Способ культивирования каллусной ткани centaurea scabiosa l


 


Владельцы патента RU 2458121:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Томский государственный университет" (ТГУ) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения - медицинская промышленность, получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения. Способ культивирования каллусной ткани Centaurea Scabiosa l., включает получение каллусной культуры из эксплантов интактных растений путем приготовления питательной среды Мурасиге-Скуга с дальнейшим разливом среды и выращиванием каллусной культуры. Каллусную культуру получают на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5-1 мг/л НУК (α-нафтилуксусной кислоты) и 0,2-0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), разливом среды Мурасиге-Скуга в пластиковые чашки Петри, пересадкой каллусной культуры в эти чашки и дальнейшим выращиванием каллусной культуры в пластиковой чашке Петри на синем свету (380-560 нм). Изобретение позволяет повысить ростовой индекс каллусной культуры. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения - медицинская промышленность, получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения.

Известен способ выращивания каллусной культуры Cistanche deserticola (статья Jie Ouyang, Xiaodong Wang, Bing Zhao, Yuchun Wang. Light intensity and spectral quality influencing the callus growth of Cistanche deserticola and biosynthesis of phenylethanoid glycosides // Plant Science - 2003 - Vol.165, pp.657-661). Каллусную культуру Cistanche deserticola получали из интактных растений, выращенных из предварительно простерилизованных семян, на среде Мурасиге-Скуга, содержащей дополнительно 1 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л кинетина и 1 мг/л гиббереллиновой кислоты. Полученные каллусы переносили на среду В5 в колбы Эрленмейера и выращивали в условиях освещения селективным светом интенсивностью 24 мкмоль/м2с. Установлено, что синий свет стимулировал накопление биомассы каллусной культуры и фенилэтаноидных гликозидов в ней по сравнению с культурой, выращиваемой на белом свету.

Недостатком известного способа является то, что он был использован для культивирования только Cistanche deserticola, относящейся к семейству Orobanchaceae (Заразиховые), в то время как Centaurea scabiosa относится к семейству Asteraceae или Compositae (Астровые или Сложноцветные). Для выращивания каллусной культуры используется среда В5, имеющая измененный состав основных макро- и микросолей по сравнению с средой MS. Дополнительно в среду добавляют гидролизат казеина, что усложняет и увеличивает стоимость приготовления питательной среды, особенно в больших объемах.

Известен способ культивирования in vitro клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum l., содержащего ген интерлейкина-18 человека (патент РФ №2354692, C12N 5/04, опубл. 10.05.2009 г.) Изобретение может быть использовано в фармакологии для выращивания биомассы клеточной культуры трансгенного табака Nicotiana tabacum L., содержащего ген интерлейкина-18 человека, а также в исследовательских целях. Семена трансгенных растений Nicotiana tabacum L. стерилизуют, переносят на безгормональную питательную среду и проращивают in vitro на свету в течение 28 суток. Полученные проростки рассекают на сегменты размером 0,2-0,3 см2, переносят на модифицированную питательную среду, включающую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, индолилуксусную кислоту и кинетин. Для стерилизации семян используют раствор, состоящий из 96%-ного этанола, 37%-ной перекиси водорода и воды в объемном соотношении 7,5:1:1. Образовавшийся каллус, содержащий ген интерлейкина-18 человека, культивируют в темноте в течение 21-28 суток и размножают пассированием до требуемого количества.

Недостатком известного способа является то, что для культивирование используется клеточная культура трансгенного табака Nicotiana tabacum, что мешает применить полученные данные к клеточным культурам растений других родов и семейств. Также недостатком является то, что используется трансгенное растение, введение чужеродного гена может отрицательно сказаться на функционировании генома и привести в дальнейшем к генным и хромосомным нарушениям, что будет мешать стабильному выращиванию данной культуры. Получение трансгенных растений для культивирования связано с большим объемом предварительных работ по созданию генетической конструкции и внедрению ее в растительный геном.

Известен способ культивирования Artemisia annua L. (статья Yuchun Wang, Haoxian Zhang, Bing Zhao, Xiaofan Yuan. Improved growth of Artemisia annua L hairy roots and artemisinin production under red light conditions // Biotechnology Letters - 2001 - Vol.23, pp.1971-1973). В настоящем изобретении культуру генетически-модифицированных корней (hairy-root) выращивают в жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга, с добавлением сахарозы 30 г/л на орбитальном шейкере (120 об/мин) при 25±1ºС на свету с интенсивностью 25 мкмоль/м2 с и фотопериодом 16 часов. Для ускорения роста культуру освещали красным, синим, зеленым и желтым светом, интенсивностью 25 мкмол/м2с и фотопериодом 16 часов. Установлено, что красный свет стимулирует рост культуры hairy-root и накопление сесквитерпенового лактона артемизинина в отличие от других участков спектра.

Недостатками известного способа является то, что данный способ культивирования применим к определенному виду однолетнего растения - Artemisia annua L., в то время как авторами установлен оптимальный световой режим культивирования для многолетнего растения Centaurea scabiosa L. Кроме того, данный способ культивирования изучен только на культуре hairy-root Artemisia annua L., мало используемой в практической деятельности, не исследовано его применение для выращивания каллусных и суспензионных культур, которые составляют основу промышленной биотехнологии растений. Для получения культуры hairy-root используется генетическая модификация клеток Ti-плазмидой бактериальной культурой Agrobacterium rhizogenes, что может приводить к нарушениям работы генетического аппарата растительных клеток, снижению жизнеспособности, ростовых параметров и продуктивности первичного и вторичного метаболизма.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани Centaurea scabiosa L., перспективной в качестве возможного источника сесквитерпеновых лактонов лекарственного действия, с целью ускорения ее роста и высокого выхода биомассы, посредством применения определенного режима освещения.

Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани Centaurea scabiosa L. включает в себя получение каллусной культуры из эксплантов интактных растений путем выращивания эксплантов на питательной среде Мурасиге-Скуга с дальнейшем разливом среды и выращиванием каллусной культуры, но в отличие от прототипа каллусную культуру получают на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5-1 мг/л НУК (α-нафтилуксусной кислоты) и 0,2-0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин). Полученную каллусную культуру затем пересаживают в пластиковые чашки Петри со средой Мурасиге-Скуга без изменения ее состава и в дальнейшем культивируют на синем свету (380-560 нм).

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:

KNO3 1900
NH4NO3 1650
CaCl2 332
MgSO47H2O 370
KH2PO4 170
FeSO47H2O 27,85
Na2ЭДTA 37,25
Н3ВО3 6,2
MnSO45H2O 24,1
ZnSO47H2O 8,6
Na2MoO4 0,25
KI 0,83
CuSO45H2O 0,025
CoCl26H2O 0,025
Пиридоксин 1,0
Тиамин хлорид 1,0
Никотинамид 2,0
НУК 1-0,5
6-БАП 0,5-0,2
Сахароза 15000
Глюкоза 15000
Агар 9000
Вода До 1 л

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин), НУК (α-нафтилуксусная кислота), сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 1,35 г агара, разливают среду по 150 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Простерилизованную питательную среду в асептических условиях разливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм по 15-20 мл на каждую чашку. Ткань высаживают в возрасте 25-30 суток, инокулюм 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1ºС в условиях освещения синим светом интенсивностью 160 мкМ м2/с люминесцентными лампами Philips TL-D 36W/18. Световой поток выровнен по падающим квантам.

Примеры осуществления изобретения приведены ниже.

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNО3 1900 мг/л, NH4NO3 1650 мг/л, MgSO47H2O 370 мг/л, KH2PO4 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н3ВО3 6,2 мг/л, MnSO45H2O 24,1 мг/л, ZnSO47H2O 8,6 мг/л, Na2MoO42О 0,25 мг/л, KI 0,83 мг/л, CuSO45H2O 0,025 мг/л, СоСl22O 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO47H2O 27,85 мг/л, Nа2ЭДТА 37,25 мг/л), CaCl2 (CaCl26H2O 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин 1,0 мг/л, Тиамин хлорид 1,0 мг/л, Никотинамид 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, СаСl2, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (0,2 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 1,35 г агара, разливают среду по 150 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Затем в ламинаре простерилизованную питательную среду разливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм по 15-20 мл на каждую чашку. Ткань высаживают в возрасте 25-30 суток, инокулюм 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1ºС в условиях освещения синим светом интенсивностью 160 мкМ м2/с люминесцентными лампами Philips TL-D 36W/18. Световой поток выровнен по падающим квантам.

Пример 2

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO47H2O - 370 мг/л, КH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н3ВО3 - 6,2 мг/л, MnSO45H2O - 24,1 мг/л, ZnSO47H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, СuSO42O - 0,025 мг/л, СоСl22O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO47H2O - 27,85 мг/л, Nа2ЭДТА - 37,25 мг/л), CaCl2 (CaCl26H2O - 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин - 1,0 мг/л, Тиамин хлорид - 1,0 мг/л, Никотинамид - 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fе-хелат, СаСl2, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (1 мг/л), НУК (0,5 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 1,35 г агара, разливают среду по 150 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Затем в ламинаре простерилизованную питательную среду разливают в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм по 15-20 мл на каждую чашку. Ткань высаживают в возрасте 25-30 суток, инокулюм 200-300 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1ºС в условиях освещения синим светом интенсивностью 160 мкМ м2/с люминесцентными лампами Philips TL-D 36W/18. Световой поток выровнен по падающим квантам. В Таблице 1 приведен ростовой индекс каллусной культуры Centaurea scabiosa L., выращенной на свету разного спектрального состава.

Таблица 1
Ростовой индекс каллусной культуры Centaurea scabiosa L., выращенной на свету разного спектрального состава
Вариант Ростовой индекс
Темнота 2,1±0,2
Белый свет 1,8±0,3
Красный свет 2,6±0,2
Синий свет 4,0±0,4
Зеленый свет 2,6±0,6

Способ культивирования каллусной ткани Centaurea Scabiosa l., включающий получение каллусной культуры из эксплантов интактных растений путем приготовления питательной среды Мурасиге-Скуга с дальнейшим разливом среды и выращиванием каллусной культуры, отличающийся тем, что каллусную культуру получают на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5-1 мг/л НУК (α-нафтилуксусной кислоты) и 0,2-0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), разливом среды Мурасиге-Скуга в пластиковые чашки Петри, пересадкой каллусной культуры в эти чашки и дальнейшим выращиванием каллусной культуры в пластиковой чашке Петри на синем свету (380-560 нм).



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к лесному хозяйству, а именно к созданию сортового плантационного лесовыращивания на основе современных инновационных биотехнологий. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму продуценту стефарина. .

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для мультипликации культур, трудно размножаемых вегетативным способом. .
Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологической промышленности при получении тритерпеновых сапонинов и флавоноидов из клеточной культуры растения in vitro.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной технологии, медицине и трансплантологии
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака N. tabacum L., содержащей ген uidA, включающий получение эксплантов, индукцию каллусогенеза и последующее субкультивирование. Изобретение позволяет отобрать перспективные линии, характеризующиеся максимальной скоростью роста и максимальным уровнем экспрессии гена uidA. 1 ил., 5 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения в растении или в его части химерных вирусоподобных частиц (VLP). Частицы сходны с частицами вируса гриппа. Способ включает экспрессию химерного НА вируса гриппа в растении или в части растения. Данное изобретение относится также к VLP, включающей химерный белок НА вируса гриппа и липиды растений. Изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, кодирующей химерный НА вируса гриппа, и вектору. VLP могут быть использованы для приготовления вакцин против гриппа или для улучшения существующих вакцин. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 18 н. и 19 з.п. ф-лы, 60 ил., 5 табл., 5 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой противомикробную композицию для желудочно-кишечного применения, содержащую смесь водорастворимого экстракта растительной ткани, содержащего полифенол, включающий танин, и экзогенного пероксида водорода; где экстракт оказывает секвестрирующий эффект на пероксид водорода в смеси и композиция уничтожает бактерии при контакте с бактериями. В следующем варианте осуществления композиция может также дополнительно содержать инактивированных эндогенных ферментов. Изобретение позволяет получить противомикробные композиции, эффективно работающие для лечения желудочно-кишечных инфекций. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 14 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Предложена система контроля фотосинтетического и дыхательного СО2-газообмена в культуре in vitro. Система герметичным образом через типовой уплотнитель сопрягается с прозрачным технологическим объемом in vitro с культивируемыми полноценными растениями на различных этапах онтогенеза, регенерантами, изолированными органами и тканями. Система образует вместе с подключенным технологическим объемом общий замкнутый герметичный воздушный контур. Контур состоит из последовательно соединенных между собой указанного технологического объема и воздушного насоса, ротаметра, воздушного осушителя и CO2-газоанализатора. Контур между CO2-газоанализатором и технологическим объемом in vitro дополнительно оборудован двухпозиционным газовым переключателем. Изобретение обеспечивает многократную воспроизводимость процедуры измерения. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ элиминации бактериальной инфекции клеточных культур растений, включающий культивирование суспензионных клеточных культур с использованием антибактериального агента, где в качестве антибактериального агента используют водную суспензию наночастиц серебра диаметром 20-80 нм, которую вносят в суспензионную клеточную культуру до конечной концентрации в культуральной среде 50 мкг/мл, при этом культивирование осуществляют 24 часа в стандартных условиях. Изобретение позволяет обеззараживать клеточные культуры растений и сопровождается ускорением процесса очистки культур от инфекции, пролонгированным антибактериальным действием, и отсутствием цитотоксического действия. 2 табл., 1 пр. .

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L), включающий в себя посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м2с, отбор эксплантов 3-4 недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5-2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3-0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса. Изобретение позволяет получить каллусную культуру болиголова пятнистого. 1 табл.
Наверх