Бактериальный сенсор для детекции изменения ph



Бактериальный сенсор для детекции изменения ph
Бактериальный сенсор для детекции изменения ph
Бактериальный сенсор для детекции изменения ph

 


Владельцы патента RU 2458137:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, а именно к бактериальному сенсору для детекции изменения pH. Изобретение может быть использовано в медицине для ранней диагностики рака желудка. Сенсорным элементом является бактериальная клетка Helicobacter pylori, содержащая плазмиду pHP, представленную на фиг.1, с бактериальным геном gfp под контролем индуцибельного стрессового промотора PflaA. Предложенное изобретение позволяет быстро и достоверно измерять pH в широком диапазоне. 3 ил., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, может быть использовано в медицине для ранней диагностики рака желудка и касается способа использования генетически модифицированных бактерий Helicobacter pylori в качестве бактериального сенсора.

Уровень техники

В настоящее время в мире разрабатываются новые высокопроизводительные, неинвазивные и эффективные методы детекции химических и биологических агентов, имеющих значение для медицинской диагностики, мониторинга окружающей среды, контроля безопасности продуктов питания. Одним из таких направлений является разработка биосенсоров, представляющих собой биологическую систему, способную генерировать измеряемый сигнал в ответ на появление (изменение) специфического агента во внешнем окружении [1]. Биосенсорные системы можно разделить на три основных типа, в зависимости от сенсорного компонента: молекулярные, клеточные и тканевые [2-4]. Для создания молекулярных биосенсорных систем используются субклеточные элементы или макромолекулы: антитела, нуклеиновые кислоты, ферменты, ионные каналы и липидный бислой. Основным преимуществом таких систем является высокая специфичность, селективность и быстрота проведения реакции. Однако при использовании таких систем невозможно получить функциональную информацию, в частности, о биосовместимости аналитов. Кроме того, длительность выделения и экстракции макромолекул, с учетом относительно короткого время их жизни, накладывает ограничения на использование этих биосенсорных систем.

Генетически модифицированные клеточные системы стабильны при различных условиях внешней среды, включая изменение температуры или pH. Более того, данные системы могут быть специально адаптированы для идентификации химических токсинов и генотоксинов.

В разработке Rupani и др. [5] была использована бактерия Escherichia coli, трансформированная генно-инженерной конструкцией, состоящей из репортерной системы lux (люцифераза) под контролем промотора белка теплового шока GrpE. Оценивался эффект температуры, стадии роста и индуктора (этанол), концентрация этанола на кинетику и уровень люминесценции.

В другой работе был получен транскрипционный составной белок в Escherichia coli из репортерной системы luxCDABE под контролем промоторов белков UspA и GrpE и проведена оценка интенсивности флуоресцентного ответа при высоких температурах. Было показано, что никель и кобальт в концентрации 0.3 мкМ уже вызывают увеличение экспрессии cnrYXH-luxCDABE [6].

Таким образом, применение клеточных биосенсорных систем является наиболее перспективным инструментом для разработки роботизированных, малозатратных, количественных методов для быстрой и селективной детекции химических и биологических агентов в области медицинской диагностики, мониторинга окружающей среды, безопасности продуктов питания. Уникальность данных технологий заключается в регистрации процессов, происходящих в интактной, живой клеточной системе в режиме реального времени.

Техническим результатом, на который направлено изобретение, является повышение быстродействия и достоверности показаний бактериального сенсора в широком диапазоне изменений pH.

Для этого предложен бактериальный сенсор для детекции изменения pH, где сенсорным элементом является бактериальная клетка Helicobacter pylori, содержащая плазмиду pHP с бактериальным геном gfp под контролем индуцибельного стрессового промотора PflaA.

Бактериальная клетка Helicobacter pylori трансформируется плазмидой pHP, в составе которой находится бактериальный ген gfp под контролем индуцибельного стрессового промотора PflaA. При изменении pH окружающей среды в кислую сторону происходит активация индуцибельного промотора PflaA, повышение уровня экспрессии гена gfp и, соответственно, усиление регистрируемой флуоресценции. При изменении рН окружающей среды в щелочную сторону происходит репрессия индуцибельного промотора PflaA, снижение уровня экспрессии гена gfp и, соответственно, ослабление регистрируемой флуоресценции. Отличительной особенностью сенсора является стабильность бактериальной клетки как в сильно кислых, так и в сильно щелочных, а также мгновенный ответ сенсора на изменение pH, выражающийся в достоверном изменении флуоресценции.

Использование в качестве бактериального сенсора именно H.pylori объясняется тем, что эта бактерия (в отличие от используемых ранее бактерий для создания различных биосенсоров) в силу ограниченных метаболических возможностей в значительной степени зависит от состояния окружающей среды, в том числе и от состояния колонизируемой эпителиальной клетки. Таким образом, перестройка метаболических потоков в бактерии при изменении состояния хозяина и/или окружающей среды является причиной и следствием активации генетического аппарата микроорганизма, что выражается в изменении уровня экспрессии генов.

Helicobacter pylori - грамотрицательная, микроаэрофильная бактерия, колонизирующая слизистую желудка у примерно половины мирового населения. Инфекция H.pylori, являющаяся причиной хронического воспаления, часто не имеет клинических проявлений, но приблизительно у 10% инфицированных она ассоциирована с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическими гастритами, аденокарциномой или экстранодальной В-клеточной MALT-лимфомой [7]. В связи с этим использование в качестве биосенсора этой бактерии позволит проводить раннюю диагностику неопластических процессов в желудке.

На фигуре 1 дано схематическое изображение плазмиды pHel. Нуклеотидную последовательность, соответствующую индуцибельному стрессовому промотору PflaA, синтезируют на автоматическом синтезаторе нуклеиновых кислот ASM-700 (Биоссет, Россия) и клонируют в плазмидный вектор pHP [8] по сайту рестрикции NcoI, содержащий ген GFP и ген устойчивости к хлорамфениколу. Нуклеотидная последовательность индуцибельного стрессового промотора PflaA приведена на фигуре 2. Полученной плазмидой трансформируют бактерии Helicobacter pylori для получения модифицированных бактерий.

Примеры реализации изобретения

1. Трансформация Helicobacter pylori плазмидным вектором pHP

Культуру клеток H.pylori, выросшую на чашках, в течение 24 часов суспендируют в среде BHI (Biomerieux, France) и добавляют к ним плазмиду pHP, после чего наносят каплями на поверхность агаризованной среды BHI. Чашки с агаром инкубируют в течение суток при 37°С и 5% CO2. По окончании трансформации клетки смывают физиологическим раствором и распределяют по поверхности агара, содержащего антибиотик хлорамфеникол (10 мкг/мл). Трансформанты детектируют на 5-7 день инкубации. Для получения модифицированного штамма Helicobacter pylori отдельные колонии отбирают пипеткой, суспендируют в жидкой питательной среде BHI, содержащей 10% FBS (HyClone, США), 5% дрожжевого экстракта (МедГамал, Россия) и хлорамфеникол в указанной концентрации. Жидкую культуру штамма поддерживают пассированием каждые 48 часов в присутствии антибиотика.

2. Детекция изменения pH среды с использованием бактериального сенсора на основе штамма бактерий Helicobacter pylori

Бактериальный штамм Helicobacter pylori, трансформированный плазмидой pHP, культивируют в течение 24 ч в жидкой питательной среде BHI, содержащей 10% FBS (HyClone, США), 5% дрожжевого экстракта (МедГамал, Россия) и 10 мкг/мл хлорамфеникола. Отбирают четыре порции культуры по 1 мл и центрифугируют при 6000 об/мин 10 мин. Осадок промывают 1 мл физиологического раствора и ресуспендируют в 1 мл жидкой среды BHI (pH 7.0) без добавок. В опытные пробирки добавляют 10 мкл 1н. соляной кислоты (pH 6.5), 50 мкл 1н. соляной кислоты (pH 3.0) и 10 мкл 1н. гидроксида натрия (pH 8.5). На предметное стекло наносят по 1 капле культуры из опытных и контрольной пробирок. Регистрацию флуоресценции проводят с использованием флуоресцентного микроскопа Eclipse C800 (Nikon, Япония). Результаты опыта по изменению флуоресценции клеток штамма Helicobacter pylori, трансформированного плазмидой pHP, при изменении pH приведены на фигуре 3.

Литература

1. Siontorou C.G., Batzias F.А. // Crit Rev Biotechnol. - 2010. - V.30. - P.79-98.

2. Pancrazio J.J., Whelan J.P., Borkholder D.A., Ma W., Stenger D.A. // Ann Biomed Eng. - 1999. - V.27. - P.697-711.

3. Wanekaya A.K., Chen W., Mulchandani A. // J Environ Monit. - 2008. - V.10. - P.703-712.

4. Wilson G.S., Ammam M. // FEBS J. - 2007. - V.274. - P.5452-5461.

5. Rupani S.P., Gu M.B., Konstantinov K.B., Dhurjati P.S., Van Dyk Т.K., LaRossa R.A. // Biotechnol Prog. - 1996. - V.12. - P.387-392.

6. Van Dyk Т.K., Smulski D.R., Reed T.R., Belkin S., Vollmer A.C., LaRossa R.A. // Appl Environ Microbiol. 1995. - V.61. - P.412-417.

7. Polk D.B., Peek R.M. Jr. // Nat Rev Cancer. - 2010. - V.10. - P.403-414.

8. Heuermann D., Haas R. // Mol Gen Genet. - 1998. - V.257. - P.519-528.

Бактериальный сенсор для детекции изменения pH, отличающийся тем, что сенсорным элементом является бактериальная клетка Helicobacter pylori, содержащая плазмиду pHP, представленную на фиг.1, с бактериальным геном gfp под контролем индуцибельного стрессового промотора PflaA.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и может быть использовано для оценки способности бактерий к биохимической детоксикации микотоксинов с целью последующего включения наиболее перспективных видов и штаммов в пробиотические препараты направленного действия - на биотрансформацию микотоксинов.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа.
Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии. .

Изобретение относится к области биологии, может быть использовано для экологического мониторинга и оценки водоемов. .
Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается скрининга (поиска) пробиотических препаратов против кислотоустойчивых микроорганизмов и может быть использовано для скрининга (поиска) пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов in vivo.

Изобретение относится к биохимии. .
Изобретение относится к медицинской микробиологии, дерматовенерологии и лабораторной диагностике и представляет собой контрольный штамм Neisseria gonorrhoeae, предназначенный для внутрилабораторного контроля качества исследований при проведении лабораторной диагностики гонококковой инфекции культуральным методом.

Изобретение относится к области токсикологии и санитарно-гигиенических измерительных технологий, а именно к способам измерения и испытания с использованием жизнеспособных микроорганизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается целлюлазных слитых белков. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белков, обладающих нейромодуляторным действием по отношению к никотиновым ацетилхолиновым рецепторам человека, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к микроорганизму-носителю нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены и белковые токсины, включающему первый компонент, представленный по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один полный или неполный антиген по меньшей мере одного белка дикого типа или мутантного белка, второй компонент, представленный по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один белковый токсин и/или по меньшей мере одну субъединицу белкового токсина, третий компонент, состоящий по меньшей мере из одного первого подкомпонента, представленного по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере одну систему транспорта, которая облегчает экспрессию продуктов экспрессии первого и второго компонентов на наружной поверхности микроорганизма и/или облегчает секрецию продуктов экспрессии первого и второго компонентов, и/или кодирующей по меньшей мере одну сигнальную последовательность, которая облегчает секрецию продуктов экспрессии первого и второго компонентов, и/или, необязательно, из второго подкомпонента, представленного по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один белок для лизиса микроорганизма в цитозоле клеток млекопитающих и для внутриклеточного высвобождения плазмид или векторов экспрессии, которые содержатся в лизированном микроорганизме, и четвертый компонент, представленный по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью для по меньшей мере одной последовательности активации для экспрессии по меньшей мере одного из первого, второго и третьего компонентов, где указанная последовательность активации может быть активирована в микроорганизме и/или является специфической для клетки ткани, специфической для опухолевой клетки, макрофаг-специфической, дендрит-специфической, лимфоцит-специфической, функция-специфической или неспецифической в отношении клетки, причем любой первый, второй, третий или четвертый компоненты, представленные в микрорганизме более одного раза, являются независимо друг от друга идентичными или отличающимися, при этом первый и второй компонент отличны друг от друга.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения продукта реакции, катализируемой белком, обладающим активностью 2-оксоглутарат-зависимого фермента, такого как (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцин или его соль и 4-гидрокси-L-пролин или его соль, с использованием бактерии, принадлежащей к роду, выбранному из группы, состоящей из Escherichia, Corynebacterium, Arthrobacter, Aspergillus и Bacillus, трансформированной фрагментом ДНК, содержащим ген, кодирующий белок, обладающий активностью 2-оксоглутарат-зависимого фермента, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что: ген, кодирующий 2-оксоглутаратдегидрогеназу, инактивирован или ген, кодирующий 2-оксоглутаратдегидрогеназу, и ген, кодирующий аминотрансферазу аминокислот с разветвленной цепью, инактивированы.

Изобретение относится к выделению молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют ферменты, необходимые для пути биосинтеза лантибиотика 107891 и его гомологов. .

Изобретение относится к препаративным формам для хранения посевного бактериального материала, питательным средам и способам получения биомасс рекомбинантных штаммов бактерий E.coli, содержащих плазмидные ДНК, кодирующие биосинтез белка TBI, и может быть использовано в биотехнологии и микробиологии
Наверх