидрохлорид (TMB)),

(ii) щелочную фосфатазу (AP) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата и

(iii) β-D-галактозидазу (β-D-Gal) с хромогенным субстратом (например, p-нитрофенил-β-D-галактозидаза) или с флуорогенным субстратом (4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидаза).

Компетентным в данной области техники специалистам известны многие другие комбинации ферментов и субстратов. Для их общего обзора смотри патенты США №№ 4275149 и 4318980.

Иногда метка конъюгирована с антителом непрямым образом. Компетентный специалист будет осведомлен о различных методиках для достижения этого результата. Например, антитело может быть конъюгировано с биотином, а любая из меток трех широких категорий, упомянутых выше, может быть конъюгирована с авидином, или наоборот. Биотин избирательно связывается с авидином, и, таким образом, метка может быть конъюгирована с антителом этим непрямым способом. В альтернативном варианте для достижения непрямой конъюгации метки с антителом, антитело конъюгируют с мелким гаптеном (например, дигоксином), а одну из меток разных вышеупомянутых типов конъюгируют с антителом против гаптена (например, антидигоксином). Таким образом, можно достичь непрямой конъюгации метки с антителом.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело не надо метить, а его присутствие можно выявить, используя меченое антитело, которое связывается с первым антителом.

Антитела, предлагаемые настоящим изобретением, можно задействовать в любом из известных способов анализа, например в анализах на конкурентное связывание, прямых и непрямых сэндвич-анализах и анализах с иммунопреципитацией. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147- 158 (CRC Press, Inc. 1987).

Анализы с конкурентным связыванием основаны на способности меченого стандарта конкурировать с испытуемым в анализе образцом за связывание с ограниченным количеством антитела. Количество антигена в испытуемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который вступает в связь с антителами. Для того чтобы облегчить определение количества стандарта, вступающего в иммунную связь, антитела обычно инсолюбилизируют (переводят в нерастворимое состояние) до или после конкуренции с тем расчетом, чтобы стандарт и анализируемый образец, связанные с антителами, можно было легко отделить от стандарта и анализируемого образца, оставшихся несвязанными.

Сэндвич-анализы включают использование двух антител, каждое из которых способно связываться с особой иммуногенной частью или эпитопом белка, подлежащего обнаружению. В сэндвич-анализе испытуемый образец связывается с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой опоре, а затем второе антитело связывается с анализируемым образцом, формируя таким образом нерастворимый трехчастный комплекс. Смотри, например, патент США № 4376110. Второе антитело, само по себе, может быть мечено поддающимся обнаружению компонентом (прямые сэндвич-анализы) или может быть измерено с применением антитела против иммуноглобулина, которое мечено поддающимся обнаружению компонентом (непрямые сэндвич-анализы). Например, одним из типов сэндвич-анализа является анализ ELISA, в котором поддающийся обнаружению компонент представляет собой фермент.

Для иммуногистохимического анализа образец опухоли может быть свежим, замороженным или вставленным в парафин и зафиксированным, например, таким консервантом как формалин.

Антитела также могут быть использованы для диагностических анализов in vivo. Обычно антитело метят радионуклидом (таким как ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P или ³⁵S) либо пигментом с тем расчетом, чтобы опухоль можно было локализовать, применяя иммуносцинтиграфию.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ обнаружения NRP1 в нативном биологическом образце (например, в ткани, крови, сыворотке, спинномозговой жидкости) или в приготовленном биологическом образце может включать этап введения в контакт антитела, предлагаемого этим изобретением, и образца с последующим наблюдением связи антитела против NRP1 с NRP1 в образце или определением количества антитела против NRP1, связанного с NRP1 в образце. В другом варианте осуществления изобретения способ обнаружения NRP1 у субъекта включает этап введения антитела, предлагаемого этим изобретением, субъекту и наблюдение связи антитела против NRP1 с NRP1 у субъекта или определение количества антитела против NRP1, связанного с NRP1 у субъекта (например, человека, мыши, кролика, крысы и т.д.).

Диагностические наборы

Для удобства антитело по изобретению можно доставлять в наборе, т.е. в упакованной комбинации реактивов с заданным количеством и с инструкциями по проведению диагностического анализа. При мечении антитела ферментом набор будет включать субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, предшественник субстрата, который служит источником поддающегося обнаружению хромофора или флуорофора). В дополнение к этому, в набор могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизисный буфер) и т.п. Относительное количество разных реактивов может широко варьироваться, чтобы можно было предусмотреть концентрацию в растворе тех реактивов, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реактивы могут быть представлены в виде сухих порошков, как правило, лиофилизированных, включая наполнители, которые при растворении создадут реакционный раствор, имеющий нужную концентрацию.

Изделия

Еще в одном варианте осуществления изобретения предлагается изделие, содержащее материалы, полезные для лечения описанных выше заболеваний. Изделие подразумевает наличие контейнера и этикетки. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из разных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер вмещает композицию, которая эффективна для лечения патологического состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожной инъекции). Активным агентом в композиции является антитело. Этикетка, наклеенная на контейнер или прилагающаяся к контейнеру, указывает, что композиция применима для лечения определенного заболевания. Изделие может дополнительно содержать второй контейнер, вмещающий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с точки зрения покупателя и пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.

Последующие примеры предназначены только для иллюстрации практического осуществления настоящего изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничения. Раскрытие всех упомянутых здесь патентов и научных публикаций во всей их полноте четко приведено в качестве ссылок.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Конструкции и функция антител против Nrp1 ^B и против panNrp ^A

Стратегия разработки фаговых антител, способных избирательно блокировать связывание либо семафорина, либо VEGF с Nrp1, была описана Liang et al., J Mol Biol 366, 815-29 (2007) и Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007). Эти моноклональные антитела были сконструированы как инструмент для различения между Nrp1-опосредованными реакциями на тот или другой лиганд, а также как средство оценки их терапевтического потенциала на мышиных моделях опухолей.

Вкратце, была сконструирована фаговая библиотека синтетических антител человека, которая была построена на единичном согласованном каркасе с разнообразием VH/VL. Подробности конструирования и отбора этой библиотеки антител описаны в ссылке Liang et al., выше, а также могут быть найдены в документе WO 03/102157, опубликованном 11 декабря 2003 г., полное раскрытие которых включено сюда в качестве ссылки. Из этой библиотеки были генерированы функциональные блокирующие антитела к NRP1 человека и мыши. Антитела, картирующие домен b1b2 NRP1, были способны блокировать связывание VEGF и NRP1, а также индуцированную VEGF миграцию клеток HUVEC. Идентифицированные антитела включали антитело, блокирующее VEGF (клон YW107.4.87, против Nrp1^B), которое связывает Nrp1 с аффинностью 0,2 нМ (Liang et al., выше, Pan et al., выше). Хотя это антитело блокирует взаимодействие между VEGF и Nrp1, оно не противодействует функции Sema3A. В условиях in vivo антитело против Nrp1^B не только уменьшает сосудистую реконструкцию в мышиной сетчатке, но также действует аддитивно с анти-VEGF терапией, замедляя рост опухоли (Liang et al., выше и Pan et al., выше).

Следуя тому же подходу с применением фаговой библиотеки синтетических антител человека, построенной на единичном согласованном каркасе, было разработано антитело (клон YW68.1 1.26, против panNrp^A), которое перекрестно реагирует как с Nrp1, так и с Nrp2 с аффинностью 0,21 и 0,15 нМ, соответственно (фиг.Sl). Последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепи YW68.11.26 и родственного YW68.11 показаны на фиг.7 и 8, соответственно. Аминокислотные последовательности фрагментов Fab антител IgG1 против panNrp^A YW68.11 и YW68.11.26 показаны на фиг.9A и 9B, соответственно.

В отличие от антитела против Nrp1^B антитело против panNrp^A не влияет на связывание VEGF₁₆₅ или VEGF-C (данные не показаны). Оценка способности обоих антител подавлять опосредованный Sema3A коллапс конусов роста аксонов из ганглиев задних корешков (DRG) спинного мозга мыши (фиг.1). Добавление Sema3A приводит к сокращению актиновых процессов в конусах роста DRG: этому действию полностью противостоит антитело против panNrp^A, но не против Nrp1^B.

ПРИМЕР 2

Структурные исследования комплексов нейропилин/антитело

Материалы и методы

Функциональные анализы и связывающая аффинность антитела

Анализы коллапса и определение связывающей аффинности антитела против Nrp были проведены так, как это было описано ранее (He, Z and Tessier-Lavigne, M., Cell 90, 739-51 (1997); Liang et al., выше и Pan et al., выше).

Экспрессия и очистка белка для кристаллографических исследований

Nrp1-b1, Nrp1-b1b2 и Nrp2-b1b2 (смотри таблицу S1 для границ доменов) были клонированы в pET15b (Novagen) и экспрессированы в E. coli после индукции при 37°C (Nrp1-b1 и -b1b2) или при 16°C (Nrp2-b1b2). Все фрагменты нейропилина типа b экспрессируются как растворимые белки без необходимости применения протокола рефолдинга. После лизиса клеток белки очищали, применяя смолу никель-нитрилтрехуксусная кислота (Ni-NTA) в 50 мM Tris (pH 8,0), 300-500 мM NaCl и 20 мM имидазола, и элюировали в том же буфере с добавлением 250 мM имидазола. Хвосты his6 были удалены тромбином, а дальнейшую очистку образцов проводили посредством гельфильтрационной хроматографии с применением колонки Superdex-75, уравновешенной в 25 мM Tris (pH 8,0) и 150 мM NaCl.

Для облегчения секреции Nrp1-a2b1b2, Nrp2-a2b1b2, Nrp2-a1a2b1b2 и полноразмерного Nrp2-ECD (таблица S1) из клеток Hi5 были генерированы рекомбинантные бакуловирусы. Nrp2-a1a2b1b2 и полноразмерный Nrp2-ECD были субклонированы с нативным сигналом секреции Nrp2 и C-концевым хвостом His₆ в pENTR/D-TOPO (Invitrogen) и рекомбинированы в pDEST8 (Invitrogen) для генерирования вирусной бакмиды. Nrp1-a2b1b2 и Nrp2-a2b1b2 были клонированы в pAcGP67B (Clonetech). После инфицирования собирали культуральную среду и вводили в нее добавки 50 мM Tris (pH 8,0), 5 мM CaCl₂ и 1 мM NiCl₂. Белки очищали при помощи Ni-NTA и гельфильтрационной хроматографии, как это описано для конструкций нейропилина, экспрессированных бактериями.

Фрагменты Fab антител против Nrp1^B (YW107.4.87) и против panNrp^A (YW68.11.26) были экспрессированы в E. coli, захвачены на колонке с носителем Protein G, уравновешенной в PBS, и элюированы 0,58% уксусной кислотой. Белковые фракции были далее очищены посредством ионообменной хроматографии (SP-сефароза) в 20 мМ MES (pH 5,5) и элюированы в градиенте NaCl от 0 до 250 мМ. Комплексы Fab/Nrp были типично смешаны в молярном соотношении 1:1 и дополнительно очищены с применением колонки Superdex-200, уравновешенной в 25 мM Tris-HCl (pH 7,5) и 200 мM NaCl. Для кристаллизации весь несвязанный нейропилин и комплекс Nrp/Fab были сконцентрированы, как это детализировано в таблице S1.

Кристаллизация, определение и уточнение структуры

Все кристаллы были получены способом диффузии из паровой фазы при 19°C посредством смешения равных объемов белка и раствора из лунок (подробности смотри в прилагаемой таблице 1). Для криопротекции кристаллы обычно переносили в маточный раствор с добавлением 20% глицерина или этиленгликоля (таблица S1). Кристаллы комплекса Nrp1-b1/Fab переносили в 10 мM Hepes (pH 7,2), 25% PEG 1500 и 10% этиленгликоль, позволяя им дегидратироваться в течение ночи по соседству с 10 мM Hepes (pH 7,2), 25% PEG 1500 и 20% этиленгликолем, после чего быстро замораживали в жидком азоте. Массивы данных собирали в Advanced Light Source (лучевые линии 5.0.1 или 5.0.2) или в Стэнфордской лаборатории синхротронного излучения (лучевые линии 9-2 или 11-1). Данные обрабатывали при помощи компьютерных программ Denzo и Scalepack из пакета HKL Suite (Otwinowski, Z & Minor, W., Methods in Enzymology 276,307-326 (1997)). Клеточные параметры и статистика данных в сводном виде приведены в таблице 1.

Все структуры кристаллов были выяснены посредством молекулярного замещения с применением фазера (McCoy et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61, 458-64 (2005)). Структура Nrp1-b1b2 была выяснена с применением кристаллической структуры Nrp1-b1 (pdb, инвентарный номер 1KEX) (Lee, et al., Structure 11, 99-108 (2003) в качестве модели исследования для каждого домена фактора коагуляции. Уточненные координаты структуры Nrp1-b1b2 служили поисковым зондом для структуры Nrp2-b1b2. Моносимметричная форма комплекса Nrp2 a1a2b1b2/против panNrp^A-Fab была выяснена с применением структуры Nrp2-b1b2 и фрагментов Fab, содержащих или вариабельные домены (V_H/V_L) или константные домены (C_H1/C_L) из комплекса B20-4/VEGF (pdb, инвентарный номер 2FJH). Домен a2 был идентифицирован посредством молекулярного замещения с применением the N-концевого домена CUB из MASP-2. Домен a1 было невозможно локализовать молекулярным замещением, и его положение было установлено вручную с учетом плотности электронов. Комплекс Nrp1-b1/Fab был выяснен с применением кристаллической структуры Nrp1-b1 и фрагментов Fab B20-4, описанных выше. Все остальные структуры были выяснены с применением уточненных координат структур b1b2 и домена CUB a2 из комплекса Nrp2-a1a2b1b2/Fab. Атомные модели были построены с применением компьютерной программы Coot (Emsley, P. & Cowtan, K. Coot, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-32 (2004)) и уточнены с применением компьютерной программы Refmac (Murshudov, et al., Acta Crystallographica D53, 240-255 (1997)).

Кристаллизация Nrp1, Nrp2 и комплексов нейропилин/Fab

Для получения белка с целью структурных исследований были использованы две разные стратегии. Меньшие фрагменты нейропилина, которые включают только домены типа b, были экспрессированы в E. Coli, тогда как для бóльших конструкций Nrp требовалась выработка в виде секретируемого белка из клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом. Обзор семи структур представлен на фиг.2. Вкратце, кристаллы VEGF-связывающей части (b1b2) Nrp1 и Nrp2 дифрагировали до максимального разрешения 1,8 и 1,95 Å, соответственно. Кристаллы доменов a2b1b2 Nrp1 и Nrp2 были улучшены до разрешения 2,0 и 2,3 Å, соответственно, а домен b1 Nrp1 в комплексе с VEGF-блокирующим Fab против Nrp1^B дифрагировал до разрешения 2,2 Å. Наконец, кристаллическая структура доменов a1a2b1b2 Nrp2 была выяснена в комплексе с семафорин-блокирующим Fab против panNrp^A. Были идентифицированы две кристаллические формы этого комплекса, которые дифрагировали до 2,75 и 3,1 Å. Все структуры были выяснены посредством молекулярного замещения и описаны с конечными величинами R_work/R_free менее 20/25% при хорошей стереохимии (таблица 1). Структуры a2b1b2 Nrp1 имели два N-связанных сайта гликозилирования на противоположных концах домена a2 (фиг.3B). Моносимметричная форма комплекса Nrp2/Fab также показывает наличие двух сайтов гликозилирования в пределах домена a2 (фиг.3A), однако эти компоненты сахаров плохо определяются в электронной плотности структуры the Nrp2-a2b1b2 и, следовательно, не моделируются (фиг.3B).

Общая доменная архитектура эктодомена нейропилина

Внеклеточная область нейропилина часто подразделена на три блока, которые описывают домены первичного связывания семафорина (a1a2), связывания VEGF (b1b2) и димеризации (c), соответственно (Ellis, L.M., Mol Cancer Ther 5, 1099-107 (2006)). Действительно, в недавно описанной кристаллической структуре b1b2 крысиного Nrp1 (Vander Kooi, C. W., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 6152-6157 (2007)) была идентифицирована большая граница раздела между доменами b1 и b2, и, поскольку остатки, скрытые между доменами, законсевированы в последовательности, эта конфигурация домена b1b2 была признана общим свойством семейства Nrp. Здесь были выяснены четыре кристаллические структуры Nrp, которые включают домены a2, b1 и b2 (фиг.2, 3), исходя из разных условий кристаллизации (таблица S1). Две модели включают домены a1, связанные с фрагментами Fab, тогда как две другие модели включают ионы кальция в доменах a2. Несмотря на эти различия, три домена (a2, b1 и b2) совмещают одну и ту же конфигурацию во всех кристаллических структурах и плотно упакованы вокруг псевдотройной оси (фиг.3). Структуры a2b1b2 Nrp1 и Nrp2 очень сходны и перекрываются на уровне r.m.s.d. (среднеквадратичного отклонения) 1,2 Å по 317 атомам Ca. Граница раздела между b1 и b2 законсервирована в обоих нейропилинах, будучи скрытой приблизительно на 1200-1500 Ų от поверхности, доступной для растворителя. Интересно, что граница раздела между доменом a2 и b1b2 также законсервирована во всех структурах и скрыта более чем на 2000 Ų от поверхности, доступной для растворителя, а это свидетельствует о том, что все три домена образуют жесткий структурный блок (фиг.3).

В отличие от этого доменная компоновка между a1 и a2b1b2 не фиксирована между двумя кристаллическими формами комплекса Nrp2/против panNrp^A-Fab. Когда наложение a2b1b2 нарушает сердцевину рецепторов, домены a1 смещаются приблизительно на 7 Å относительно друг друга. Граница раздела между a1 и a2b1b2 невелика (скрытая площадь поверхности ≈800 Ų) и не законсервирована. Утрата сильных взаимодействий означает гибкость домена a1, а это позволяет предположить, что он может подвергаться конформационным изменениям в отношении остальной части Nrp в растворе или при связывании с рецептором (фиг.3C).

Домены CUB Nrp включают сайт связывания кальция и семафорина

Домены a1 и a2 Nrp1 и Nrp2 представляют собой домены CUB (Ellis, L.M, Mol Cencer Ther 5, 1099-107 (2006)). В прототипе домена CUB, спермадгезине (Romero, A., et al., Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)), складка содержит два 5-нитевых β-листка, которые образуют β-сэндвич. Нити β2, β4, β9, β6 и β7 образуют один β-листок с другим листком, содержащим нити βl, β3, β10, β5 и β8. Однако нити β1 и β2 часто отсутствуют в доменах CUB нескольких белков семейства комплемента (Feinberg, H. et al., EMBO J 22, 2348-59 (2003), Gregory, L.A. et al., J Biol Chem 278, 32157-64 (2003), Gregory, L.A. et al., J Biol Chem 279, 29391-7 (2004)). Подобно этим белкам домены a1 и a2 Nrp утрачивают нить β1 (фиг.4). В общем, домены CUB демонстрируют высокую степень сходства. Например, домен a2 Nrp структурно сходен с доменом a2 Nrp1 (r.m.s.d. - 0,9 Å), доменом a1 Nrp2 (r.m.s.d. - 0,9 Å) и доменом CUB спермадгезина (Romero, A. et al., выше) (r.m.s.d. - 1,4 Å).

Кристаллические структуры доменов CUB в белках семейства комплемента C1s и MASP-2^36,37 содержат сайт связывания кальция на одном из концов сэндвича. Структуры a2b1b2 в Nrp1 и Nrp2 также содержат связанный ион в этом положении в пределах домена a2 (фиг.3B, 4A). В структуре Nrp1 ион отчетливо наблюдается в электронной плотности (фиг.S2), хотя двухвалентные катионы и не были включены во время кристаллизации (таблица S1). В Nrp1 ион кальция координирован тремя отрицательно заряженными боковыми цепями (Glu¹⁹⁵, Asp²⁰⁹ и Asp²⁵⁰), двумя карбонильными кислородами (Ala²⁵² и Ile²⁵³), а также молекулой воды (фиг.4B). Сходным образом, координация кальция в Nrp2 затрагивает три отрицательно заряженные аминокислоты (Glu¹⁹⁷, Asp²¹¹ и Asp²⁵², смотри фиг.S2). Эти три остатка абсолютно консервативны в доменах a2 двенадцати биологических видов с отдаленным родством (фиг.S3).

Выравнивание последовательностей в доменах a1 и a2 Nrp (фиг.S2) показывает, что эта триада заряженных остатков также строго законсервирована в пределах домена a1 Nrp. Однако в комплексе Nrp2/против Nrp^A-Fab нет указаний на наличие связанного иона в домене a1. Петли, способствующие остаткам, которые определяют предполагаемый сайт связывания Ca²⁺ в a1, плохо упорядочены, а это позволяет предположить, что Ca²⁺ играет определенную роль в свертывании домена. Основываясь на высокой степени консерватизма последовательности, можно считать, что они, вероятно, являются доменами.

Нейропилины функционируют как корецепторы для избранных членов класса 3 семейства семафоринов. На N-конце содержится сигнатурный домен "Sema", a 7-лопастной β-пропеллер (Antipenko, A., et al., Neuron 39, 589-98 (2003)), который необходим для связывания доменов a1a2 нейропилинов. Антитело против panNrp^A блокирует связывание Sema3 как с Nrp1, так и с Nrp2 (фиг.1), но не влияет на связывание VEGF (данные не показаны). В структуре комплекса Nrp2/против panNrp^A-Fab (фиг.4C) фрагмент Fab контактирует только с доменом a1 Nrp2 на плоскости сэндвича β8-5-10-3, скрытой от поверхности, доступной растворителю, приблизительно на 1400 Ų. Граница раздела, распознаваемая этим антителом, хорошо законсервирована между Nrp1 и Nrp2, поскольку 11 из 14 остатков Nrp2, которые имеют более 25% доступной поверхности, скрытой на границе раздела, идентичны в обоих рецепторах (фиг.4C). Распознавание эпитопа, который законсервирован между Nrp1 и Nrp2, объясняет способность антитела связывать оба рецептора с аффинностью в субнаномолярном диапазоне (фиг.S1).

На поверхности антитела 11 боковых цепей контактируют с Nrp2 из CDR L3, H2 и H3, 7 из которых являются ароматическими по своему характеру (фиг.4D). Предыдущие исследования наметили сайт связывания семафорина в Nrp1 с применением сайтспецифического мутагенеза (Gu, C. et al., J Biol Chem 111, 18069-76 (2002)). Основываясь на модели семафорина, были выбраны остатки для аминокислотных замещений на поверхности домена a1, которые, предположительно, доступны для растворителя. С применением этого подхода были идентифицированы многие мутанты, которые разрывают взаимодействия между Sema3A и Nrp1 (Gu et al., выше), и при картировании на модели a1 Npr1 они оказались расположенными на петлях одного из полюсов β-сэндвича a1 (фиг.4C). Замещения на другом конце домена не влияют на связывание Sema3A (Gu et al., выше). Мутации, разрушающие связывание Sema3A, прилегают к эпитопу, распознаваемому фрагментом Fab, блокирующим Sema3A (фиг.4C), а это строго позволяет предположить, что домен sema связывает петли и грань сэндвича 8-5-10-3 в пределах домена a1 Nrp2. Расположение сайта связывания семафорина также соседствует с предположительным сайтом связывания кальция в домене a1 (фиг.4C), а это позволяет предположить, что связывание кальция может играть роль во взаимодействиях между лигандом и рецептором.

Домены Nrp типа b содержат сайты связывания гепарина и VEGF

Домены b из структур b1b2 нейропилина человека (фиг.5A и ссылки Vander Koo et al., выше, Lee et al., выше) совмещают значительную гомологию с модулями связывания фосфолипидов (типа C2) факторов свертывания крови V и VIII (F5/8) (Macedo-Ribeiro et al., Nature 402, 434-9 (1999), Pratt, K.P., et al., Nature 402, 439-42 (1999)) и с доменом связывания галактозы бактериальной сиалидазы (Gaskell, A. et al., Structure 3, 1197-205 (1995)). Все вместе эти домены определяют складку дискоидина, которая топологически классифицируется как искривленный β-бочонок по типу рулета с джемом, состоящий из восьми стержневых β-нитей. Один полюс домена содержит три вытянутых "шпильки" или петли, которые типично составляют сайт связывания лиганда для членов семейства дискоидина (Macedo-Ribeiro et al., выше, Pratt et al., выше, Gaskell et al., выше). Фрагмент b1b2 Nrp1 и Nrp2 совмещает 50% идентичность последовательности и наложение с r.m.s.d. 2,3 Å по 307 атомам Ca (фиг.5A). В то время как домены b1 Nrp1 и Nrp2 почти неразличимы (r.m.s.d = 0,6 Å), домены b2 имеют не столь хорошее наложение (r.m.s.d. = 2,7 Å), причем их различия в значительной степени связаны с разной конформацией "шпилек" (фиг.5A). Поскольку эти шпильки часто определяют сайты связывания в пределах семейства дискоидина (Vander Kooi et al., выше, Lee et al., выше, Macedo-Ribeiro et al., выше, Pratt et al., выше, Gaskell et al., выше), несходство между Nrp1 и Nrp2 может представлять собой один из способов, благодаря которым разные нейропилины распознают разных партнеров для связывания.

Несмотря на различия между доменами b2 Nrp1 и Nrp2, домены b плотно упакованы и образуют жесткую платформу (фиг.5). Междоменное соединение формирует глубокую расщелину, которая идет практически перпендикулярно длинной оси двух доменов b (фиг.5). Эта расщелина, порожденная петлей β4:β5 домена b1 и петлей β5:β6 домена b2, окружена множеством положительно заряженных остатков, и, основываясь на экспериментах по мутагенезу с крысиным Nrp1 (Vander Koo et al., выше), представляет сайты связывания гепарина в Nrp. Кроме того, в структуре обоих Nrp человека представлен электроположительный участок (фиг.5B). C-концевой домен VEGF₁₆₅ (также известный как VEGF₅₅) (Fairbrother et al., Structure 6, 637-48 (1998)) также содержит сайт связывания гепарина. Поскольку гепарин увеличивает аффинность b1b2 в VEGF₁₆₅ до 100 раз (Mamluk, R. et al., J Biol Chem 277, 24818-25 (2002), Fuh, G. et al., J Biol Chem 275, 26690-5 (2000)), вполне возможно, что Nrp используют гепарин для комплектования VEGF₁₆₅ в этом участке.

В дополнение к этому опосредованному гепарином взаимодействию между экзоном 7 VEGF₁₆₅ C-концевой хвост VEGF (CDKPRR_COOH), кодируемый экзоном 8, может напрямую связываться с Nrp. В кристаллической структуре крысиного Nrp1-b1b2 в комплексе с тафтсином (Vander Kooi et al., выше), тетрапептидным миметиком (TKPR_COOH) хвоста VEGF (von Wronski, M.A. et al., J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)) C-концевой аргинин наглухо спрятан в кислотной бороздке, порожденной остатками из консервативных "шпилек" домена b1. В нескольких из наших структур, включая все три комплекса Fab, C-концевой остаток (гистидин) из симметрично связанной молекулы занимает тот же кислотный карман в пептиде тафтсина (фиг.S4).

Для дальнейшей детализации остатков, вовлеченных в связывание VEGF, была исследована поверхностная консервация остатков Nrp на поверхности b1b2 (фиг.5C). Между двенадцатью белками Nrp1 и Nrp2 законсервированы два соприкасающихся участка (фиг.S3). Один из этих сайтов картируется прямо по сайту связывания тафтсина, тогда как второй сайт включает остатки на границе участка связывания гепарина, а это позволяет предположить наличие дополнительной области для взаимодействий между Nrp и VEGF.

В кристаллической структуре комплекса Nrp1-b1/против Nrp1^B-Fab (фиг.5D) фрагмент Fab контактирует с эпитопом, расположенным между этими двумя предполагаемыми сайтами связывания VEGF и частично перекрывается с расщелиной для связывания тафтсина. Эпитоп этого антитела, блокирующего VEGF, необычен, поскольку включает только остатки из CDR L1 и H3. В среднем, границы раздела Fab/антиген скрыты на 1680 Ų от поверхности, доступной для растворителя (Lo Conte et al., J Mol Biol 285,2177-98 (1999)), однако на границе раздела Nrp1-b1/Fab защищены лишь 900 Ų. Несмотря на маленькую границу раздела, антитело против Nrp1^B прочно связывается с Nrp1 на уровне аффинности 0,2 нМ (Liang et al., выше, Pan et al., выше).

VEGF и Sema3A не конкурируют за связывание Nrp

В кристаллических структурах Nrp/Fab, рассматриваемых настоящим изобретением, связывающие эпитопы, блокирующие связывание VEGF и семафорина, отдалены друг от друга на 65 Å и расположены на противоположных сторонах Nrp (фиг.S5). В нескольких исследованиях было обнаружено, что VEGF и семафорины конкурируют за связывание на клеточной поверхности, причем эта конкуренция затрагивает частично перекрывающийся сайт связывания в домене b1 (Gu et al., выше, Miao, H.Q. et al., J Cell Biol 146, 2177-98 (1999), Narazaki, M. & Tosato, G., Blood 107, 3892-901 (2006)). Поскольку карбоксильные хвосты VEGF₁₆₅ и семафоринов класса 3 богаты основными (щелочными) остатками, было предположено, что эти хвосты могут конкурировать за электроотрицательную бороздку, создаваемую "шпильками" в домене b1 (Vander Kooi et al., выше, Lee et al., выше). В недавно опубликованной кристаллической структуре b1b2/тафтсина было идентифицировано, что хвост VEGF₁₆₅, по-видимому, занимает этот сайт связывания. Ранее мы показали, что антитело против NRP1^B не противодействует опосредованному Sema3A коллапсу аксонов из ганглиев задних корешков (DRG) (Liang et al., выше, Pan et al., выше), а это позволяет предположить, что C-концевые хвосты Sema3 не связываются с той же бороздкой.

В предыдущих экспериментах с конкуренцией (Gu et al., выше, Miao et al., выше, Narazaki et al., выше) были задействованы VEGF и семафорины, которые содержали гетерологичную метку (например, щелочную фосфатазу) на C-конце белка. Возможно, что наблюдаемая конкуренция скорее является результатом стерических столкновений свободных концов, чем прямой конкуренцией между хвостами VEGF и Sema3. Мы исследовали способность VEGF₁₆₅ противодействовать опосредованному Sema3 коллапсу роста аксонов из DRG. Даже в концентрации 100 мМ VEGF₁₆₅ не влияет на способность Sema3A вызывать спад актиновых процессов (фиг.1). Эти данные демонстрируют, что Sema3 не конкурирует с VEGF за связывание с доменом b1, а хвост семафоринов контактирует с другим сайтом в пределах этого домена.

Модели димеризации нейропилина

Nrp1 и Nrp2 могут образовывать гомо- или гетеромультимеры даже при отсутствии лиганда (Takahashi, L. et al., Cell 99, 59-69 (1999), Chen, H. et al., Neuron 21, 1283-90 (1998), Giger, R.J. et al., Neuron 21, 1079-92 (1998), Takahashi et al., Nat Neurosci 1, 487-93 (1998)), и, хотя точная стехиометрия комплексов нейропилина еще не установлена, широко допускается, что Nrp образуют гомодимеры при связывании лиганда. Современные данные показывают, что домен c необходим, но недостаточен для олигомеризации Nrp, поскольку усеченные мутанты, утратившие этот домен, демонстрируют меньшую мультимеризацию по сравнению с полноразмерным ECD (Takahashi et al., Cell 99, 59-69 (1999), Chen et al., выше, Giger et al., выше, Nakamura et al, Neuron 21, 1093-100 (1998)). Конструкции нейропилина, которые включают домены a1a2 и b1b2, обладают большей аффинностью к некоторым изоформам VEGF, чем конструкции, которые охватывают только домены b1b2 (Mamluk, R. et al., J. Biol. Chem. 277, 24818-25 (2002), Karpanen, T. et al., FASEB J 20, 1462-72 (2006), Giger, R.J. et al., Neuron 25, 29-41 (2000)), хотя домены a1a2 не связывают VEGF. Следовательно, вполне допустимо, что домены a1a2 вносят прямой вклад в димеризацию Nrp, то есть усиливают взаимодействия между Nrp и димером VEGF посредством стабилизации комплекса 2:2. Интересно, что кристаллические структуры Nrp2-a1a2b1b2 двух разных форм кристаллов (таблица 1) содержат законсервированную кристаллографическую границу раздела, которая опосредована a1. В этом димере домены a1 выстроены в виде грубой антипараллельной структуры вдоль нитей β7 и β8. Граница раздела спрятана приблизительно на 1200 Ų от области поверхности, доступной для растворителя и контролируется гидрофобными взаимодействиями (фиг.S5). Интересно, что похожие димеры наблюдались у других членов семейства домена CUB (Romero et al., выше). Однако исследование молекулярных масс трех конструкций Nrp2 (a2b1b2, a1a2b1b2 и a1a2b1b2c) многоугольным рассеянием света показало, что все три конструкции Nrp2 мономерны в растворе (данные не показаны). Эти данные означают, что гомодимеризация Nrp очень слаба в растворе, даже в присутствии домена MAM, а димеризация рецептора может происходить только при связывании лиганда. Ориентация кристаллографического димера Nrp2 позволяет предположить модель связывания VEGF. Поверхность раздела a1 создает седловидный димер шириной приблизительно 70 Å (фиг.6), достаточно большой для аккомодации димера VEGF₁₀₉, имеющего приблизительный размер 35×60 Å. Важно, что сайты связывания тафтсина и участки связывания гепарина находятся на внутренней поверхности седла. Гепарин может стабилизировать взаимодействия между сайтами связывания гепарина Nrp и VEGF и дополнительно облегчить объединение хвоста VEGF со "шпильками" b1. Такая структура также способна приспосабливать связывание VEGFR через домен связывания рецептора VEGF для отсылки сигналов вниз. Следовательно, хотя домены a1 не взаимодействуют с VEGF напрямую, они могут усиливать связывание VEGF с Nrp, поскольку они облегчают димеризацию Nrp. Этот димер может дополнительно обеспечивать связывание Sema3 (фиг.6). В кристаллической структуре Sema3A (Antipenko, A. et al., Neuron 39, 589-98 (2003)) два домена "sema" плотно упакованы вместе на границе раздела. При связывании с Nrp домены Sema семафорина 3A диссоциируются, что создает возможность для взаимодействий с первичным сайтом связывания a1a2 (Antipenko, et al., выше). В представленной здесь модели димера Nrp, опосредованного a1, два предполагаемых сайта связывания Sema3A расположены на противоположных сторонах и достаточно удалены друг от друга, чтобы вместить большие β-пропеллеры двух связанных молекул Sema3 (фиг.6 и S5).

Представленный здесь структурный анализ дает первую подробную картину двух частей ECD Nrp, предназначенных для связывания VEGF (b1b2) и семафорина (a1a2). Комплексы антител (фиг.3-5) наряду с предыдущими исследованиями по мутагенезу (Gu et al., выше, Vander Kooi et al., выше) очерчивают сайты связывания Nrp для домена Sema семафоринов и домен VEGF для связывания гепарина. Эти структуры создают основу для проведения дальнейших экспериментов по мутагенезу и намечают стратегии для выяснения структур Nrp в комплексе с их лигандами и сигнальными рецепторами VEGF, VEGFR, семафоринов и плексинов. В дополнение к этому, предложенные кристаллические структуры и другая информация, содержащаяся в настоящем изобретении, создают возможности для конструирования антагонистов и агонистов VEGF и/или семафорина, а также могут быть использованы в скринирующих анализах для идентификации таких антагонистов или агонистов.

Хотя в приведенном выше описании изобретение проиллюстрировано применительно к определенным вариантам его осуществления, это описание не является ограничивающим. Действительно, компетентному специалисту, исходя из вышеизложенного описания, в дополнение к тем вариантам осуществления изобретения, которые показаны и описаны в этой заявке, будут очевидны различные модификации этого изобретения, которые относятся к его сфере и соответствуют прилагаемой формуле изобретения.

Все библиографические источники, процитированные в описании этого изобретения, четко включены сюда в качестве ссылок во всей их полноте.

1. Антитело против panNrp^A, содержащее:
(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 7, или
(b) последовательность CDRL1 SEQ ID NO: 28, последовательность CDRL2 SEQ ID NO: 30 и последовательность CDRL3 SEQ ID NO: 32 или 33 и последовательность CDRH1 SEQ ID NO: 35, последовательность CDRH2 SEQ ID NO: 37 и последовательность CDRH3 SEQ ID NO: 39; или
его антигенсвязывающий фрагмент.

2. Антитело против panNrp^A по п.1, которое представляет собой антитело YW68.11, содержащее последовательность, показанную на фигуре 9А (SEQ ID NO: 9), или его антигенсвязывающий фрагмент.

3. Антитело против panNrp^A по п.1, которое представляет собой антитело YW68.11.26, содержащее последовательность, показанную на фигуре 9 В (SEQ ID NO: 10), или его антигенсвязывающий фрагмент.

4. Антитело против panNrp^A по п.1, которое связывается как с Nrp1, так и с Nrp2.

5. Антитело против panNrp^A по п.4, имеющее аффинность связывания как с Nrp1, так и с Nrp2, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 0,10 нМ.

6. Антитело против panNrp^A по п.4, имеющее аффинность связывания как с Nrp1, так и с Nrp2, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 0,15 нМ.

7. Антитело против panNrp^A по п.4, имеющее аффинность связывания как с Nrp1, так и с Nrp2, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 0,20 нМ.

8. Антитело против panNrp^A по п.4, имеющее аффинность связывания как с Nrp1, так и с Nrp2, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 0,25 нМ.

9. Антитело против panNrp^A по п.4, имеющее аффинность связывания как с Nrp1, так и с Nrp2, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 0,30 нМ.

10. Антитело против panNrp^A по п.4, блокирующее связывание Sema3 как с Nrp1, так и с Nrp2.

11. Антитело против panNrp^A по п.4, которое не блокирует связывание VEGF с Nrp1 или Nrp2.

12. Антитело против panNrp^A по п.10 или 11, ингибирующее биологическую активность семафорина in vitro.

13. Антитело против panNrp^A по п.10 или 11, ингибирующее биологическую активность семафорина in vivo.

14. Антитело против panNrp^A по пп.1, 4, 5 или 6, заключающее в себе дополнительную специфичность связывания.

15. Антитело против panNrp^A по п.14, где указанная дополнительная специфичность связывания представляет собой способность связывания VEGF.