Способ диагностики тяжелого течения язвенной болезни

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, гастроэнтерологии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики тяжелого течения язвенной болезни (ЯБ) у взрослых. Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что у пациентов ЯБ методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител определяют уровень экспрессии маркеров CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови и при уровне CD8 более 24,5% и CDDR более 15% диагностируют тяжелое течение ЯБ. Использование предложенного способа диагностики обеспечивает высокую информативность диагностики тяжелого течения язвенной болезни, своевременное прогнозирование тяжелого течения ЯБ, быструю диагностику, обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, гастроэнтерологии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики тяжелого течения язвенной болезни (ЯБ) у взрослых.

Известен способ диагностики тяжести течения ЯБ по числу обострений заболевания в течение года. Наличие у больных трех и более обострений за год позволяет считать заболевание с тяжелым течением. Недостатками этого метода являются: субъективность оценки испытываемых ощущений больным, что может вести к ошибкам в диагностике тяжести заболевания и к выбору неправильной тактики лечения. Кроме того, впервые выявленное обострение ЯБ не позволяет оценить будущую тяжесть течения, боли в животе и диспептические явления, связанные с погрешностью питания, могут восприниматься больным как очередное обострение, и, напротив, слабая выраженность жалоб при очередном обострении может не привлекать внимание больного. (Приказ Министерства здравоохранения СССР «о порядке проведения всеобщей диспансеризации населения» №770 от 30.05.1986 - С.62, (в редакции Приказа Минздрава РФ №270 от 12.09.1997).

Есть способ диагностики тяжести ЯБ по степени обсеменения СОЖ Helicobacter pylori. Недостаток состоит в том, что степень обсеменения оценивается по результатам нескольких биоптатов СОЖ, но степень обсеменения может быть неравномерной, кроме того, инвазивный метод является травматичным. (Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. - М.: Триада-X, 1998 - 483 с.).

Известен способ определения тяжести заболевания по состоянию фракций воды в составе биомакромолекул форменных элементов крови. Чем тяжелее течение у больных, тем наблюдается более выраженное снижение связанной и увеличение свободной фракции воды. Недостатками этого метода является неоднозначность интерпретации результатов, использование сложных, нетрадиционных методов исследования. (Патент на изобретение №2312584, 2007, C.1).

ЯБ характеризуется различной этиологией, сложным патогенезом с хроническим рецидивирующим течением, морфологическим эквивалентом в виде дефекта слизистого и подслизистого слоев с исходом в соединительнотканный рубец. У пациентов с тяжелым течением периоды ремиссии кратковременны, не более 3-4 месяцев в году, болевой и диспепсический синдромы выражены значительно. Это заболевание является причиной длительных страданий большого количества людей, значительно ухудшая качество их жизни. Кроме того, течение заболевания сопровождается высоким уровнем деструктивных и неопластических осложнений, приводящих к трудопотерям, инвалидизации, летальным исходам, что влечет за собой возрастание экономических убытков для всего общества.

В силу большого количества синдромальных клинических проявлений ЯБ для постановки диагноза необходимы клинические и биохимические анализы крови, анализ кала на скрытую кровь, гистологическое и цитологическое исследование биоптатов, уреазный тест, эзофагогастродуоденоскопию с прицельной биопсией и щеточным цитологическим исследованием, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и другие методы. Дополнительные исследования проводятся при подозрении на злокачественную язву, при наличии осложнений и сопутствующих заболеваний.

Эти методы исследования в сочетании с данными, полученными при изучении клинической картины и анамнеза, позволяют с большей достоверностью установить наличие ЯБ и тяжесть ее течения. (Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. - М.: Триада-Х, 1998 - 483 с. Приказ Министерства здравоохранения СССР «о порядке проведения всеобщей диспансеризации населения» №770 от 30.05.1986 - С.62 (в редакции Приказа Минздрава РФ №270 от 12.09.1997). Патент на изобретение №2312584, 2007, C.1). Недостатками используемых методов диагностики ЯБ является большая продолжительность по времени, связанная с применением большого количества инструментальных и специальных методов исследования, неоднозначностью интерпретации результатов. Кроме того, большинство исследований отличаются высокой стоимостью, привлечением консультирующих врачей других специальностей, отсутствием, в большинстве случаев, медицинской документации, содержащей полноценный анамнез.

Целью изобретения является повышение эффективности дифференциальной диагностики тяжелого течения ЯБ путем определения уровня экспрессии маркеров CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови, что приводит к ускорению постановки диагноза, своевременному прогнозированию степени тяжести ЯБ, обеспечению большей экономичности и более рациональному выбору терапевтических мероприятий.

Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что у пациентов ЯБ определяют степени экспрессии лимфоцитами маркеров CD8, CDDR методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при уровне CD8 более 24,5% и CDDR более 15% диагностируют тяжелое течение ЯБ.

Определяли количество CD8 и CDDR маркеров. СD8 является маркером киллерно-цитотоксической субпопуляции лимфоцитов, характеризующим активность воспалительного процесса по клеточному типу, который имеет место при ЯБ. CDDR-маркер второго этапа активации лимфоцитов, характеризующий выраженность их активации, что также характерно для ЯБ.

Динамика иммунологических сдвигов, наблюдаемая у больных с тяжелым течением ЯБ по отношению к легкому и среднетяжелому течению, характеризуется выраженным иммунным воспалением клеточного типа (возможно, Thl-ответ) с участием киллерно-цитоксической субпопуляции лимфоцитов (CD8) и высокой степенью их активации (CDDR). В связи с этим определение степени экспрессии лимфоцитами маркеров CD8, CDDR может служить диагностическим критерием тяжелого течения ЯБ.

Способ осуществляется следующим образом: из пробы гепаринизированной крови (4-5 мл), взятой натощак у больных ЯБ, выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-верографина.

Затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD8, CDDR) и инкубируют 30-45 мин при +4°C. Затем добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g.

К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab~)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения используют раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°C, затем клетки 2 раза отмывают, как указано выше.

Окрашенные клетки анализируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендируют, переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и препарат просматривают под иммерсией с увеличением (×3; объектив ×90).

Количество антигенпозитивных клеток определяют как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами. По экспрессии лимфоцитами маркеров CD8, CDDR судят о тяжелом течении ЯБ.

ПРИМЕР

Больной А., 46 лет, водитель такси. Обратился в поликлинику с жалобами на умеренную боль в эпигастральной области, возникающую через 1,5-2 часа после приема пищи, и ночные боли, прекращающиеся после еды, изжогу, тошноту. Указанные жалобы беспокоят в течение 6 дней. За медицинской помощью не обращался, самостоятельно принимал но-шпу и соду, что давало кратковременный эффект. Курит по 20 сигарет в день.

Данные физического обследования: общее состояние средней тяжести. Температура тела 36,6°C. Кожные покровы телесного цвета. Дыхание везикулярное, 18 в 1 мин. Ритм сердца правильный 68 в мин. АД 110/70 мм рт.ст. Язык обложен белым налетом. Живот мягкий, болезненный в эпигастрии и зоне проекции привратника (на 2 см вправо от пупка). Печень, селезенка не увеличены. Симптом Пастернацкого отрицательный. Физиологические отправления в норме.

Данные анамнеза: 3 года назад впервые установлен диагноз язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. Лечение на момент осмотра: омез 20 мг - 2 р/д 10 дней, альмагель по 1 столовой ложке через час после еды 5 дней. Больше за медицинской помощью не обращался. 3-4 раза в год отмечает вышеперечисленные симптомы. Самостоятельно принимал омез, ранитидин.

Данные дополнительных методов исследования.

Общий анализ крови: Нв 140 г/л, Эр 4,1*10¹²/л, Л 7,2*10⁹/л, СОЭ 7 мм/час.

Общий анализ мочи: удельный вес 1020, цвет соломенно-желтый, реакция кислая, Л 1-2 в п/зр, Эр 0-1 в п/зр.

ЭКГ: ритм синусовый, ЧСС 72 в мин, нормальное положение ЭОС.

ККФ: легочные поля прозрачные, сердце без видимой патологии.

УЗИ органов брюшной полости: без видимой патологии.

Анализ кала на скрытую кровь (реакция Грегерсена): отрицательный. ФГДС: язва луковицы двенадцати перстной кишки 0,4*0,6 см, хронический эрозивный гастрит, бульбит. Рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки 2-3 степени.

Уреазный тест: Helicobacter pylori резко положительный

Микроскопия мазков отпечатков окрашенных по Граму биоптатов из антрального отдела и тела желудка: Helicobacter pylori типичные спиралевидные формы в очень большом количестве.

Уровень экспрессии маркеров CD8 28,60%, CDDR 18,4% лимфоцитами периферической крови. То есть CD8 был более 24,5% и CDDR более 15%. Что позволило поставить диагноз: Язвенная болезнь с локализацией язвы в луковице 12 п. кишке, тяжелой степени, 2 степени выраженности, стадия обострения, и назначить своевременно лечение.

Сопутствующий: хронический эрозивный гастрит.

Осложнение: рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки 2-3 степени.

Способ диагностики язвенной болезни у взрослых по уровню экспрессии маркеров CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови был апробирован на группах сравнения между 38 пациентами легкой степени тяжести ЯБ, 45 пациентами со средней степенью тяжести ЯБ и 10 пациентами с тяжелым течением ЯБ.

Всем обследованным производился забор крови и определение уровня экспрессии маркеров CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови вышеперечисленным способом.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице.

Полученные данные показали, что при тяжелой степени течения ЯБ уровень маркеров CD8, CDDR достоверно увеличивается по сравнению со средней и легкой степенью тяжести ЯБ. Диагноз в исследуемых группах был подтвержден основными методами диагностики.

Для обработки полученного материала и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «STATGRAPHICS PLUS». Вычисляли среднюю и ошибку средней (M±m). Сравнение в исследованных группах проводили попарно при помощи параметрических методов, так как изучаемые выборки могли быть аппроксимированы нормальным законом распределения. Сравнение осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t) (сравнение средних) и Фишера (сравнение средних квадратических отклонений). Уровень достоверности оценивали значением «p». Различия при сравнении считали достоверными с вероятностью более 95% при Р<0,05.

Таким образом, полученные данные показали, что при тяжелом течении ЯБ уровень маркеров CD8, CDDR достоверно увеличивается по сравнению со средним и легким течением ЯБ, следовательно, уровень экспрессии молекул CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови можно считать высокочувствительными маркерами тяжелой степени течения ЯБ.

Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:

1) высокую информативность для дифференциальной диагностики тяжелого течения язвенной болезни за счет определения уровня экспрессии молекул CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови;

2) своевременное прогнозирование тяжелого течения ЯБ, т.к это обеспечит экономичность, а также рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий пациентам с ЯБ;

3) быструю диагностику, т.к необходимо только определить уровень экспрессии маркеров CD8, CDDR лимфоцитами периферической крови;

4) благодаря быстрой диагностике обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

	CD8 (%) M±m (min, max)	CDDR (%) M±m (min, max)
Легкое течение(n=38)	22,03±0,92* (19,0±24,0)	13,00±1,04 (10,0±15,0)
Среднее течение (n=45)	21,13±0,79* (16,0±23,0)	12,05±0,78 (8,0±14,0)
Тяжелое течение (n=10)	25,6±1,16** (24,5±30,0)	17,0±1,67* (15,00±22,00)
Примечание: * - р<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении с тяжелым течением ЯБ.
**- р<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении с легким течением ЯБ.

Способ диагностики тяжелой степени течения язвенной болезни, включающий исследование периферической крови, отличающийся тем, что проводят определение степени экспрессии лимфоцитами маркеров CD8, CDDR методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при содержании в периферической крови маркеров CD8 более 24,5%, CDDR более 15% диагностируют тяжелое течение язвенной болезни.