Выделенное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент (варианты), их применение (варианты), фармацевтическая композиция, рекомбинантное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент, выделенная нуклеиновая кислота (варианты)

Группа изобретений относится к человеческим антителам, предпочтительно рекомбинантным человеческим антителам, которые характеризуются специфическим связыванием с фактором некроза опухоли α (hTNFα). Антитела обладают высокой аффинностью в отношении hTNFα (K_d=10^-8M или менее), низкой скоростью диссоциации (К_оff=10^-3 с^-1 или менее) и нейтрализуют активность hTNFα in vitro и in vivo. Антитела, соответствующие изобретению, могут быть антителом полной длины или его антиген-связывающим фрагментом. Антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, эффективны при детекции hTNFα и при ингибировании активности hTNFα при патологиях и/или заболеваниях, например, у человека, опосредованных hTNFα. Изобретения также охватывают нуклеиновые кислоты, векторы для экспрессии рекомбинантных человеческих антител и фармацевтические композиции на основе человеческих антител. 16 н. и 36 з.п. ф-лы, 11 ил., 17 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармакологии, медицины и биотехнологии, конкретно к препаратам, способным связывать человеческий фактор некроза опухоли (TNFα).

Уровень техники

Фактор некроза опухоли α (TNFα) является цитокином, образуемым множеством типов клеток, включая моноциты и макрофаги, который был исходно идентифицирован на основе своей способности индуцировать некроз некоторых мышиных опухолей (см., например, Old L (1985) Science 230:630-632). Впоследствии было показано, что фактор, называемый кахектин, ассоциированный с кахексией, является той же молекулой, что TNFα. TNFα участвовал в генерации шока (см., например, Beutler В. and Cerami A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:505-518; Beutler В. and Cerami A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:625-655). Более того, TNFa участвовал в патофизиологии ряда других заболеваний и нарушений человека, включая сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата и болезнь трансплантат против хозяина (см. например, Moeller A. et al., (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et al.; Европейский Патент No 260610 B1 Moeller A. et al.; Vasilli P. (1992) Annu. Rev. Immunol 10:411-452; Tracey K.J. and Cerami A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503).

Вследствие вредной роли человеческого TNFα (hTNFα) в ряде нарушений у человека были разработаны терапевтические способы ингибирования или противодействия активности hTNFα. В частности, антитела, которые связывают или нейтрализуют hTNFα, рассматривались как средства ингибирования активности hTNFα. Одними из самых ранних таких антител были мышиные моноклональные антитела (mAbs), секретируемые гибридомами, полученными из лимфоцитов мышей, иммунизированных hTNFα (см., например, Hahn Т. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3814-3818; Liang C-M. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137:847-854; Hirai M. et al.(1987) J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly B.M. et al.(1987) Hybridoma 6:359-370; Moeller A. et al. (1990) Cytokine2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et al.; Европейский Патент No 186833 B1 Wallach D.; Европейская Патентная Заявка No 218868 A1 Old et al.; Европейский Патент No 260610 B1 Moeller A. et al.). Поскольку эти мышиные антитела против hTNFα часто проявляли высокую аффинность к hTNFα (например, Kd≤10^-9 M) и были способны нейтрализовать активность hTNFα, их применение in vivo могло ограничиваться проблемами, связанными с введением мышиных антител человеку, такими как короткий период полужизни в сыворотке, неспособность включать определенные функции эффекторов человека и появление нежелательного иммунного ответа против мышиных антител у человека (реакция "человеческих антител против мыши" (НАМА)).

При попытке преодолеть проблемы, связанные с использованием полностью мышиных антител у человека, мышиные антитела против hTNFα были с помощью генетической инженерии сделаны "человекоподобными". Например, были получены химерные антитела, в которых вариабельные участки цепей антител имеют мышиную природу, а константные участки цепей антител - человеческую (Knight D.M. et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1443-1453;

Публикация РСТ No WO 92/16553 Daddona P.E. et al.). Кроме того, были также получены человекоподобные антитела, в которых гипервариабельные домены вариабельных участков антитела имеют мышиную природу, но остальные вариабельные участки и константные участки антител имеют человеческую природу (Публикация РСТ NoWO 92/11383 Adair J.R. et al.). Однако поскольку эти химерные и гуманизированные антитела еще сохраняют некоторые мышиные последовательности, они еще могут вызвать нежелательную иммунную реакцию, реакцию человеческих антихимерных антител (НАСА), особенно при введении в течение длительных периодов, например, при хронических показаниях, таких как ревматоидный артрит (см,, например, Elliott M.J. et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliott M.J. et al. (1994) Lancet 344:1105-1110).

Предпочтительным ингибирующим hTNFα агентом по отношению к мышиным mAbs и их производным (например, химерным или человекоподобным антителам) было бы полностью человеческое антитело против hTNFα, поскольку такой агент не вызывал бы реакции НАМА, даже если бы применялся в течение длительных периодов. Человеческие моноклональные аутоантитела против hTNFα были получены способами с использованием человеческой гибридомы (Boyle P. et al. (1993) Cell. Immunol. 152:556-568; Boyle P. et al. (1993) Cell. Immunol. 152:569-581; Европейская Патентная Заявка No 614984 A2 Boyle et al.). Однако, как сообщалось, эти моноклональные аутоантитела гибридомной природы обладали настолько низкой аффинностью в отношении hTNFα, что ее трудно было подсчитать известными способами, не были способны к связыванию растворимого hTNFα и не были способны нейтрализовать hTNFα-индуцированную цитотоксичность (см. Boyle et al., supra). Более того, успех способа с использованием человеческой гибридомы зависит от естественного присутствия в периферической крови человека лимфоцитов, продуцирующих аутоантитела, специфичные для hTNFα. В ряде исследований у человека обнаружены сывороточные аутоантитела против hTNFα (Fomsgaαd A. et al. (1989) Scand. J. Immunol. 30:219-223; Bendtzen K. et al. (1990) Prog. Leukocyte Biol. 10B:447-452), тогда как в других исследованиях они не были обнаружены (Leusch H-G. et al. (1991) J. Immunol. Methods 139:145-147).

Альтернативой существующим в естественных условиях человеческим антителам против hTNFα были бы рекомбинантные антитела против hTNFα. Описаны рекомбинантные человеческие антитела, которые связывают hTNFα с относительно низкой аффинностью (т.е. К_d~10^-7 М) и быстрой скоростью диссоциации (т.е. К_off~10^-2 с^-1). Однако ввиду относительно быстрой кинетики диссоциации эти антитела не могут быть применены для терапевтических нужд. Кроме того, были описаны рекомбинантные человеческие антитела против hTNFα, которые не нейтрализуют активность hTNFα, но значительно усиливают связывание hTNFα с поверхностью клеток и усиливают внедрение в цитоплазму hTNFα (Lidbury A. et al. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; Публикация РСТ No WO 92/03145 Aston R. et al.).

Соответственно человеческие антитела, такие как рекомбинантные человеческие антитела, которые связывают растворимый hTNFα с высокой аффинностью и низкой кинетикой диссоциации и которые способны нейтрализовать активность hTNFα, включая hTNFα-индуцированную цитотоксичность (in vitro и in vivo) и hTNFα-индуцированную активацию клеток, все еще являются необходимыми.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение относится к выделенным человеческим антителам или их антиген-связывающим фрагментам, которые связывают TNFα с высокой аффинностью, низкой скоростью диссоциации и высокой нейтрализующей активностью. Различные аспекты изобретения касаются антител, фрагментов антител и их фармацевтических композиций, а также нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессирующих векторов и различных вариантов применения антител, соответствующих изобретению, основанных на детекции человеческого TNFα и ингибировании активности человеческого TNFα либо in vitro, либо in vivo.

Это изобретение представляет человеческие антитела, предпочтительно рекомбинантные человеческие антитела, которые специфически связывают человеческий TNFα.

Антитела, соответствующие изобретению, характеризуются связыванием hTNFα с высокой аффинностью и медленной кинетикой диссоциации, а также нейтрализацией активности hTNFα, включая hTNFα-индуцированную цитотоксичность (in vitro и in vivo) и hTNFCT-индуцированную активацию клеток.

Антитела, соответствующие изобретению, далее характеризуются связыванием hTNFα, но не hTNFβ (лимфотоксина) и наличием способности связывать кроме человеческого TNFα также факторы некроза опухоли (TNFα) других приматов и TNFα неприматов.

Антитела, соответствующие изобретению, могут быть полной длины (например, антитело lgG1 или lgG4) или могут содержать только антиген-связывающий фрагмент (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv).

Наиболее предпочтительное рекомбинантное антитело, соответствующее изобретению, обозначаемое D2E7, имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 и домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4.

Предпочтительно антитело D2E7 имеет вариабельный участок легкой цепи (LCVR), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 1 и вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 2.

В одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые связывают человеческий TNFα с К_d, равной 1×10^-8 М или меньшей, диссоциируют с константой скорости K_off 1×10^-3 с^-1 или меньшей (оба значения определены с помощью поверхностного плазменного резонанса) и нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе с использованием L929 in vitro с IC₅₀, равной 1×10^-7 М или меньше.

Более предпочтительно, если выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из ассоциации (комплекса) с человеческим TNFα с K_off, равной 5×10^-4 с^-1 или менее, и даже более предпочтительно с К_off 1×10^-4 с^-1 или менее.

Более предпочтительно, если выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе с использованием L929 in vitro с IC₅₀ 1×10^-8 М или менее и еще более предпочтительно с IC₅₀ 5×10^-10 М или менее.

В другом варианте осуществления изобретение представляет человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент со следующими характеристиками:

a) диссоциирует из nTNFα с К_off 1×10^-3 с^-1 или менее, что определено с помощью поверхностного плазменного резонанса;

b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

Более предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFα с К_off 5×10^-4 с^-1 или менее. Еще более предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFα К_off 1×10^-4 с^-1 или менее.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент с LCVR, имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8, или HCVR, имеющим домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

Более предпочтительно, если LCVR далее имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, и HCVR далее имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 6.

Еще более предпочтительно, если LCVR далее имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 7, и HCVR имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 8.

В некоторых вариантах осуществления антитело имеет константный участок тяжелой цепи lgG1 или константный участок тяжелой цепи lgG4. В других вариантах осуществления антитело является фрагментом Fab, фрагментом F(ab')₂ или фрагментом Fv одной цепи.

В других вариантах осуществления изобретение представляет антитела или его антиген-связывающие фрагменты с LCVR, имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 3, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, или с HCVR, имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 4, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ ID No 33, SEQ ID No 34 и SEQ ID No 35.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые нейтрализуют активность человеческого TNFα, но не человеческого TNFα (лимфотоксина). В предпочтительном варианте осуществления человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют активность человеческого TNFα, TNFα шимпанзе и TNFα по меньшей мере еще одного примата, выбранного из группы, состоящей из TNFα павиана, TNFα игрунки, TNFα циномолгуса и TNFα резуса. Предпочтительно, если антитело также нейтрализует активность TNFα по меньшей мере одного непримата. Например, в одном варианте осуществления выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют также активность собачьего TNFα. А в другом варианте выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют также активность свиного TNFα. В еще одном варианте осуществления выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют также активность мышиного TNFα.

Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие изобретению антитела или их антиген-связывающие фрагменты. Предпочтительная нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирующая LCVR D2E7, имеет нуклеотидную последовательность, представленную на Фигуре 9 и SEQ ID No 36. Другая предпочтительная нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирующая HCVR D2E7, имеет нуклеотидную последовательность, представленную на Фигуре 10 и SEQ ID No 37. Рекомбинантные экспрессирующие векторы, несущие кодирующие антитела нуклеиновые кислоты, соответствующие изобретению, также охватываются изобретением.

Еще один аспект изобретения относится к применению указанных антител для лечения заболеваний и/или нарушений, основанных на ингибировании активности человеческого TNFα с использованием антитела или его антиген-связывающего фрагмента, соответствующего изобретению. В одном варианте осуществления изобретения предусматривается контактирование человеческого TNFα с антителом, соответствующим изобретению, или его антиген-связывающим фрагментом, при этом ингибируется активность человеческого TNFα. В другом варианте осуществления предусматривается введение антитела, соответствующего изобретению, или его антиген-связывающего фрагмента человеку, страдающему от нарушения, при котором активность TNFα является вредной, при этом у человека ингибируется активность TNFα.

Нарушением может быть, например, сепсис, аутоиммунное заболевание (например, ревматоидный артрит, аллергия, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит и почечный синдром), инфекционное заболевание, злокачественное новообразование, отторжение трансплантата или болезнь трансплантат против хозяина, легочное нарушение, костное нарушение, кишечное нарушение или сердечное нарушение.

Краткое описание фигур чертежей

На Фигурах 1 и 2 представлены последовательности нуклеиновых кислот вариабельного участка легкой цепи D2E7 (D2E7 VL; показано также в SEQ ID No 1), аланин-сканмутанты D2E7VL (LD2E7^*.A1, LD2E7^*.A3, LD2E7^*.A4, LD2E7^*.A5, LD2E7^*.A7 и LD2E7^*.A8), вариабельный участок легкой цепи подобного D2E7 антитела 2SD4 (2SD4 VL; показано также в SEQ ID No 9) и другие вариабельные участки легкой цепи, подобные D2E7 (ЕР В12, VL10E4, VL100A9, VL100D2, VL10F4, LOE5, VLLOF9, VLLOF10, VLLOG7, VLLOG9, VLLOH1, VLLOH10, VL1B7, VL1C1, VL1C7, VL0.1F4, VL0.1H8, LOE7, LOE7.A и LOE7.T).

На Фигуре 1 представлены домены FR1, CDR1, FR2 и CDR2. На Фигуре 2 представлены домены FR3, CDR3 и FR4. Домены легкой цепи CDR1 ("CDR L1"), CDR2 ("CDR L2") и CDR3 ("CDR L3") находятся в прямоугольнике.

На Фигурах 3 и 4 представлены аминокислотные последовательности вариабельного участка D2E7 (D2E7 VH; показано также в SEQ ID No 2), аланин-сканмутанты D2E7VH (HD2E7^*.A1, HD2E7^*.A2, HD2E7^*.A3, HD2E7^*.A4, HD2E7^*.A5, HD2E7^*.A6, HD2E7^*.A7, HD2E7^*.A8 и HD2E7^*.A9), вариабельный участок тяжелой цепи подобного D2E7 антитела 2SD4 (2SD4 VH, показано также в SEQ ID No 10) и другие вариабельные участки тяжелой цепи, подобные D2E7 (VH1B11, VH1D8, VH1A11, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6, VH1G1, ЗС-Н2, VH1-D2.N и VH1-D2.Y).

На Фигуре 3 представлены домены FR1, CDR1, FR2 и CDR2.

На Фигуре 4 представлены домены FR3, CDR3 и FR4. Домены тяжелой цепи CDR1 ("CDR H1"), CDR2 ("CDR H2") и CDR3 ("CDR НЗ") находятся в прямоугольнике.

На Фигуре 5 графически представлено ингибирование TNFα-индуцированной цитотоксичности L929 человеческим антителом D2E7 против hTNFα по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα.

На Фигуре 6 графически представлено ингибирование связывания rhTNFα с рецепторами hTNFα на клетках U-937 с помощью человеческого антитела D2E7 против hTNFα по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα.

На Фигуре 7 графически представлено ингибирование индуцированной TNFαr экспрессии ELAM-1 на HUVEC с помощью человеческого антитела D2E7 против hTNFα по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα.

На Фигуре 8 представлен график в виде столбиков защиты от TNFαr-индуцированной гибели сенсибилизированных D-галактозамином мышей посредством введения человеческого антитела против hTNFα D2E7 (черные столбики) по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα (заштрихованные столбики).

На Фигуре 9 представлена нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи D2E7 c прогнозированной аминокислотной последовательностью, находящейся ниже нуклеотидной последовательности. Участки CDR L1, CDR L2 и CDR L3 подчеркнуты.

На Фигуре 10 представлена нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи D2E7 с прогнозированной аминокислотной последовательностью, находящейся ниже нуклеотидной последовательности. Участки CDR H1, CDR H2 и CDR H3 подчеркнуты.

На Фигуре 11 приведен график, представляющий эффект лечения антителами D2E7 трансгенных мышей Тд197 со средним размером суставов в качестве модели полиартрита.

Осуществление изобретения

С целью более легкого понимания изобретения сначала определяются некоторые термины.

Термин "человеческий TNFα" (сокращаемый здесь как DTNFα или просто hTNF), используемый здесь, предназначен для определения человеческого цитокина, который существует в виде секретируемой формы с молекулярной массой 17 кД и ассоциированной с мембраной формы с молекулярной массой 26 кД, биологически активная форма которого содержит триммер нековалентно связанных молекул с массой 17 кД. Структура hTNFα описана далее в, например, Pennica D. et al., (1984) Nature 312:724-729; Davis J.M. et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; Jones E.Y. et al, (1989) Nature 338:225-228. Термин человеческий TNFα предполагает включение рекомбинантного человеческого TNFα (rhTNFα), который может быть получен стандартными способами рекомбинантной экспрессии или закуплен (R&D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN).

Термин "антитело", используемый здесь, предназначен для определения молекул иммуноглобулина, состоящего из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенный здесь как HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенный здесь как LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен CL. Участки VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), окруженные участками, которые являются более консервативными, называемыми скелетными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR участков, расположенных от амино- до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин "антиген-связывающий фрагмент" антитела (или просто "фрагмент антитела"), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, hTNFα). Показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Wαd et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH, и (vi) выделенный участок (CDR), определяющий комплементарность. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть рекомбинантными способами связаны с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как Fv одной цепи (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al.,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела. К ним относятся также другие формы антител из одной цепи, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта (см., например, Holliger Р. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Далее, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование участка ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и уменьшенных биомолекул scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994) Mol. Immunol., 31:1047-1058). Фрагменты антител, такие как Fab F(ab')₂, могут быть получены из целых антител с использованием принятых способов, таких как разложение папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Более того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК, как описано здесь.

Термин "человеческое антитело", используемый здесь, включает антитела, имеющие вариабельные и константные участки, выделенные из последовательностей зародышевого иммуноглобулина человека.

Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями зародышевого иммуноглобулина человека (например, мутации, интродуцированные ненаправленным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и особенно в CDR3. Однако термин "человеческое антитело", используемый здесь, не включает антитела, в которых последовательности CDR, выделенные из эмбрионов других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на человеческие скелетные последовательности.

Термин "рекомбинантное человеческое антитело", используемый здесь, включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в клетку-хозяин (описано далее в Разделе II ниже), антитела, выделенные из набора известных рекомбинантных комбинаторных человеческих антител (описано далее в Разделе III ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor LD. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сплайсинг последовательности гена человеческого иммуноглобулина до других последовательностей ДНК.

Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные участки, выделенные из последовательностей человеческого зародышевого иммуноглобулина.

В некоторых вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, поскольку они выделены из последовательностей зародышевых VH и VL человека и близки к ним, не могут в естественных условиях существовать в зародышевом наборе антител человека in vivo.

"Выделенное антитело", как используют здесь, предназначено для определения антитела, которое практически не содержит других антител, имеющих различные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает hTNFαr, практически не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от hTNFα).

Выделенное антитело, которое специфически связывает hTNFα, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы TNFα из других видов (детально обсуждается ниже). Более того, выделенное антитело может практически не содержать иной клеточный материал и/или химические соединения.

"Нейтрализующее антитело", как используют здесь, (или "антитело, которое нейтрализовало активность hTNFα) подразумевает антитело, связывание которого с hTNFα приводит к ингибированию биологической активности hTNFα. Это ингибирование биологической активности hTNFα может быть оценено измерением одного или более индикаторов биологической активности hTNFα, таких как hTNFα-индуцированной активации клетки и связывания hTNFα с рецепторами hTNFα. Эти индикаторы биологической активности hTNFα могут быть оценены одним или более методом различных стандартных анализов in vitro и in vivo, известных в уровне техники (см. Пример 4). Предпочтительно способность антитела нейтрализовать активность hTNFα оценивается по ингибированию hTNFα-индуцированной цитотоксичности клеток L929. В качестве дополнительного или альтернативного параметра активности hTNFα может быть оценена способность антитела ингибировать hTNFα-индуцированную экспрессию ELAM-1 на HUVEC, как степень hTNFαr-индуцированной активации клеток.

Термин "поверхностный плазменный резонанс", используемый здесь, относится к оптическому явлению, положенному в основу проведения анализа протекающих в данный момент биоспецифических взаимодействий по детекции изменений концентраций белка в матриксе биосенсора, например, с использованием системы BIAcore (Phαmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Дальнейшее описание см. в Примере 1 и JÖnsson U. et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; JÖnsson U. et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnson B. et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 и Johnson В. et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Термин "K_off", используемый здесь, предназначен для определения константы скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Термин "K_d", используемый здесь, предназначен для обозначения константы диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь, включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитиевой или двунитевой, но предпочтительно двунитевой ДНК.

Термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или фрагменты антител (например, VH, VL, CDR3), которые связывают hTNFα, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или фрагменты антител, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или фрагменты антител, которые связывают антигены, отличные от hTNFα, эти другие последовательности могут в естественных условиях примыкать к нуклеиновой кислоте в геномной ДНК человека. Таким образом, например, выделенная нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирующая участок VH антитела против TNFαr, не содержит другие последовательности, кодирующие другие участки VH, которые связывают антигены, отличные от TNFα.

Термин "вектор" в контексте описания обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Одним типом вектора является "плазмида", которая означает кольцевую петлю двунитевой ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин (точку начала) репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина введением в клетку-хозяин и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы могут направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны.

Такие векторы называются в контексте заявки "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). В основном экспрессирующие векторы для использования в способах с применением рекомбинантной ДНК часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто применяемой формой вектора. Однако изобретение включает другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") в контексте заявки предназначен для определения клетки, в которую интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что такие термины обозначают только определенную данную клетку, но не потомство такой клетки. Поскольку определенные модификации в последующих поколениях могут происходить вследствие мутаций или воздействия окружающей среды, такое потомство может на самом деле не быть идентичными родительской клетке, но также подпадает под определение термина "клетка-хозяин" в контексте заявки.

Различные аспекты изобретения подробно описываются в следующих подразделах.

1. Человеческие антитела, которые связывают TNFα человека

Изобретение представляет выделенные человеческие антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связывают человеческий TNFα с высокой аффинностью, низкой скоростью диссоциации и высокой нейтрализующей способностью. Предпочтительно человеческие антитела, соответствующие изобретению, являются рекомбинантными нейтрализующими человеческими антителами против hTNFα. Наиболее предпочтительным рекомбинантным нейтрализующим антителом согласно изобретению является D2E7, которое имеет последовательности VL и VH, как показано на Фигурах 1, 2 и Фигурах 3, 4, соответственно, (аминокислотная последовательность участка VL D2E7 также представлена как SEQ ID No 1; аминокислотная последовательность участка VH D2E7 также представлена как SEQ ID No 2). Связывающие свойства D2E7 по сравнению с мышиными mАВ МАК 195 против hTNFα, которые обладают высокой аффинностью и низкой кинетикой диссоциации, и другими человеческими антителами против hTNFα 2SD4 с близкой D2E7 последовательностью сведены ниже в таблицу:

Антитело	Koff c-1	kon M-1 сек-1	Kd M	Стехиометрия
D2E7 lgG1	8,81×10-5	1,91×105	6,09×10-10	1,2
2SD4 lgG4	8,4×10-3	4,20×105	2,00×10-8	0,8
МАК 195 F(ab')2	8,70×10-5	1,90×105	4,60×10-10	1,4

Антитела D2E7 и близкие антитела также обладают высокой способностью к нейтрализации активности hTNFα, что было определено в ряде анализов in vitro и in vivo (см. Пример 4). Например, эти антитела нейтрализуют hTNFα-индуцированную цитотоксичность клеток L929 со значениями IC₅₀ в интервале от приблизительно 10^-7 М до приблизительно 10^-10 М. D2E7 при экспрессии в виде антитела lgG1 полной длины нейтрализует hTNFα-индуцированную цитотоксичность клеток L929 с IC₅₀ приблизительно 1,25×10^-10 М. Более того, нейтрализующая активность D2E7 поддерживается, если антитело экспрессируется как Fab, F(ab')₂ или фрагмент scFv. D2E7 также ингибирует hTNFα-индуцированную активацию клеток, что измеряют по hTNFα-индуцированной экспрессии. ELAM-1 на HUVEC (IC₅₀=приблизительно 1,85×10^-10 М) и по связыванию hTNFα с рецепторами hTNFα на клетках U-937 (IC₅₀= приблизительно 1,56×10^-10 М). Относительно последнего случая D2E7 ингибирует связывание hTNFα с обоими рецепторами hTNFα - р55 и р75. Более того, антитело ингибирует hTNFα-индуцированную гибель in vivo у мышей (ED₅₀=1-2,5 мкг/мышь).

Что касается специфичности связывания D2E7, то это антитело связывает человеческий TNFα в различных формах, включая растворимый hTNFα, трансмембранный hTNFα и hTNFα, связанный с клеточными рецепторами. D2E7 не связывается специфически с другими цитокинами, такими как лимфокины (hTNFβ), IL(интерлейкин)-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFNγ и TGFβ. Однако D2E7 действительно обладает перекрестной реактивностью с факторами некроза опухоли из других видов. Например, антитело нейтрализует активность TNFα по меньшей мере пяти приматов (шимпанзе, павиана, игрунки, циномолгуса и резуса) с приблизительно такими же значениями IC₅₀, что и для нейтрализации активности мышиного TNFα, хотя приблизительно в 1000 раз слабее, чем человеческого TNFα (см. Пример 4, подраздел Е). D2E7 связывает также собачий и свиной hTNFα.

В одном аспекте изобретение касается антител и фрагментов антител D2E7, антител и фрагментов антител, близких D2E7, и других человеческих антител и фрагментов антител с эквивалентными D2E7 свойствами, такими как высокая аффинность связывания hTNFβ при низкой кинетике диссоциации и высокой нейтрализующей активности. В одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые диссоциируют из человеческого TNFβ с К_d 1×10^-8 М или менее и константе скорости диссоциации К_off 1×10^-3 сек^-1 М или менее, измеренными с помощью поверхностного плазменного резонанса, и нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNFβ в стандартном анализе с использованием L929 in vitro с IC₅₀ 1×10^-7 М или менее. Более предпочтительно, если выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFβ с К_off 5×10^-4 сек^-1 М или менее или даже более предпочтительно с К_off 1×10^-4 сек^-1 М или менее. Более предпочтительно, если выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNFβ в стандартном анализе с использованием L929 in vitro с IC₅₀ 1×10^-8 М или менее, даже более предпочтительно с IC₅₀ 1×10^-9 М или менее и еще более предпочтительно - IC₅₀ 5×10^-10 М или менее. В предпочтительном варианте осуществления антитело является выделенным человеческим рекомбинантным антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело также нейтрализует hTNFα-индуцированную активацию клеток, что оценивают стандартным анализом in vitro hTNFα-индуцированной экспрессии ELAM-1 на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC).

Анализ с помощью поверхностного плазменного резонанса для определения К_d и К_off может быть выполнен, как описано в Примере 1. Стандартный анализ in vitro с использованием 1-929 для определения значений IC₅₀ описан в Примере 4, подразделе А. Стандартный анализ in vitro hTNFα-индуцированной экспрессии ELAM-1 на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) описан в Примере 4, подразделе А. Примеры рекомбинантных человеческих антител, которые соответствуют или, как предполагают, соответствуют вышеописанным критериям кинетики и нейтрализации, включают антитела, имеющие следующие [VH/VL] пары, последовательности которых представлены на Фигурах 1, 2, 3 и 4 (см. также анализы кинетики и нейтрализации в Примерах 2, 3 и 4): [D2E7 VH/D2E7VL]; [HD2E7^*.A1/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A2/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A3/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A4/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A5/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A6/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A7/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A8/D2E7 VL]; [HD2E7^*.A9/D2E7 VL]; [D2E7 VH/LD2E7^*.A1]; [D2E7 VH/LD2E7^*.A4]; [D2E7 VH/LD2E7^*.A5]; [D2E7 VH/LD2E7^*.A7]; [D2E7VH/LD2E7^*.A8]; [HD2E7^*.A9/LD2E7^*.A1]; [VH1-D2/LOE7]; [VH1-D2.N/LOE7.T]; [VH1-D2.Y/LOE7.A]; [VH1-D2.N/LOE7.A]; [VH1-D2/EP B12] и [3C-H2/LOE7].

Из уровня техники хорошо известно, что домены CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют важную роль в специфичности/аффинности при связывании антитела с антигеном. Соответственно, в другом аспекте изобретение касается человеческих антител, которые имеют низкую кинетику диссоциации для ассоциации с hTNFα и которые имеют домены CDR3 легкой и тяжелой цепей, являющиеся структурно идентичными или близкими таковым D2E7. Как показано в Примере 3, положение 9 D2E7 VL CDR3 может быть занято Аlа или Thr без существенного влияния на К_off. Соответственно, консенсусный участок D2E7 VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID No 3). Кроме того, положение 12 D2E7 VH CDR3 может быть занято Тyr или Asn без существенного влияния на К_off. Соответственно, консенсусный участок D2E7 VH CDR3 содержит аминокислотную последовательность V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID No 4). Более того, как продемонстрировано в Примере 2, в домене CDR3 тяжелой и легкой цепей D2E7 легко провести замену одним остатком аланина (в положении 1, 4, 5, 7 или 8 в VL CDR3 или в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 в VH CDR3) без существенного влияния на K_off. Более того, специалист оценит, что при возможности легкой замены аланином в доменах D2E7 VL и VH CDR3, возможны замены другими аминокислотами в доменах CDR3 при сохранении низкого значения константы скорости диссоциации антитела, в частности, замены консервативных аминокислот. Под "заменой консервативной аминокислоты" в контексте заявки подразумевается замена, при которой остаток аминокислоты замещается другим остатком аминокислоты, имеющим близкую боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих близкие боковые цепи, были определены в уровне техники, в том числе основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предпочтительно в доменах D2E7 VL и/или VH CDR3 делают не более, чем от одной до пяти замен консервативных аминокислот. Более предпочтительно в доменах D2E7 VL и/или VH CDR3 делают не более, чем от одной до трех замен консервативных аминокислот. Кроме того, замены консервативных аминокислот не следует делать в положениях аминокислот, критических для связывания hTNFα. Как показано в Примере 3, положения 2 и 5 D2E7 VL CDR3 и положения 1 и 7 D2E7 VH CDR3 оказались критическими для взаимодействия с hTNFα и, таким образом, предпочтительно не делать замен консервативных аминокислот в этих положениях (хотя замена аланином в положении 5 D2E7 VL CDR3 является приемлемой, как описано выше).

Соответственно в другом варианте осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент со следующими характеристиками:

a) диссоциирует из ассоциации (комплекса) с hTNFα с константой скорости К_off 1×10^-3 с^-1 или менее, что определено с помощью поверхностного плазменного резонанса;

b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

с) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

Более предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFα с К_off 5×10^-4 с^-1 или менее. Еще более предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFα с К_off 1×10^-4 с^-1 или менее.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент с вариабельным участком легкой цепи (LCVR), имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или с вариабельным участком тяжелой цепи (HCVR), имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11. Предпочтительно, если LCVR далее имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5 (т.е. D2E7 VL CDR2), и HCVR далее имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 6 (т.е. D2E7 VH CDR2). Еще более предпочтительно, если LCVR далее имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 7 (т.е. D2E7 VL CDR1) и HCVR далее имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 8 (т.е. D2E7 VH CDR1). Предпочтительны скелетные участки VL из семейства зародышевой линии человека V_kI, более предпочтительны - из гена Vk зародышевой линии человека А20 и наиболее предпочтительны - из скелетных последовательностей D2E7 VL, представленных на Фигурах 1 и 2. Предпочтительны скелетные участки VH из семейства зародышевой линии человека V_H3, более предпочтительны - из гена VH зародышевой линии человека DP-31 и наиболее предпочтительны - из скелетных последовательностей D2E7 VH, представленных на Фигурах 3 и 4.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константный участок тяжелой цепи, такой как константный участок lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM, IgD. Предпочтительно константным участком тяжелой цепи является константный участок тяжелой цепи lgG1 или константный участок тяжелой цепи lgG4. Более того, антитело может содержать как константный участок легкой цепи либо каппа-константный участок легкой цепи, либо лямбда-константный участок легкой цепи. Предпочтительно антитело содержит каппа-константный участок легкой цепи. С другой стороны, фрагментом антитела может быть, например, фрагмент Fab или фрагмент Fv из одной цепи.

В некоторых других вариантах осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающие фрагменты, имеющие домены CDR3 VL и VH, близкие D2E7, например, антитела или их антиген-связывающие фрагменты с вариабельным участком легкой цепи (LCVR), имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 3, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12,SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26 или с вариабельным участком тяжелой цепи (HCVR), имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 4, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ ID No 33, SEQ ID No 34 и SEQ ID No 35.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет рекомбинантное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые нейтрализуют активность человеческого TNFα, но не человеческого TNFβ. Предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент также нейтрализуют активность TNFα шимпанзе и по меньшей мере одного дополнительного TNFα приматов, выбранного из группы, состоящей из TNFα павиана, TNFα игрунки, TNFα циномолгуса и TNFα резуса. Предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют TNFα человека, шимпанзе и/или дополнительного примата в стандартном анализе in vitro с использованием L929 с IC₅₀ 1×10^-8 М или менее, более предпочтительно 1×10^-9 М, еще более предпочтительно 5×10^-10 М или менее. В одном субварианте осуществления антитело нейтрализует также активность собачьего TNFα, предпочтительно в стандартном анализе in vitro с использованием L929 с IC₅₀ 1×10^-7 М или менее, более предпочтительно 1×10^-8 М или менее и даже более предпочтительно 5×10^-9 М или менее. В другом субварианте осуществления антитело нейтрализует также активность свиного TNFα, предпочтительно с IC₅₀ 1×10^-5 М или менее, более предпочтительно 1×10^-6 М или менее и даже более предпочтительно 5×10^-7 М или менее. В еще одном субварианте осуществления антитело нейтрализует также активность мышиного TNFα предпочтительно с IC₅₀ 1×10^-4 М или менее, более предпочтительно 1×10^-5 М или менее и даже более предпочтительно 5×10^-6 М или менее.

Антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут образовывать производные или быть связаны с другой активной молекулой (например, другим пептидом или белком). Соответственно, антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, предусматривают включение производных или иным образом модифицированных форм человеческих антител против hTNFα, описанных здесь, включая молекулы иммуноадгезии. Например, антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут быть функционально связаны (химическим соединением, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или более молекулярных структур, таких как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), обнаруживаемый агент (метка), цитотоксический агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, которые могут влиять на ассоциацию антитела или фрагмента антитела с другой молекулой (такой как участок ядра стрептавидина или полигистидиновой метки), Один тип производного антитела получают перекрестным сшиванием двух или более антител (одного и того же типа или различных типов, например, для создания биспецифичных антител). Подходящие перекрестно сшивающие агенты включают агенты, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две различные реактивные группы, разделенные подходящим спейсером (например, m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидил суберат). Такие линкеры предлагаются Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Подходящие обнаруживаемыми агентами, с помощью которых могут быть образованы производные антитела или фрагмента антитела, соответствующие изобретению, включают флуоресцентные соединения. Примеры флуоресцентных меток включают флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, хлорид 5-диметиламин-1-нафталинсульфонила, фикоэритрин и т.п. Антитело также может быть дериватизировано обнаруживаемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т.п. Когда антитело образует производное с обнаруживаемым ферментом, его выявляют добавлением дополнительных реагентов, которые фермент использует с образованием выявляемого продукта реакции. Например, когда присутствует обнаруживаемый агент пероксидаза хрена, добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к образованию окрашенного продукта реакции, который является определяемым. Антитело может также образовать производное с биотином и быть выявленным посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.

II. Экспрессия антител

Антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут быть получены рекомбинантной экспрессией генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяин трансфицируют одним или более рекомбинантных экспрессионных векторов, несущих фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина антитела таким образом, что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно выделяются в среду, в которой культивируют клетки-хозяина, из этой среды могут быть выделены антитела. Стандартные способы с применением рекомбинантной ДНК используются для получения генов тяжелой и легкой цепей, инкорпорации этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и интродукции векторов в клетки-хозяина так, как описано Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) Molecula Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Habor, N.Y. (1989; Ausubel F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecula Biology, Green Publishing Associates (1989) и Патент США No 4816397 Boss et al.

Для экспрессии D2E7 или родственного D2E7 антитела сначала получают фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи вариабельных участков. Эти ДНК могут быть получены амплификацией и модификацией последовательностей легкой и тяжелой цепей зародышевой линии с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельных участков тяжелой и легкой цепей человека известны из уровня техники (см., например, "Vbase" - базу данных последовательностей зародышевой линии человека; см. также Kabat Е.А et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Depatment of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242; Tomlinson I.M. et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervaiable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; Cox J.P.L et al.(1994) "A Directory of Human Germ-line V_k Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждого из которых специально введено здесь в виде ссылки). Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный участок тяжелой цепи D2E7 или близкого D2E7 антитела, член семейства V_H3 генов VH зародышевой линии человека амплифицируют с помощью стандартной ПЦР. Наиболее предпочтительной является амплификация последовательности зародышевой линии VH DP-31. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный участок легкой цепи D2E7 или близкого D2E7 антитела, член семейства V_kI генов VL зародышевой линии человека амплифицируют стандартной ПЦР. Наиболее предпочтительной является амплификация последовательности зародышевой линии VLA20. ПЦР-праймеры, пригодные для использования при амплификации последовательностей зародышевой линии VH DP-31 и зародышевой линии VL A20, могут быть определены на основе нуклеотидных последовательностей, приведенных в ссылках, цитированных supra, с использованием стандартных способов.

После получения фрагментов VH и VL зародышевой линии эти последовательности могут быть подвергнуты мутагенезу, чтобы они кодировали описанные здесь аминокислотные последовательности D2E7 или близкие D2E7. Аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями ДНК зародышевых линий VH и VL, сначала сравнивают с аминокислотными последовательностями VH и VL D2E7 или близкими D2E7 для идентификации остатков аминокислот в последовательности D2E7 или близкой D2E7, которые отличаются от зародышевой линии. Затем соответствующие нуклеотиды последовательностей ДНК зародышевой линии подвергают мутагенезу таким образом, что мутантная последовательность зародышевой линии кодирует последовательность аминокислот D2E7 или близкую D2E7, используя при этом генетический код для того, чтобы установить, какие изменения нуклеотидов следует произвести. Мутагенез последовательностей зародышевой линии проводят стандартными способами, такими как ПЦР-обусловленный мутагенез (в котором мутантные нуклеотиды вводятся в ПЦР-праймеры таким образом, что продукт ПЦР содержит мутации) или сайт-направленный мутагенез.

Более того, следует отметить, что, если последовательности "зародышевой линии", полученные ПЦР-амплификацией, кодируют аминокислотные отличия скелетных участков от правильной конфигурации зародышевой линии (т.е. отличия в амплифицированной последовательности по сравнению с правильной последовательностью зародышевой линии, например, как результат соматической мутации), то может быть желательным изменить эти отличия аминокислот в обратном направлении - к правильным последовательностям зародышевой линии (т.е. "обратная мутация "скелетных остатков в конфигурации зародышевой линии).

После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты VH и VL D2E7 или близких D2E7 (путем амплификации и мутагенеза генов VH и VL зародышевой линии, как описано выше), могут быть проведены дальнейшие манипуляции с этими фрагментами ДНК стандартными способами с использованием рекомбинантной ДНК, например, превращение генов вариабельного участка в гены цепи антитела полной длины, в гены фрагмента Fab или в ген scFv. В этих манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, оперативно связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константный участок антитела или гибкий линкер. Термин "оперативно связан", используемый в данном контексте, предназначен для обозначения того, что два фрагмента ДНК связаны так, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.

Выделенная ДНК, кодирующая участок VH, может быть превращена в ген тяжелой цепи полной длины посредством оперативного связывания VH-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константных участков тяжелой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat E.A et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Depatment of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242), а фрагменты ДНК, содержащие эти участки, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константный участок тяжелой цепи может быть константным участком lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM, IgD, но наиболее предпочтительным является константный участок lgG1 или lgG4. Для гена фрагмента Fab тяжелой цепи VH-кодирующая ДНК может быть оперативно связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок СН1 тяжелой цепи.

Выделенная ДНК, кодирующая участок VL, может быть превращена в ген легкой цепи полной длины (также как ген легкой цепи Fab) посредством оперативного связывания VL-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи CL. Последовательности генов константных участков легкой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat E.A. et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Depatment of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242) и фрагменты ДНК, содержащие эти участки, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константный участок легкой цепи может быть константным участком каппа- или лямбда-, но наиболее предпочтительно является константным участком каппа-.

Для получения гена scFv VH- и VL-кодирующие фрагменты ДНК оперативно связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим последовательность аминокислот (Gly4-Ser)3, таким образом, что последовательности VL и VH могут быть экспрессированы в виде прилегающего белка из одной нити, в котором участки VL и VH связаны гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).

Для экспрессии антител или фрагментов антител, соответствующих изобретению, кодирующие легкие и тяжелые цепи полной длины или их фрагменты ДНК, полученные, как описано выше, вводят в экспрессионные векторы таким образом, что гены становятся оперативно связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В данном контексте термин "оперативно связанные" предназначен для обозначения того, что ген антитела лигируют в вектор так, что последовательности контроля транскрипции и трансляции в векторе выполняют предназначенную им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают так, что они совместимы с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть введены в раздельные векторы или, что более типично, оба гена вводят в один и тот же экспрессионный вектор. Ген антитела вводят в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных рестрикционных сайтов на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если рестрикционные сайты отсутствуют). Перед введением последовательностей легкой и тяжелой цепей D2E7 или близких D2E7 экспрессионный вектор может уже нести последовательности константных участков антитела. Например, одним из подходов к превращению последовательностей VH и VL D2E7 или близких D2E7 в гены антитела полной длины является их инсерция в экспрессионный вектор, уже кодирующий константный участок тяжелой цепи и константный участок легкой цепи, соответственно, таким образом, что сегмент VH оперативно связан с сегментом(ами) СН в векторе, а сегмент VL оперативно связан с сегментом CL в векторе. Дополнительно или альтернативно рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выделение цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид связан в рамке считывания с геном амино-конца цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из белка неиммуноглобулина).

Дополнительно к генам цепи антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы, соответствующие изобретению, несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" предусматривает включение промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналов полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, см. Goeddel Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Любой специалист оценит, что конструирование экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, желательный уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающих включают вирусные элементы, которые направляют экспрессию белка в клетках млекопитающих на высоком уровне, такие как промоторы и/или энхансеры, выделенные из цитомегаловируса (ЦМВ) (такие как промотор/энхансер ЦМВ), вирус Simian 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовирус (например, аденовирусный главный поздний промотор (AdMLP)) и полиома. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, Патент США No 5168062 Stinski; Патент США No 4510245 Bell et al. и Патент США No 4968615 Schaffner et al.

Дополнительно к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессирующие векторы, соответствующие изобретению, могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках хозяина (например, ориджины репликации) и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был интродуцирован вектор (см., например, Патенты США NoNo 4399216, 4634665 и 5179017 все Axel et al.). Например, в типичном случае ген селектируемого маркера обусловливает устойчивость к лекарственным веществам, таким как 0418, гигромицин или метотрексат, клетки-хозяина, в которую был инродуцирован вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования клеток-хозяев dhfr^- с селекцией/амплификацией на фоне метотрексата) и ген пео (для селекции на фоне G418).

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионным вектором(ами), кодирующим тяжелую и легкую цепи, трансфицируют клетку-хозяин стандартными способами. Различные трактовки термина "трансфекция" предназначены для включения широкого ряда способов, обычно используемых при интродукции экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяин, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана и др. Хотя теоретически является возможным экспрессировать антитела, соответствующие изобретению, либо в прокариотных, либо в эукариотных клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотных клетках, и наиболее предпочтительно, в клетках-хозяевах млекопитающих, является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотные клетки, и особенно клетки млекопитающих, более вероятно, чем прокариотные клетки собирают и секретируют правильно образованное и иммунологически активное антитело. Прокариотная экспрессия генов антител, как было описано, является неэффективной для получения активных антител с высоким выходом (Boss М.А. and Wood C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител, соответствующих изобретению, включают клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки СНО dhfr^-, описанные Uriaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селективным маркером DHFR, например, как описано R.J. Kaufman and P.A. Shap (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, интродуцируют в клетки-хозяева млекопитающих, антитела образуются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, который достаточен для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или (более предпочтительно) секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяина. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков.

Клетки-хозяина также могут быть использованы для получения фрагментов интактных антител, таких как фрагменты Fab и молекулы scFv. Следует понимать, что варианты вышеописанной процедуры входят в объем изобретения. Например, может быть желательно трансфицировать клетку-хозяин ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) антитела, соответствующего изобретению. Способ с использованием рекомбинатной ДНК может также быть использован для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих отдельно или обе легкую и тяжелую цепи, которые не являются необходимыми для связывания hTNFα. Молекулы, экспрессируемые с таких усеченных молекул ДНК, также охватываются антителами, соответствующими изобретению. Кроме того, перекрестным сшиванием антитела, соответствующего изобретению, со вторым антителом с помощью стандартных химических способов перекрестного сшивания также могут быть получены бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь являются антителом, соответствующими изобретению, а другая тяжелая и другая легкая цепь специфичны к антигену, отличному от hTNFα.

В предпочтительной системе рекомбинантной экспрессии антитела или его антиген-связывающего фрагмента, соответствующих изобретению, рекомбинатный экспрессионный вектор, кодирующий обе тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, интродуцируют в клетки СНО dhfr^- посредством трансфекции с помощью фосфата кальция. В рекомбинатном экспрессионном векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела оперативно связан с регуляторными элементами энхансера/промотора (например, выделенными из SV40, ЦМВ, аденовируса и т.п., такими как регуляторный элемент энхансера ЦМВ/промотора AdMLP или регуляторный элемент энхансера 5У40/промотора AdMLP) для того, чтобы направлять транскрипцию генов на высоком уровне. Рекомбинантный экспрессионный вектор несет также ген DHFR, который обеспечивает селекцию клеток СНО, которые были трансфицированы вектором с использованием селекции/амплификации на фоне метотрексата. Отобранные клетки-хозяева-трансформанты являются культурой, обеспечивающей экспрессию тяжелой и легкой цепей антитела, и интактное антитело выделяют из культуральной среды. Для получения рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфекции клеток-хозяев, селекции трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды используют стандартные молекулярно-биологические способы.

В свете вышеописанного другой аспект изобретения касается композиций нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев, которые могут быть использованы для рекомбинантной экспрессии антител и фрагментов антител, соответствующих изобретению. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный участок легкой цепи D2E7, представлена на Фигуре 9 и SEQ ID No 36. Домен CDR1 LCVR охватывает нуклеотиды 70-102, домен CDR2 охватывает нуклеотиды 148-168 и домен CDR3 охватывает нуклеотиды 265-291. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельный участок тяжелой цепи D2E7, представлена на Фигуре 10 и SEQ ID No 37. Домен CDR1 HCVR охватывает нуклеотиды 91-105, домен CDR2 охватывает нуклеотиды 148-198 и домен CDR3 охватывает нуклеотиды 295-330. Специалист оценит, что нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, близкие D2E7, или их фрагменты (например, домен CDR, такой как домен CDR3) могут быть выделены из нуклеотидных последовательностей, кодирующих LCVR и HCVR D2E7 с использованием генетического кода и стандартных молекулярно-биологических способов.

В одном варианте осуществления изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую домен CDR3 легкой цепи, с аминокислотной последовательностью SEQ ID No 3 (т.е. D2E7 VL CDR3) или SEQ ID No 3, модифицированную посредством замены одним остатком аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или посредством замены от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9. Эта нуклеиновая кислота может кодировать только участок CDR3 или более предпочтительно кодирует вариабельный участок легкой цепи целого антитела (LCVR). Например, нуклеиновая кислота может кодировать LCVR, имеющий домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5 (т.е. D2E7 VL CDR2) и домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 7 (т.е. D2E7 VL CDR1).

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую домен CDR3 тяжелой цепи, с аминокислотной последовательностью SEQ ID No 4 (т.е. D2E7 VH CDR3) или SEQ ID No 4, модифицированную посредством замены одного остатка аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или посредством замены от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12. Эта нуклеиновая кислота может кодировать только участок CDR3 или более предпочтительно кодирует вариабельный участок тяжелой цепи целого антитела (HCVR). Например, нуклеиновая кислота может кодировать HCVR, имеющий домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 6 (т.е. D2E7 VH CDR2), и домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 8 (т.е. D2E7 VH CDR1).

В ряде других вариантов осуществления изобретение представляет выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие домен CDR3, близкий D2E7, например, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ ID No 33, SEQ ID No 34 и SEQ ID No 35.

Предпочтительно клетка-хозяин является клеткой-хозяином млекопитающего, более предпочтительно клетка-хозяин является клеткой СНО, клеткой NSO или клеткой COS.

Способ синтеза рекомбинантного человеческого антитела осуществляется посредством культивирования клетки-хозяина в подходящей среде культивирования до того времени, пока не синтезируется рекомбинантное человеческое антитело, соответствующее изобретению. Способ может далее предусматривать выделение рекомбинантного человеческого антитела из культуральной среды.

III. Селекция рекомбинантных человеческих антител

Рекомбинантные человеческие антитела, соответствующие изобретению, дополнительно к описанным здесь антителам D2E7 или близким D2E7 могут быть выбраны просмотром рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, предпочтительно библиотеки scFv отображающей фаги, полученных с использованием кДНК человеческих VL и VH, полученных с мРНК, выделенной из лимфоцитов человека. Методологии получения и скрининга таких библиотек известны из уровня техники. В дополнение к имеющимся в продаже наборам для получения библиотек с демонстрацией фагов (например, Phamacia Recombinant Phage Antibody System, каталог No 27-9400-01; набор демонстрации фагов Stratagene SurfZAP™, каталог No 240612), примеры способов и реагентов, особенно пригодных для применения при создании и скрининге библиотек, отображающих антитела, могут быть обнаружены, например, Ladner et al. Патент США No 5223409; Kang et al. Публикация PCT No WO 92/18619; Dower et al. Публикация РСТ No WO 91/17271; Winter et al. Публикация РСТ No WO 92/20791; Makland et al. Публикация РСТ No WO 92/15679; Breitling et al. Публикация РСТ No WO 93/01288; McCafferty et al. Публикация РСТ No WO 92/01047; Gaad et al. Публикация РСТ No WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths etal. (1993) EMBOJ. 12:725-734; Hawkinsetal. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; CClackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-33580; Gaad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. ((1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Babas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

В предпочтительном варианте осуществления для выделения человеческих антител с высокой аффинностью и низкой константой скорости диссоциации в отношении hTNFα мышиные антитела против hTNFα, имеющие высокую аффинность и низкую константу скорости диссоциации в отношении hTNFα (например, МАК 195, гибридома для получения которых имеет номер депонента ЕСАСС 87 050801), впервые используют для селекции последовательностей человеческих тяжелой и легкой цепей, имеющих близкую активность связывания в отношении hTNFα, с применением эпитопного импринтинга или направленной селекции, данные способы описаны Hoogenboom et al., Публикация РСТ NoWO 93/06213. Библиотеками антител, использованными в данном способе, являются предпочтительно библиотеки scFv, полученные и исследованные, как описано McCaffertyetal.; Публикация РСТ No WO 92/01047; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734. Скрининг библиотек антител scFv предпочтительно проводят, используя в качестве антигена рекомбинантный человеческий hTNFα.

После выбора исходных сегментов человеческих VL и VH проводят эксперименты "смешивания и определения соответствия", в которых проводят скрининг различных пар исходно выбранных сегментов VL и VH в отношении связывания hTNFα с целью селекции предпочтительных комбинаций пар VL/VH. Кроме того, для дальнейшего улучшения аффинности и/или снижения константы скорости диссоциации связывания hTNFα, сегменты VL и VH предпочтительной пары(пар) VL/VH могут быть подвергнуты ненаправленному мутагенезу, предпочтительно в области CDR3 VH и/или VL, способом, аналогичным способу получения соматической мутации in vivo, обусловливающим созревание аффинности антител в течение естественного иммунного ответа. Данное созревание аффинности in vitro может быть осуществлено амплификацией участков VH и VL с использованием ПЦР-праймеров, комплементарных VH CDR3 или VLCDR3, соответственно данные праймеры "вбивают" со случайной смесью четырех нуклеотидных оснований в определенные положения, так что полученные продукты ПЦР кодируют сегменты VH и VL, в которых случайные мутации были интродуцированы в участки CDR3 VH и/или VL. Данные сегменты VH и VL со случайными мутациями могут быть снова подвергнуты скринингу в отношении связывания hTNFα и могут быть отобраны последовательности, которые проявляют высокую аффинность и низкую константу скорости диссоциации в отношении hTNFα.

Аминокислотные последовательности отобранных тяжелой и легкой цепей антитела можно сравнить с аминокислотными последовательностями тяжелой и легкой цепей зародышевой линии. В случаях, когда определенные скелетные остатки отобранных цепей VL и/или VH отличаются от конфигурации зародышевой линии (например, в результате соматической мутации генов иммуноглобулина, использованной для получения фаговой библиотеки), может быть желательным "обратная мутация" измененных скелетных остатков отобранных антител с возвращением к конфигурации зародышевой линии (т.е. изменение скелетных аминокислотных последовательностей отобранных антител, чтобы они стали такими же, как скелетные аминокислотные последовательности зародышевой линии). Такая "обратная мутация" (или "приведение к зародышевой линии") скелетных остатков может быть выполнена стандартными молекулярно-биологическими способами интродукции специфических мутаций (например, сайт-направленным мутагенезом, ПЦР-обусловленным мутагенезом и др.).

После скрининга и выделения антитела против hTNFα, соответствующего изобретению, из библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов нуклеиновая кислота, кодирующая отобранное антитело, может быть выделена из демонстрационной упаковки (например, из генома фага) и субклонирована в другие экспрессирующие векторы стандартными способами с использованием рекомбинантной ДНК. Если желательно, возможны дальнейшие манипуляции с нуклеиновой кислотой для создания других форм антител, соответствующих изобретению (например, связывание с нуклеиновой кислотой, кодирующей дополнительные иммуноглобулиновые домены, такие как дополнительные константные участки). Для экспрессии рекомбинантного человеческого антитела, выделенного при скрининге комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессионный вектор и интродуцируют в клетки-хозяина млекопитающего, как подробно описано выше в Разделе II.

IV. Фармацевтические композиции и фармацевтическое применение

Антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть введены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту. В типичном случае фармацевтическая композиция содержит антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые возможные растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и др., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из перечисленных далее носителей: вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут далее содержать минорные количества добавочных субстанций, таких как увлажняющие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают время хранения или эффективность антитела или фрагмента антитела.

Композиции, соответствующие данному изобретению, могут находиться в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и вливаний), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции представлены формой растворов для инъекций или вливаний, таких как композиции, близкие к композициями, применяемым для пассивной иммунизации человека другими антителами. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводят внутривенным вливанием или инъекцией. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело вводят внутримышечной или подкожной инъекцией.

Терапевтические композиции в типичном случае должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиции могут быть сделаны в виде растворов, микроэмульсий, дисперсий, липосом или других назначенных структур, подходящих для высокой концентрации лекарственного вещества. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены введением активного соединения (т.е. антитела или фрагмента антитела) в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией перечисленных выше ингредиентов, как это требуется, с последующей стерилизацией путем фильтрации. В основном дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требующиеся иные ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, с помощью которых получают порошок активного ингредиента с любым дополнительным желательным ингредиентом из его предварительного стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, использованием покрытия, такого как лецитиновое, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто включением в композицию агента, который задерживает поглощение, например солей моностеарата и желатина.

Антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут вводиться различными способами, известными в уровне техники, хотя из многих способов терапевтического применения предпочтительным способом/путем введения является внутривенная инъекция или вливание. Как будет оценено специалистом, способ и/или путь введения будет изменяться в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления активное соединение может быть приготовлено с носителем, который будет защищать соединение от быстрого выхода так, как в препарате с контролируемым выходом, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких препаратов запатентованы и в основном известны специалистам. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems. J.R.Robinson ed. Macel Dekker, Inc., New York, 1978.

В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Соединение (и другие ингредиенты, если желательно) могут быть также заключены в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, спрессованы в таблетки или введены непосредственно в пищу субъекта. Для перорального терапевтического введения соединения могут быть введены с наполнителями и использованы в форме таблеток для приема внутрь, защечных таблеток, лепешек, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Для введения соединения, соответствующего изобретению, способом, отличным от парэнтерального, может быть необходимо покрытие соединения оболочкой из материала, препятствующего его инактивации, или совместное введение соединения с таким материалом.

Дополнительные активные соединения могут быть также введены в композиции. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, содержатся в препарате и/или вводятся совместно с одним или более из терапевтических агентов, которые используют для лечения нарушений, в которых активность hTNFα является вредной. Например, антитело или фрагмент антитела против hTNFα, соответствующие изобретению, могут входить в препарат и/или вводиться совместно с одним или более дополнительными антителами, которые связывают другие мишени (например, антитела, которые связывают другие цитокины или связывают поверхностные молекулы клетки), с одним или более цитокинами, с растворимым рецептором TNFα (см., например, Публикацию РСТ No WO 94/06476) и/или с одним или более химическим агентом, которые ингибируют продукцию или активность hTNFα (такими как производные циклогексанилидена, как описано в Публикации РСТ No WO 93/19751). Более того, одно или более антител, соответствующих изобретению, может быть использовано в комбинации с одним или более из вышеупомянутых терапевтических агентов. В таких способах комбинированной терапии могут удачно использоваться низкие дозы вводимых терапевтических агентов, избегая таким образом возможной токсичности или осложнений, ассоциированных с различными способами монотерапии.

Неограничивающие объем изобретения примеры терапевтических агентов от ревматоидного артрита, с которыми могут комбинироваться антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, включают следующие: нестероидное противовоспалительное лекарственное вещество(а) (NSAIDs); цитокин-супрессирующее противовоспалительное лекарственное вещество(а) (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело против hTNFα; Celltech/Bayer); cA2 (химерное антитело против DTNFα; Centocor); TNFR-IgG молекулярной массы 75 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 75 кД; Immunex; см., например, athritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, 295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); TNFR-IgG молекулярной массы 55 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 55 кД; Hoffmann-Laoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (неистощающее приматизированное антитело против CD4; IDEC/SmithKline; см., например, athritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, 185; DAB 486-IL-2 и/или DAB 389-IL-2 (слитые белки IL-2; Seragen; см., например, athritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223; Anti-Tac (гуманизированное антитело против IL-2Ro; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-1.0 (SCH 52000; рекомбинантный IL-10, противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-4; агонисты IL-10 и/или IL-4 (например, агонистические антитела); IL-1RA (антагонист рецептора IL-1; Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNFR (растворимый TNF-связывающий белок; см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 284; Amer. J. Physiol. - Heat and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (ингибитор фосфодиэстеразы типа IV; см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 282); МК-966 (ингибитор СОХ-2см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 81); илопрост (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 82); метотрексат; талидомид см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 282) и близкие талидомиду лекарственные вещества (например, Celgen); лефлуномид (противовоспалительное и ингибитор цитокинов, см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 131; Inflammation Reseach (1996) Vol 45, pp. 103-107); транексамовая кислота (ингибитор активации плазминогена; см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 284); Т-614 (ингибитор цитокина см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 282); простагландин Е1 (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 282); тенидап (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат; см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 280); напроксен (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат; см., например, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); мелоксикам (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); ибупрофен (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); пироксикам (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); диклофенак (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); индометацин (нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат); сульфасалазин (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 281); азатиоприн (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 281); ингибитор ICE (ингибитор фермента интерлейкина - 1β-конвертирующего фермента); ингибитор zap-70 и/или Ick (ингибитор тирозинкиназы zap-70 или Ick); ингибитор VEGF и/или ингибитор VEGF-R (ингибиторы ростового фактора клеток сосудистого эндотелия или рецептора ростового фактора клеток сосудистого эндотелия; ингибиторы ангиогенеза); кортикостероидные противовоспалительные лекарственные вещества (например, SB203580); ингибиторы TNF-конвертазы; антитела против IL-12; интерлейкин-11 (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 296); интерлейкин-13 (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 308); ингибиторы интерлейкина-17 (см., например, athritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No 9 (дополнительный), 120); золото, пеницилламин, хлорохин; гидроксихлорохин; хлорамбуцил; циклофосфамид; циклоспорин; общее лимфоидное облучение: глобулин против тимоцитов; антитела против CD4; токсины CD5; пептиды и коллаген для перорального применения; динатрий лобензарит; цитокин-регулирующие агенты (CRA) HP228 и НР466 (Houghten Phamaceuticals, Inc.); антисмысловые фосфоротиоатные олигодеэоксинуклеотиды ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Phamaceuticals, Inc.); растворимый рецептор комплемента 1 (ТР10; Т Cell Sciences, Inc.); преднизон; орготеин; гликозаминогликана полисульфат; миноциклин; антитела против IL2R; морские и растительные липиды (жирные кислоты морских животных и растений; см., например DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); ауранофин; фенилбутазон; меклофенамовая кислота; флуфенамовая кислота: иммунный глобулин для внутривенного введения; зилеутон; микофеноловая кислота (RS-61443); такролимус (FK-506); сиролимус (рапамицин); амиприлоза (терафектин); кладрибин (2-хлордезоксиаденозин) и азарибин.

Неограничивающие объем изобретения примеры терапевтических агентов от воспалительных заболеваний кишечника, с которыми можно комбинировать антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, включают следующее: буденозид; эпидермальный ростовой фактор; кортикостероиды; циклоспорин; сульфасалазин; аминосалицилаты; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; ингибиторы липоксигеназы; месаламин; олсалазин; балсалазид; антиоксиданты; ингибиторы тромброксана; антагонисты рецептора IL-1; моноклональные антитела против IL-1β; моноклональные антитела против IL-6; ростовые факторы; ингибиторы эластазы; соединения пиридинил-имидазола; CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело против hTNFα; Celltech/Bayer); cA2 (химерное антитело против hTNFα; Centocor); TNFR-IgG молекулярной массы 75 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 75 кД; Immunex; см., например, athritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, 295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); TNFR-IgG молекулярной массы 55 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 55 кД; Hoffmann-Laoche); интерлейкин-10 (SCH 52000; Schering Plough); IL-4; агонисты IL-10 и/или IL-4 (например, агонистические антитела); интерлейкин-11; глюкуронид- или декстран-конъюгированные пролекарственные формы преднизолона, дексаметазона или будезонида; антисмысловые фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Phamaceuticals, Inc.); растворимый рецептор комплемента 1 (ТР10; Т Cell Sciences, Inc.); медленно высвобождающийся месалазин; метотрексат; антагонисты фактора активации тромбоцитов (PAF); ципрофлоксацин и лигнокаин.

Неограничивающие объем изобретения примеры терапевтических агентов от рассеянного склероза, с которыми можно комбинировать антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, включают следующее: кортикостероиды; преднизолон; метилпреднизолон; азатиоприн; циклофосфамид; циклоспорин; метотрексат; 4-аминопиридин; тизанидин; интерферон-β1a (Avonex^TM; Biogen); интерферон-β1b (Betaseron™; Chiron/Berlex); Сополимер 1 (Cop-1; Copaxone™; Teva Phamaceutical Industries Inc.); гипербарический кислород; иммуноглобулин для внутривенного введения; клабридин; CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело против hTNFα; Celltech/Bayer); cA2 (химерное антитело против hTNFα; Centocor); TNFR-IgG молекулярной массы 75 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 75 кД; Immunex; см., например, athritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, 295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); TNFR-IgG молекулярной массы 55 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 55 кД; Hoffmann-Laoche); IL-10; IL-4; агонисты IL-10 и/или IL-4 (например, агонистические антитела).

Неограничивающие примеры терапевтических агентов от сепсиса, с которыми можно комбинировать антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, включают следующее: гипертонические солевые растворы; антибиотики; γ-глобулин; продолжительная гемофильтрация; карбапенемы (например, меропенем); антагонисты цитокинов, такие как TNFα, IL-1β, IL-6 и/или 1L-8; CDP-571 /BAY-10-3356 (гуманизированное антитело против hTNFα; Celltech/Bayer); cA2 (химерное антитело против hTNFα; Centocor); TNFR-IgG молекулярной массы 75 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 75 кД; Immunex; см., например, athritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, 295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); TNFR-IgG молекулярной массы 55 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 55 кД; Hoffmann-Laoche); цитокин-регулирующие агенты (CRA) HP228 иНР466 (Houghten Phamaceuticals, Inc.); SK&F 107647 (низкомолекулярный пептид; SmithKline Beecham); четырехвалентный гуанилгидразон CN 1-1493 (Picower Institute); ингибитор пути биосинтеза тканевого фактора (TFPI; Chiron); PHP (химически модифицированный гемоглобин; APEX Bioscience); хелаторы и хелаты железа, включая комплекс диэтилентриаминпентауксусная кислота - железо (III) (DTPA iron (III); Molichem Medicines); лизофиллин (синтетическая маленькая молекула метилксантина; Cell Therapeutics, Inc.); PGG-глюкан (водорастворимый β-1,3-глюкан; Alpha-Beta Technology); аполипопротеин А-1, реконструированный липидами; хиральные гидроксамовые кислоты (синтетические антибактериальные агенты, которые ингибируют биосинтез липида А); антитела против эндотоксина; Е5531 (синтетический антагонист липида A; Eisai America, Inc.); rBPI₂₁, (рекомбинантный N-концевой фрагмент человеческого бактерицидного/повышающего проницаемость белка) и синтетические пептиды против эндотоксина (SAEP; BiosYnth Reserch Laboratories).

Неограничивающие примеры терапевтических агентов от респираторного дистресс-синдрома взрослых (αDS), с которыми можно комбинировать антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, включают следующее: антитела против IL-8; терапия замещением поверхностно-активных веществ; CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело против hTNFα; Celltech/Bayer); cA2 (химерное антитело против hTNFα; Centocor); TNFR-IgG молекулярной массы 75 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 75 кД; Immunex; см., например, athritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, 295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); TNFR-IgG мол. массы 55 кД (слитый белок рецептор TNF-IgG мол. массы 55 кД; Hoffmann-Laoche).

Применение антител или фрагментов антител, соответствующих изобретению, в комбинации с другими терапевтическими агентами обсуждается ниже в подразделе IV.

Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или фрагмента антитела, соответствующего изобретению. "Терапевтически эффективное количество" означает количество, эффективное в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или фрагмента антитела может изменяться в соответствии с такими факторами, как состояние болезни, возраст, пол и масса субъекта и способность антитела или фрагмента антитела вызывать желаемый ответ у субъекта. Терапевтически эффективное количество является также количеством, в котором какие-либо токсические или вредные эффекты антитела или фрагмента антитела перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. Профилактически эффективное количество означает количество, эффективное в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. В типичном случае, поскольку профилактическую дозу используют у субъектов до или на ранней стадии заболевания, то профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Схемы дозировки могут быть доведены до получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть введена одна ударная доза, может быть введено несколько отдельных доз через период времени или доза может пропорционально снижаться или повышаться, что определяется нуждами терапевтической ситуации. Особенным преимуществом является приготовление парэнтеральных композиций в стандартной дозированной форме для простоты применения и одинаковой дозировки. Стандартная дозированная форма, как используют здесь, означает физически дискретные единицы, пригодные в качестве отдельных доз для субъектов-млекопитающих, которых лечат; каждая единица содержит определенное количество активного соединения, рассчитанного для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Определение стандартных дозированных форм, соответствующих изобретению, диктуется и прямо зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и определенного терапевтического или профилактического эффекта, который предусматривают получить, и (b) ограничений, присущих способу получения такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.

Примерный неограничивающий интервал для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или фрагмента антитела, соответствующего изобретению, составляет 0,1-20 мг/кг, более предпочтительно 1-10 мг/кг. Следует отметить, что значения дозы могут изменяться в зависимости от типа и остроты облегчаемого состояния. Кроме того, следует понять, что для любого определенного субъекта должны быть через период времени подобраны специфические схемы дозировки в соответствии с нуждами субъекта и профессионализмом специалиста, который вводит или руководит введением композиций, и что представленные здесь интервалы доз являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или применения заявленной композиции.

IV. Применение антител, соответствующих изобретению

С учетом их способности связывать hTNFα антитела против hTNFα или их фрагменты, соответствующие изобретению, могут быть использованы для детекции hTNFα (например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма), с помощью известного метода иммуноанализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимия ткани. Изобретение представляет способ детекции hTNFα в биологическом образце, предусматривающий контактирование биологического образца с антителом или фрагментом антитела, соответствующим изобретению, и детекцию либо антитела (или фрагмента антитела), связанного с hTNFα, либо несвязанного антитела (или фрагмента антитела) для выявления таким образом hTNFα в биологическом образце. Антитело прямо или непрямо метят определяемой субстанцией для облегчения детекции связанного или несвязанного антитела. Подходящие определяемые субстанции включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, хлорид дансила или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол и примеры подходящих радиоактивных материалов включают ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³H.

Альтернативно мечению антитела hTNFα может быть определен в биологических образцах конкурентным иммуноанализом с использованием стандартов rhTNFα, меченных определяемой субстанцией, и немеченых антител против hTNFα. В данном анализе смешивают биологический образец, стандарты меченого rhTNFα и антитело против hTNFα и определяют количество стандарта меченого rhTNFα, связанного с немеченым антителом. Количество hTNFα в биологическом образце обратно пропорционально количеству стандарта меченого rhTNFα, связанного с антителом против hTNFα.

Антитело D2E7, соответствующее изобретению, также может быть использовано для детекции TNFα из видов, отличных от человека, в частности, TNFα приматов (например, шимпанзе, павиана, игрунки, циномолгуса и резуса), свиньи и мыши, поскольку D2E7 может связывать каждое их этих TNFα (обсуждается далее в Примере 4, подраздел Е).

Антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, способны нейтрализовать активность hTNFα in vitro и in vivo (см. Пример 4). Более того, по меньшей мере некоторые антитела, соответствующие изобретению, такие как D2E7, могут нейтрализовать активность TNFα, выделенного из другого вида. Соответственно антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для ингибирования активности TNFα, например, в культуре клеток, содержащих hTNFα, у человека или других млекопитающих, имеющих TNFα, с которыми антитела, соответствующие изобретению, перекрестно реактивны (например, шимпанзе, павиана, игрунки, циномолгуса и резуса, свиньи и мыши). В одном варианте осуществления изобретение представляет способ ингибирования активности TNFα, предусматривающий контактирование TNFα с антителом или фрагментом антитела, соответствующим изобретению, при этом активность TNFα ингибируется. Предпочтительно ТNFα является человеческим TNFα. Например, антитело или фрагмент антитела, соответствующий изобретению, может быть добавлен в культуру клеток, содержащих или предположительно содержащих TNFα, с целью ингибирования активности TNFα в культуре.

В другом варианте осуществления изобретение представляет способ ингибирования активности TNFα у субъекта, страдающего нарушениями, при которых активность TNFα является вредной. TNFα участвовал в патофизиологии широкого ряда нарушений (см., например, Moeller A. et аl.(1990), Cytokine 2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et al.; European Patent Publication No 260610 B1 Moeller А.). Изобретение представляет собой применение антител или его фрагмента для субъекта с нарушениями, касающимися активности TNFα, которые предусматривают введение субъекту антитела или фрагмента антитела, соответствующего изобретению, при этом ингибируется активность TNFα у субъекта. Предпочтительно TNFα является человеческим TNFα и субъект является человеком. Альтернативно субъект может быть млекопитающим, экспрессирующим TNFα, с которым антитела, соответствующие изобретению, перекрестно реактивны. Далее, субъект может быть млекопитающим, которому был интродуцирован hTNFα (например, посредством введения hTNFα или экспрессии трансгена hTNFα). Антитело, соответствующее изобретению, может быть введено человеку с терапевтическими целями (дальнейшее обсуждение ниже). Более того, антитело, соответствующее изобретению, может быть введено млекопитающему животному, экспрессирующему TNFα, с которым антитело перекрестно реактивно (например, примату, свинье или мыши) с ветеринарной целью или как модели на животном болезни человека. Относительно последнего такие модели на животных могут быть использованы для оценки терапевтической эффективности антител, соответствующих изобретению (например, тестирования доз и времени курса применения).

Как используют здесь, термин "нарушение, при котором активность TNFα является вредной," предусматривает включение заболеваний и других нарушений, при которых присутствие hTNFα у субъекта, страдающего от нарушения, как было показано или предполагается, либо обусловливает патофизиологию нарушения, либо является фактором, который усугубляет нарушение. Соответственно нарушение, при котором активность TNFα является вредной, представляет собой нарушение, при котором ингибирование активности TNFα, как ожидается, уменьшает симптомы и/или развитие нарушения. Такие нарушения могут быть обнаружены, например, по повышению концентрации TNFα в биологической жидкости субъекта, страдающего от нарушения (например, повышение концентрации TNFα в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.п. субъекта), которая может быть определена, например, с помощью антитела против TNFα, как описано выше. Существует множество примеров нарушений, при которых активность TNFα является вредной. Применение антител и фрагментов антител, соответствующих нарушению, при лечении специфических нарушений далее обсуждается ниже:

А. Сепсис

Фактор некроза опухоли играет установленную роль в патофизиологии сепсиса с биологическими эффектами, включающими гипотензию, ослабление миокарда, синдром подтекания сосудов, некроз органов, стимуляцию выхода токсических вторичных медиаторов и активацию каскада свертывания крови (см., например, Moeller A., et al.(1990), Cytokine 2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et at.; Европейский Патент No 260610 B1 Moeller A.; Tracey K.J. and Cerami A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russel D. and Thompson R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). Соответственно человеческие антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для лечения сепсиса в любом из его клинических проявлений, включая септический шок, эндотоксический шок, сепсис, вызываемый грамотрицательными бактериями, и токсический шоковый синдром.

Более того, для лечения сепсиса антитела против hTNFα и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть введены вместе с одним или более терапевтическим агентом, который может еще более ослабить сепсис, таким как ингибитор интерлейкина-1 (описанные в Публикациях РСТ No WO 92/16221 и WO 92/17583), цитокин интерлейкин-6 (см., например, Публикацию РСТ No WO 93/11793) или антагонист фактора активации тромбоцитов (см., например, Европейскую Патентную заявку No EP 374510). Другие способы комбинированной терапии для лечения сепсиса обсуждаются ниже в подразделе III.

Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления антитело против hTNFα и фрагменты антитела, соответствующие изобретению, вводят человеку из подгруппы пациентов с сепсисом, имеющих концентрацию IL-6 в сыворотке или плазме более 500 пг/мл и более предпочтительно 1000 пг/мл во время лечения (см. Публикацию РСТ No WO 95/20978 Daum L et al.).

В. Аутоиммунные заболевания

Фактор некроза опухоли, как было установлено, играет роль в патофизиологии ряда аутоиммунных заболеваний. Например, TNFα участвовал в активации воспаления тканей и вызывал разрушение суставов при ревматоидном артрите (см., например, Moeller A. et al.(1990), Cytokine 2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et al.; Европейский Патент No 260610 B1 Moeller A.; Tracey K.J. and Cerami A., supra; end W.P. and Dayer J.M. (1995) ath. Rheum. 38:151-160; Fava R.A. et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266). TNFα участвовал также в стимуляции гибели островков клеток и в образовании инсулин-резистентности при диабете (см., например, Tracey and Cerami, supra; Публикация РСТ No WO 94/08609). TNFα участвовал также в появлении цитотоксичности в отношении олигодендроцитов и индукции воспалительных бляшек при рассеянном склерозе (см., например, Tracey and Cerami, supra). Химерные и гуманизированные мышиные антитела против hTNFα прошли клиническую проверку для лечения ревматоидного артрита (см., например, Elliot M.J. et al. (1994); Lancet 344:1125-1127; Elliot M.J. et al. (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin E.C. et al. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).

Человеческие антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, ассоциированных с воспалением, включая ревматоидный артрит, ревматоидный спондилит, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит и почечный синдром. В типичном случае антитело или фрагмент антитела применяются системно, хотя для некоторых нарушений может быть успешным местное применение антитела или фрагмента антитела в области воспаления (например, местное введение в суставы при ревматоидном артрите или наружное применение при диабетических язвах, отдельно или в сочетании с производным циклогексанилидена, как описано в Публикации РСТ No WO 93/19751). Антитело и фрагмент антитела, соответствующие изобретению, также могут применяться с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, используемыми при лечении аутоиммунных заболеваний, как описано далее в подразделе III.

С. Инфекционные болезни

Фактор некроза опухоли участвовал в появлении биологических эффектов, наблюдаемых при ряде инфекционных болезней. Например, hTNFα участвовал в развитии воспаления головного мозга и тромбозе капилляров и инфаркте при малярии. TNFα также участвовал в развитии воспаления головного мозга, индукции разрушения гематоэнцефалического барьера, развитии синдрома септического шока и активации венозного инфаркта при менингите. TNFα также участвовал в индукции кахексии, стимуляции пролиферации вирусов и образовании повреждений центральной нервной системы при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД). Соответственно антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для лечения инфекционных болезней, включая бактериальный менингит (см., например, Европейскую Патентную заявку No ЕР 585705), церебральную малярию, СПИД и СПИД-ассоциированный комплекс (αC) (см., например, Европейскую Патентную заявку No EP 230574), а также вторичную инфекцию цитомегаловируса при трансплантации (см., например, Fietze E., et al. (1994) Transplantation 58:675-680). Антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для облегчения симптомов, ассоциированных с инфекционными болезнями, включая лихорадку и миалгии, обусловленные инфекцией (такой как грипп), и вторичную кахексию при инфекции (например, вторичную при СПИД или αC).

D. Трансплантация

Фактор некроза опухоли рассматривали как ключевой медиатор в отторжении трансплантата и болезни трансплантат против хозяина (GVHD) и в образовании побочной реакции, которую отмечали, когда крысиное антитело ОКТЗ, направленное против комплекса Т-клеточный рецептор - CDR, использовали для ингибирования отторжения почечных трансплантатов (см., например, Eason J.D. et al. (1995) Transplantation 59:300-305; Suthanthiran M. and Strom T. В. (1994) New Engl. J. Med. 331:365-375). Соответственно антитела и фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для ингибирования отторжения трансплантата, включая отторжение аллотрансплантатов и ксенотрансплантатов, и для ингибирования GVHD. Хотя антитело или фрагмент антитела могут быть использованы отдельно, более предпочтительно их использование в комбинации с одним или более агентов, которые ингибируют иммунный ответ против аллотрансплантата или ингибируют GVHD. Например, в одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, соответствующего изобретению, используют в комбинации с одним или более антител, направленных на другие мишени, участвующие в регуляции иммунных ответов, такие как поверхностные молекулы клетки CD25 (рецептор-β интерлейкина-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (В7-1) и/или CD86 (В7-2). В еще одном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, используют в комбинации с одним или более основных иммуносупрессирующих агентов, таких как циклоспорин А или FK506.

Е. Злокачественные новообразования

Фактор некроза опухоли участвовал в индукции кахексии, стимуляции роста опухоли, усилении метастатического потенциала и появлении цитотоксичности при злокачественных новообразованиях. Соответственно антитела или фрагменты антител, соответствующих изобретению, используют при лечении злокачественных новообразований для ингибирования роста опухоли или метастазов и/или для облегчения вторичной кахексии при злокачественных новообразованиях. Антитело или фрагмент антитела могут вводиться системно или местно в область опухоли.

F. Легочные нарушения

Фактор некроза опухоли участвовал в патофизиологии респираторного дистресс-синдрома взрослых (αDS), включая стимуляцию активации эндотелиальных лейкоцитов, направленность цитотоксичности на пневмоциты и индукцию синдрома подтекания сосудов. Соответственно антитела или фрагменты антител, соответствующих изобретению, могут быть использованы при лечении различных легочных заболеваний, включая респираторный дистресс-синдром взрослых (см., например, Публикацию РСТ No WO 91/04054), легочный шок, хроническое легочное воспалительное заболевание, легочный саркоидоз, легочный фиброз и силикоз. Антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут вводиться с одним или более дополнительным терапевтическим агентом, используемым при лечении легочных нарушений, как описано ниже в подразделе III.

G. Кишечные нарушения

Фактор некроза опухоли участвовал в патофизиологии воспалительных кишечных нарушений (см., например, Tracy K.J., et al. (1986) Science 234:470-474; Sun X-M., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:1328-1331; MacDonald T.T., et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 301-305). Химерные мышиные антитела против hTNFα прошли клиническую проверку для лечения болезни Крона (van Dullemen H.M. et al.(1995) Gastroenterology 109:129-135). Человеческое антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут быть также использованы для лечения кишечных нарушений, таких как идиопатическое воспалительное заболевание кишечника, которое включает два синдрома - болезнь Крона и язвенный колит. Антитело или фрагмент антитела, соответствующие изобретению, могут также вводится с одним или более дополнительным терапевтическим агентом, используемым при лечении кишечных нарушений, как описано ниже в подразделе III.

Н. Сердечные нарушения

Антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут также быть использованы для лечения различных сердечных нарушений, включая ишемию сердца (см., например, Европейскую Патентную заявку No ЕР 453898) и сердечную недостаточность (слабость сердечной мышцы) (см., например, Публикацию РСТ No WO 94/20139).

I. Другие

Антитела или фрагменты антител, соответствующие изобретению, могут также быть использованы для лечения различных нарушений, при которых активность TNFα является вредной. Примеры других заболеваний и нарушений, при которых активность TNFα участвует в патофизиологии и которые таким образом могут лечиться с использованием антитела или фрагмента антитела, соответствующего изобретению, включают воспалительные костные нарушения и заболевания, связанные с резорбцией кости (см., например, Bertolini D.R., et al. (1986) Nature 319:516-518; Konig A., et al. (1988) J. Bone Miner. Res. 3:621-627; Lerner U.H. and Ohiin A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8:147-155 и Shanka G. and Stern P.H. (1993) Bone 14:871-876), гепатит, включая алкогольный гепатит (см., например, McClain C.J. and Cohen D.A. (1989) Hepatology 9:349-351; Felver M.E. et al. (1990) Alcohol Clin. Exp. Res. 14:255-259 и Hansen J. et al. (1994) Hepatology 20:461-474), вирусный гепатит (Sheron N. et al. (1991) J. Hepatol. 12:241-245 и Hussain M.J. et al. (1994) J. Clin. Pathol. 47:1112-1115) и фульминантный гепатит; нарушения свертывания (см., например, van der Poll Т. et al. (1990) N. Engl. J. Med. 322:1622-1627; van der Poll Т. etal. (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60; ожоги (см., например, Giroir B.P. et al. (1994) Am. J. Physiol. 267:H118-124; Liu X.S. et al. (1994) Burns 20:40-44), реперфузионные повреждения (см., например, Scales W.E. et al. (1994) Am. J. Physiol. 26:1122-1127; Serrick С. et al. (1994) Transplantation 58:1158-1162; Yao Y.M. et al. (1995) Resuscitation 29:157-168), формирование келоида (см., например, McCauley R. L et al. (1992) J. Clin. Immunol. 12:300-308), формирование рубцовой ткани; гипертермию, заболевания периодонта, ожирение и токсичность облучения.

Данное изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует истолковывать как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных в данной заявке, введено здесь в виде ссылки.

Пример 1: Кинетический анализ связывания человеческих антител с hTNFα

Происходящие в данный момент взаимодействия связывания лиганда (биотинилированного рекомбинантного человеческого hTNFα (rhTNFα), иммобилизованного на матриксе биосенсора) и аналита (антитела в растворе) измеряют с помощью поверхностного плазменного резонанса (SPR), используя систему BIAcore (Phamacia Biosensor, Piscataway, NJ). В системе используют оптические свойства SPR для детекции изменений концентраций белка в декстра новом матриксе биосенсора. Белки ковалентно связаны с декстрановым матриксом при известных концентрациях. Антитела инжектируют в декстрановый метрике, и специфическое связывание инжектированных антител и иммобилизованных лигандов обусловливает повышенную концентрацию белков в матриксе и, как результат, изменение сигнала SPR. Эти изменения сигнала SPR регистрируют как единицы резонанса (RU) и выражают относительно времени по оси Y сенсограммы.

Для облегчения иммобилизации биотинилированного rhTNFα на матриксе биосенсора стрептавидин ковалентно связывают посредством свободных аминогрупп с декстрановым матриксом с помощью карбоксильных групп на матриксе, предварительно активированных 100 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS) и 400 мМ гидрохлорида N-этил-N'-(3-диэтиламинопропил)карбодиимида (EDC). Затем стрептавидин вводят в активированный матрикс. Тридцать пять микролитров стрептавидина (25 мкг/мл), разведенного в ацетате натрия, рН 4,5, вводят в активированный биосенсор, и свободные амины на белке непосредственно связывают активированные карбоксильные группы. Непрореагировавшие EDC-сложные эфиры матрикса дезактивируют инъекцией 1 М этаноламина. Чипы связанного со стрептавидином биосенсора имеются также в продаже (Phamacia BR-1000-16, Phamacia Biosensor, Piscataway, NJ).

Для получения биотинилированного rhTNFα сначала растворяют 5,0 мг биотина (N-гидроксисукцинимидный сложный эфир D-биотинил-∈-аминокапроновой кислоты; Boehringer Mannheim, Каталог No 1008 960) и 500 мкл диметилсульфоксида для получения раствора 10 мг/мл. Десять микролитров биотина добавляют к 1 мл rhTNFα (2,65 мг/мл) для получения молярного соотношения биотина к rhTNFα 2:1.

Реакционную смесь осторожно перемешивают и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре в темноте. Колонку PD-10, SephadexG-25M (Phamacia, каталожный номер 17-0851-01) уравновешивают 25 мл холодного PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и наносят 2 мл rhTNFα-биотина на колонку. Колонку элюируют 10×1 мл холодного PBS. Фракции собирают и определяют при OD280 (0,1 OD=1,25 мг/мл). Соответствующие фракции объединяют и хранят при -80°С до использования. Биотинилированный rhTNFα также имеется в продаже (R & D Systems, Каталог No FTAOO, Minneapolis, MN).

Биотинилированный rhTNFα для иммобилизации на матриксе с помощью стрептавидина разводят в буфере для PBS (Gibco Кат. No 14190-144, Gibco BRL, Grand Island, NY) с добавлением 0,05% (BIAcore) поверхностно-активного вещества Р20 (Phamacia BR-1000-54, Phamacia Biosensor, Piscataway, NJ). Для определения способности rhTNFα-специфичных антител связывать иммобилизованный rhTNFα, анализ связывания выполняют следующим образом. Аликвоты биотинилированного rhTNFα (25 нМ; аликвоты 10 мкл) инъецируют в стрептавидин-связанный декстрановый матрикс со скоростью потока 5 мкл/мин. Перед инъекцией белка и сразу после нее чистым PBS-буфером промывают каждую проточную камеру. Для того чтобы представить величину связывания данного образца (приблизительно 500 RU) берут разницу между базовым сигналом и сигналом, полученным через приблизительно 30 с после окончания инъекции антитела. Измеряют прямое связывание rhTNFα-специфического антитела с иммобилизованным биотинилированным rhTNFα. Антитела (20 мкг/мл) разводят в PBS-буфере и инъецируют аликвоты по 25 мкл в матриксы с иммобилизованным белком со скоростью потока 5 мкл/мин. Перед инъекцией белка и сразу после нее чистым PBS-буфером промывают каждую проточную камеру. Для того чтобы представить величину связывания данного образца берут разницу между базовым сигналом и сигналом, полученным после окончания инъекции антитела. Матриксы биосенсора регенерируют с использованием 100 мМ HCl перед инъекцией следующего образца. Для определения констант скорости (К_off), скорости связывания (К_on), скорости ассоциации (K_a) и скорости диссоциации (К_d) используют программное обеспечение для оценки кинетики BIAcore (версия 2.1).

Полученные результаты связывания D2E7 (антитела lgG4 полной длины) с биотинилированным rhTNFα по сравнению с мышиным mAb МАК 195 (фрагмент F(ab')₂) представлены ниже в Таблице 1.

Таблица 1 Связывание lgG4 D2E7 или МАК 195 с биотинилированным rhTNFα
Антитело	[Ab], нМ	rhTNFα, связанное RUs	Ab, связанное RUs	rhTNFα/Ab	Koff, сек-1, (Avg)
D2E7	267	373	1215	1,14	8,45×10-5
	133	420	1569	1,30	5,42×10-5
	67	434	1633	1,31	4,75×10-5
	33	450	1532	1,19	4,46×10-5
	17	460	1296	0,98	3,47×10-5
	8	486	936	0,67	2,63×10-5
	4	489	536	0,38	2,17×10-5
	2	470	244	0,18	3,68×10-5
					(4,38×10-5)
МАК 195	400	375	881	1,20	5,38×10-5
	200	400	1080	1,38	4,54×10-5
	100	419	1141	1,39	3,54×10-5
	50	427	1106	1,32	3,67×10-5
	25	446	957	1,09	4,41×10-5
	13	464	708	0,78	3,66×10-5
Антитело	[Ab], нМ	rhTNFα, связанное RUs	Ab, связанное RUs	rhTNFα/Ab	Кoff, сек1, (Avg)
	6	474	433	0,47	7,37×10-5
	3	451	231	0,26	6,95×10-5
					(4,94×10-5)

Во второй серии экспериментов молекулярно-кинетические взаимодействия между lgG1 формы D2E7 полной длины и биотинилированного rhTNFα анализируют количественно, используя способ BIAcore, как описано выше, и полученные константы кинетики скорости представлены ниже в Таблицах 2, 3 и 4.

Таблица 2 Экспериментально полученные константы скорости диссоциации взаимодействия D2E7 с биотинилированным rhTNFα
Эксперимент	Kd (сек-1)
1	9,58×10-5
2	9,26×10-5
3	7,60×10-5
Среднее	8,81±1,06×10-5

Таблица 3 Экспериментально полученные константы скорости ассоциации взаимодействия D2E7 с биотинилированным rhTNFα
Эксперимент	Ka (М-1 сек-1)
1	1,33×105
2	1,05×105
3	3,36×105
Среднее	1,91±1,26×105

Таблица 4 Экспериментально полученные константы кинетики скорости и аффинности D2E7 и биотинилированного rhTNFα
Эксперимент	Ka (М-1 сек1)	Kd (сек-1)	Кd (М)
1	1,33×105	9,58×10-5	7,20×10-10
2	1,05×105	9,26×10-5	8,82×10-10
3	3,36×105	7,60×10-5	2,26×10-10
Среднее	1,91±1,26×105	8,81±1,06×10-5	6,09±3,42×10-10

Константы скорости диссоциации и ассоциации вычисляют, анализируя участки диссоциации и ассоциации сенсограмм с помощью программного обеспечения анализа BIA. Для взаимодействия D2E7 и молекулы биотинилированного rhTNFα принимают условные значения кинетики химических реакций: нулевой порядок кинетики диссоциации и первый порядок кинетики ассоциации. При выборе молекулярных моделей для анализа кинетических данных анализу подвергают взаимодействие только одного плеча бивалентного антитела D2E7 и одной единицы трехмерного биотинилированного rhTNFα. Проводят три независимых эксперимента и анализируют результаты отдельно. Средняя полученная константа скорости диссоциации (k_d) взаимодействия D2E7 и биотинилированного rhTNFα составляет 8,81±1,06×10^-5 сек^-1 и средняя полученная константа скорости ассоциации (k_a) составляет 1,91±1,26×10⁵ М^-1 сек^-1. Полученную константу внутренней диссоциации (k_d) затем рассчитывают по формуле: K_d=k_d/k_a. Таким образом значение К_d антитела D2E7 для rhTNFα, выведенное из кинетических параметров, составляет 6,09±3,42× 10^-10 М. Незначительные различия в кинетических значениях для формы lgG1 антитела D2E7 (представлены в Таблицах 2, 3 и 4) и формы lgG4 D2E7 (представлены в Таблице 1 и Примерах 2 и 3) не могут считаться достоверными различиями, обусловленными присутствием константных участков либо lgG1, либо lgG4, а рассматриваются, как связанные с более точными измерениями концентраций антител, используемыми при кинетическом анализе lgG1. Соответственно представленные здесь кинетические значения для формы lgG1 D2E7, как полагают, являются наиболее точными кинетическими параметрами для антитела D2E7. Пример 2. Сканирующий мутагенез аланина в доменах CDR3 D2E7.

Серию мутаций по одному остатку аланина интродуцируют стандартными способами на протяжении домена CDR3 участков VL D2E7 и VH D2E7. Мутации легкой цепи иллюстрируют Фигурой 2 (LD2E7^*.A1, LD2E7^*.A3, LD2E7^*.A4, LD2E7^*.A5, LD2E7^*.A7 и LD2E7^*.A8, имеющие аланиновую мутацию в положении 1, 3, 4, 5, 7 или 8, соответственно, в домене CDR3 VL D2E7). Мутации тяжелой цепи иллюстрируют Фигурой 4 (HD2E7^*.A1, HD2E7^*.A2, HD2E7^*.A3, HD2E7^*.A4, HD2E7^*.A5, HD2E7^*.A6, HD2E7^*.A7, HD2E7^*.A8 и HD2E7^*.A9, имеющие аланиновую мутацию в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 соответственно в домене CDR3 VH D2E7). Кинетику взаимодействия rhTNFα с антителом, содержащим VL и VH D2E7 дикого типа, сравнивают с таковой кинетикой антител, содержащих 1) VL D2E7 дикого типа, связанную с аланин-замещенной VH D2E7; 2) VH D2E7 дикого типа, связанную с аланин-замещенной VL D2E7, или 3) аланин-замещенную VL D2E7, связанную с аланин-замещенной VH D2E7. Все антитела тестируют как молекулы lgG4 полной длины.

Кинетику взаимодействия антител с rhTNFα определяют с помощью поверхностного плазменного резонанса, как описано в Примере 1. Константы скорости К_off для различных пар VH/VL приведены ниже в Таблице 5:

Таблица 5 Связывание аланин-сканмутантов D2E7 с биотинилированным rhTNFα
VH	VL	Кoff (ceк-1)
D2E7 VH	D2E7 VL	9,65×10-5
HD2E7*.A1	D2E7 VL	1,4×10-4
HD2E7*.A2	D2E7 VL	4,6×10-4
VH	VL	Koff (сек-1)
HD2E7*.A3	D2E7 VL	8,15×10-4
HD2E7*.A4	D2E7 VL	1,8×10-4
HD2E7*.A5	D2E7 VL	2,35×10-4
HD2E7*.A6	D2E7 VL	2,9×10-4
HD2E7*.A7	D2E7 VL	1,0×10-4
HD2E7*.A8	D2E7 VL	3,1×10-4
HD2E7*.A9	D2E7 VL	8,1×10-4
D2E7 VH	LD2E7*.A1	6,6×10-5
D2E7 VH	LD2E7*.A3	не определяется
D2E7 VH	LD2E7*.A4	1,75×10-4
D2E7 VH	LD2E7*.A5	1,8×10-4
D2E7 VH	LD2E7*.A7	1,4×10-4
D2E7 VH	LD2E7*.A8	3,65×10-4
HD2E7*.A9	LD2E7*.A1	1,05×10-4

Данные результаты демонстрируют, что большинство положений доменов CDR3 участка VL и участка VH D2E7 пригодны для замены одним остатком аланина. Замена одним аланином в положении 1, 4, 5 или 7 в домене CDR3 VL D2E7 или в положении 2, 5, 6, 8, 9 или 10 в домене CDR3 VH D2E7 не оказывает существенного влияния на скорость диссоциации связывания hTNFα по сравнению с исходным антителом D2E7 дикого типа.

Замена аланином в положении 8 CDR3 VL D2E7 или в положении 3 CDR3 VH D2E7 приводит к повышению К_off в 4 раза, а замена аланином в положении 4 или 11 CDR3 VH D2E7 приводит к повышению К_off в 8 раз, указывая на то, что данные положения являются более критическими для связывания DTNFα. Однако замена одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 в домене CDR3 VL D2E7 или в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 в домене CDR3 VH D2E7 приводит к тому, что антитело против hTNFα имеет К_off 1×10^-3 сек^-1, или менее.

Пример 3: Анализ связывания антител, близких D2E7

Серию антител с последовательностью, близкой D2E7, анализируют на связывание с rhTNFα по сравнению с D2E7 с помощью поверхностного плазменного резонанса, как описано в Примере 1. Аминокислотные последовательности тестированных участков VL приводят на Фигурах 1 и 2. Аминокислотные последовательности тестированных участков VH приводят на Фигурах 3 и 4. Константы скорости К_off для различных пар VH/VL (в указанном формате, либо в виде антител lgG1 или lgG4 полной длины, либо в виде scFv) представлены ниже в Таблице 6:

Таблица 6 Связывание близких D2E7 антител с биотинилированным rhTNFα
VH	VL	Формат	Koff (сек-1)
D2E7 VH	D2E7 VL	IgG1/lgG4	9,65×10-5
VH1-D2	LOE7	IgG1/lgG4	7,7×10-5
VH1-D2	LOE7	scFv	4,6×10-4
VH1-D2.N	LOE7.T	lgG4	2,1×10-5
VH	VL	Формат	Koff (сек-1)
VH1-D2.Y	LOE7.A	lgG4	2,7×10-5
VH1-D2.N	LOE7.A	lgG4	3,2×10-5
VH1-D2	EP B12	scFv	8,0×10-4
VH1-D2	2SD4 VL	scFv	1,94×10-3
3C-H2	LOE7	scFv	1,5×10-3
2SD4 VH	LOE7	scFv	6,07×10-3
2SD4 VH	2SD4 VL	scFv	1,37×10-2
VH1A11	2SD4 VL	scFv	1,34×10-2
VH1B12	2SD4 VL	scFv	1,01×10-2
VH1B11	2SD4 VL	scFv	9,8×10-3
VH1E4	2SD4 VL	scFv	1,59×10-2
VH1F6	2SD4 VL	scFv	2,29×10-2
VH1D8	2SD4 VL	scFv	9,5×10-3
VH1G1	2SD4 VL	scFv	2,14×10-2
2SD4 VH	EPB12	scFv	6,7×10-3
2SD4 VH	VL10E4	scFv	9,6×10-3
2SD4 VH	VL100A9	scFv	1,33×10-2
2SD4 VH	VL100D2	scFv	1,41×10-2
2SD4 VH	VL10F4	scFv	1,11×10-2
2SD4 VH	VLLOE5	scFv	1,16×10-2
2SD4 VH	VLLOF9	scFv	6,09×10-3
2SD4 VH	VLLOF10	scFv	1,34×10-2
VH	VL	Формат	Koff (сек-1)
2SD4 VH	VLLOG7	scFv	1,56×10-2
2SD4 VH	VLLOG9	scFv	1,46×10-2
2SD4 VH	VLLOH1	scFv	1,17×10-2
2SD4 VH	VLLOH10	scFv	1,12×10-2
2SD4 VH	VL1B7	scFv	1,3×10-2
2SD4 VH	VL1C1	scFv	1,36×10-2
2SD4 VH	VL1C7	scFv	2,0×10-2
2SD4 VH	VL0.1F4	scFv	1,76×10-2
2SD4 VH	VL0.1H8	scFv	1,14×10-2

Низкие скорости распада (т.е. К_off≤1×10^-4 с^-1) для антител полной длины (например, формы IgG), имеющих VL, выбранную из D2E7, LOE7, LOE7.T и LOE7.A, которые содержат либо треонин, либо аланин в положении 9, указывают, что положение 9 CDR3 VL D2E7 может быть занято любым из этих двух остатков без существенного влияния на К_off. Соответственно консенсусный участок CDR3 VL D2E7 имеет аминокислотную последовательность Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID No 3). Более того, низкие скорости диссоциации (т.е. К_off≤1×10^-4 с^-1) для антител, имеющих VH, выбранную из D2E7, VH 1 -D2.N и VH 1 -D2.Y, которые имеют либо тирозин, либо аспарагин в положении 12, указывают, что положение 12 CDR3 VH D2E7 может быть занято любым из этих двух остатков без существенного влияния на К_off. Соответственно консенсусный участок для CDR3 VH D2E7 имеет аминокислотную последовательность V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID No 4).

Результаты, приведенные в Таблице 6, демонстрируют, что в формате scFv антитела, содержащие участок CDR3 VL или VH 2SD4 имеют более высокую К_оff (т.е. К_off≥1×10^-3 с^-1) по сравнению с антителами, содержащими участок CDR3 VL или VH D2E7. По CDR3 VL 2SD4 отличается от D2E7 в положениях 2, 5 и 9. Однако, как указывалось выше, положение 9 может быть занято Ala (как в 2SD4) или Thr (как в D2E7) без существенного влияния на K_off. Таким образом, при сравнении 2SD4 и D2E7 положения 2 и 5 CDR3 VL D2E7 (оба аргинины) могут быть идентифицированы как критические для ассоциации антитела с hTNFα. Эти остатки могут непосредственно вовлекаться в процесс связывания антитела как контактирующие остатки или могут играть критическую роль в поддержании структуры складывания молекулы антитела в данном участке. В отношении важности положения 2 отмечают, что замена Аrg (в LOE7, которое имеет такой же CDR3 VL, как D2E7) на Lys (в ЕР В12) увеличивает скорость диссоциации на коэффициент два. В отношении важности положения 5 отмечают, что замена αg (в D2E7) на Ala (в LD2E7^*.A5), как описано в Примере 5, также увеличивает скорость диссоциации в два раза. Более того, без любого из Аrg в положениях 2 и 5 (в 2SD4) скорость диссоциации повышается в пять раз. Однако следует отметить, что, хотя положение 5 является важным для улучшенного связывания hTNFα, изменение в этом положении может быть негативным в отношении изменений в других положениях, как видно у VLLOE4, VLLOH1 или VL0.1H8.

Среди CDR3 VH 2SD4 отличается от D2E7 в положениях 1, 7 и 12. Однако, как обсуждалось выше, положение 12 может быть занято Asn (как в 2SD4) или Тyr (как в D2E7) без существенного влияния на константу скорости К_off. Таким образом, при сравнении 2SD4 и D2E7 положения 1 и 7 CDR3 VH D2E7 могут быть идентифицированы как критические для связывания с DTNFα. Как описано выше, данные остатки могут непосредственно находиться в сайте связывания антитела, как контактирующие остатки, или могут играть критическую роль в поддержании структуры складывания молекулы антитела в данном участке. Оба положения являются важными для связывания hTNFα, поскольку, когда используют CDR3 VH 3C-H2 (который содержит замену валина аланином в положении 1 относительно CDR3 VH D2E7), то scFv имеет скорость диссоциации, которая в три раза выше, чем при использовании CDR3 VH D2E7, но эта скорость все же в четыре раза меньше, чем при использовании CDR3 VH D2E7 (который имеет изменения в обоих положениях 1 и 7 относительно CDR3 VH D2E7).

Пример 4: Функциональная активность D2E7

Для исследования функциональной активности D2E7 это антитело используют в ряде анализов, в которых определяют способность антитела ингибировать активность hTNFα либо in vitro, либо in vivo.

А. Нейтрализация TNFα-индуцированной цитотоксичности в клетках L929

Человеческий рекомбинантный TNFα (rhTNFα) вызывает клеточную цитотоксичность мышиных клеток L929 после инкубации в течение 18-24 час. Человеческие антитела против hTNFα оценивают в анализах с использованием L929 при совместном инкубировании антител с rhTNFα и клетками следующим образом. В 96-луночном планшете для микротитрования, содержащем 100 мкл Аb против hTNFα, делают серийные дублированные разведения на 1/3 глубины планшета, используя среду RPMI, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Добавляют 50 микролитров rhTNFα до конечной концентрации 500 пг/мл в каждую лунку с образцом. Затем планшеты инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 50 мкл TNFα-чувствительных мышиных фибробластов L929 до конечной концентрации 5×10⁴ клеток на лунку, включая 1 мкг/мл актиномицина D. Контроль содержит среду с клетками и rhTNFα с клетками. Эти контрольные опыты и стандартную кривую TNFα в интервале от 2 нг/мл до 8,2 пг/мл используют для определения качества анализа и получения "окна" нейтрализации. Затем лунки инкубируют в течение ночи (18-24 часа) при 37°С в 5% СО₂.

Из каждой лунки удаляют сто микролитров среды и добавляют 50 мкл бромида 3,(4,4-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенил-татразолия (ММТ;

имеющийся в продаже у Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в PBS с концентрацией 5 мг/мл. Затем планшеты инкубируют в течение 4 часов при 37°С. Затем в каждую лунку добавляют по 50 мкл 20%-ного раствора додецилсульфата натрия (SDS) и планшет инкубируют при 37°С в течение ночи. Измеряют оптическую плотность при 570/630 нм, строят кривые для каждого образца и определяют IC₅₀ стандартными способами.

Характерные результаты для человеческих антител, имеющих различные пары VL и VH по сравнению с мышиным mAb МАК 195, представлены ниже на Фигуре 5 и в Таблице 7.

Таблица 7 Нейтрализация TN Fα-индуцированной цитотоксичности L929
VH	VL	Структура	IC50, M
D2E7	D2E7	scFv	1,1×10-10
D2E7	D2E7	lgG4	4,7×10-11
2SD4	2SD4	scFv/lgG1/lgG4	3,0×10-7
2SD4	LOE7	scFv	4,3×10-8
VH1-D2	2SD4	scFv	1,0×10-8
VH1-D2	LOE7	scFv/lgG1/lgG4	3,4×10-10
VH1.D2.Y	LOE7.T	lgG4	8,1×10-11
VH1-D2.N	LOE7.T	lgG4	1,3×10-10
VH1-D2.Y	LOE7.A	lgG4	2,8×10-11
VH1-D2.N	LOE7.A	lgG4	6,2×10-11
МАК 195	МАК 195	scFv	1,9×10-8
МАК 195	МАК 195	F(ab')2	6,2×10-11

Результаты, представленные на Фигуре 5 и в Таблице 7, демонстрируют, что человеческие антитела D2E7 против hTNFα и различные близкие D2E7 антитела нейтрализуют ТNFα-индуцированную цитотоксичность L929 с активностью, приблизительно равной активности мышиного mAb МАК 195 против hTNFα.

В другой серии экспериментов исследуют способность формы lgG1 D2E7 нейтрализовать TNFα-индуцированную цитотоксичность L929, как описано выше. Результаты трех независимых экспериментов и их среднее значение представлены ниже в Таблице 8:

Таблица 8: Нейтрализация TNFα-индуцированной цитотоксичности L929 посредством lgG1 D2E7
Эксперимент	IC50 [M]
1	1,26×10-10
2	1,33×10-10
3	1,15×10-10
Среднее	1,25±0,01×10-10

Эта серия экспериментов подтверждает, что D2E7 в форме lgG1 полной длины нейтрализует TNFα-индуцированную цитотоксичность L929 со средним значением IC₅₀ [M] 1,25±0,01×10^-10.

В. Ингибирование связывания TNFα с рецепторами TNFα на клетках U-937

Способность человеческих антител против TNFαr ингибировать связывание hTNFα с рецепторами hTNFα на поверхности клеток исследуют, используя клеточную линию U-937 (АТСС No CRL 1593), линию гистиоцитов человека, которая экспрессирует рецепторы hTNFα. Клетки U-937 выращивают в среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone A-1111, Hyclone Laboratories, Logan, UT), L-глутамина (4 нМ), буферного раствора HEPES (10 мМ), пенициллина (100 мкг/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Для исследования активности антител IgG полной длины клетки U-937 предварительно инкубируют с PBS с добавлением 1 мг/мл человеческого IgG (Sigma I-4506, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в течение 45 мин на льду и затем клетки три раза промывают связывающим буфером. Для анализа связывания рецептора клетки U-937 (5×10⁶ клеток/лунку) инкубируют в связывающем буфере (PBS с добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина) в 96-луночных планшетах для микротитрования (CostaCorp., Cambridge, МА) вместе с меченым ¹²⁵I rhTNFα (3×10^-10 М; 25 мкКюри/мл, получаемым от NEN Reseach Products, Wilmington, DE) в присутствии или без антител против hTNFα в общем объеме 0,2 мл. Планшеты инкубируют на льду в течение 1,5 час. Затем 75 мкл каждого образца переносят в тест-пробирки емкостью 1,0 мл (Sastedt 72.700, Sastedt Corp., Princeton, NJ), содержащие дибутилфталат (Sigma-D-2270, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и динонилфталат (ICN 210733, ICN, Irvine, CA). Тест-пробирки содержат 300 мкл смеси дибутилфталата и динонилфталата в объемном соотношении 2:1 соответственно. Свободный (т.е. несвязанный) меченый ¹²⁵I rhTNFα удаляют с помощью микроцентрифугирования в течение пяти минут. Затем конец каждой тест-пробирки, содержащий осадок клеток, отрезают ножницами для микропробирок (Bel-at 210180001, Bel-at Products, Pequannock, NJ). Осадок клеток содержит меченый ¹²⁵I rhTNFα, связанный с рецептором TNFα p60 или р80, тогда как водная фаза над масляной смесью содержит избыток свободного меченого ¹²⁵I rhTNFα. Все осадки клеток собирают в пробирке для определения (Falcon 2052, Becton Dickinson Labwae, Lincoln Pak, NJ) и проводят подсчет в сцинтиляционном счетчике.

Показательные результаты представлены на Фигуре 6. Величина IC₅₀ для ингибирования с помощью D2E7 связывания hTNFαr с рецепторами hTNFα на клетках U-937 составляет в данных экспериментах приблизительно 3×10^-10 М. Эти результаты показывают, что человеческое антитело D2E7 против hTNFα ингибирует связывание rhTNFα с рецепторами hTNFα на клетках U-937 в концентрациях, приблизительно равных концентрациям mAb МАК 195 против hTNFαr.

В другой серии экспериментов способность формы lgG1 D2E7 ингибировать связывание rhTNFα с рецепторами DTNFα на клетках U-937 исследуют, как описано выше. Результаты трех независимых экспериментов и их среднее значение приведены в Таблице 9.

Таблица 9 Ингибирование связывания рецептора TNFα на клетках U-937 посредством lgG1 D2E7
Эксперимент	IC50 [М]
1	1,70×10-10
2	1,49×10-10
3	1,50×10-10
Среднее	1,56±0,12×10-10

Данная серия экспериментов подтверждает, что D2E7 в форме lgG1 полной длины ингибирует связывание рецептора TNF на клетках U-937 со средним IC₅₀ [M] 1,56±0,12×10^-10.

Для исследования ингибирующей активности D2E7 при связывании ¹²⁵I-rhTNFα, связанного с отдельными рецепторами р55 и р75 проводят твердофазный радиоиммуноанализ. Для определения значений 1650 D2E7 в отношении выделенных рецепторов TNF различные концентрации антитела инкубируют с концентрацией 3×10^{-10 125}I-rhTNFα. Затем смесь тестируют на отдельных чашках, содержащих рецепторы TNF р55, либо р75 дозазависимым способом. Результаты представлены ниже в Таблице 10:

Таблица 10 Ингибирование связывания рецептора TNFα с р55 и р75 TNFR посредством lgG1 D2E7
	IC50 [M]
Реагент	р 55 TNFR	р 75 TNFR
D2E7	1,47×10-9	1,26×10-9
rhTNF	2,31×10-9	2,70×10-9

Ингибирование связывания ¹²⁵I-rhTNFα с рецепторами TNF р55 и р75 на клетках U-937 с помощью D2E7 сопровождается простой сигмоидной кривой, показывающей близкие величины IC₅₀ для каждого рецептора. В экспериментах с использованием твердофазного радиоиммуноанализа (RIA) с рекомбинантными рецепторами TNF значения 1650 для ингибирования связывания ¹²⁵I-rhTNFα с рецепторами TNF р55 и р75 с помощью D2E7 вычисляют как 1,47×10^-9 и 1,26×10^-9 M соответственно. Снижение величин IC₅₀ в твердой фазе, возможно, обусловлено высокой плотностью рецепторов в форме RIA, поскольку немеченый rhTNFα также ингибируется с близкими значениями IC₅₀. Значения IC₅₀ для ингибирования связывания ¹²⁵I-rhTNFα c рецепторами р55 и р75 немеченым rhTNFα составляют 2,31×10^-9 и 2,70×10^-9 М соответственно.

С. Ингибирование экспрессии ELAM-1 на HUVEC

Можно индуцировать экспрессию человеческими эндотелиальными клетками пупочной вены (HUVEC) молекулы адгезии 1 эндотелиальных лейкоцитов (ELAM-1) на поверхности клетки обработкой rhTNFα, что может быть определено реакцией rhTNFα-обработанных HUVEC с мышиным антителом против ELAM-1 человека. Способность человеческих антител против hTNFα ингибиpoвать даннyю TNFGr-индyциpoваннyю экспрессию ELAM-1 на HUVEC исследуют следующим образом: HUVEC (АТСС NO CRL 1730) помещают в 96-луночные планшеты (5×10⁴ клеток/лунку) и инкубируют в течение ночи при 37°С. На следующий день готовят серийные разведения человеческого антитела против hTNFα(1:10) в микролитровой чашке, начиная с 20-100 мкг/мл антитела. Маточный раствор rhTNFα готовят с концентрацией 4,5 нг/мл, аликвоты rhTNFα добавляют в каждую содержащую антитело лунку и хорошо перемешивают содержимое. Контрольные опыты включают только среду, среду плюс антитело против hTNFα и среду плюс rhTNFα. Прекращают инкубирование планшетов с HUVEC при 37°С и среду осторожно удаляют отсасыванием из каждой лунки. Двести микролитров смеси антитело-rhTNFα переносят в каждую лунку планшетов с HUVEC. Затем планшеты с HUVEC далее инкубируют при 37°С в течение 4 часов. Потом маточный раствор мышиного антитела против ELAM-1 разводят в соотношении 1:1000 в RPMI.

Среду из каждой лунки планшета с HUVEC осторожно отсасывают, добавляют 50 мкл на лунку раствора антитела против ELAM-1 и планшеты с HUVEC инкубируют 60 минут при комнатной температуре. Раствор ¹²⁵I-меченого антитела Ig против мыши готовят в RPMI (приблизительно 50000 импульсов/мин в 50 мкл). Среду из каждой лунки планшетов с HUVEC осторожно удаляют отсасыванием, лунки дважды промывают RPMI и в каждую лунку добавляют 50 мкл раствора ¹²⁵I-меченого Ig против мыши. Планшеты инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре, а затем каждую лунку три раза промывают RPMI. Сто восемьдесят микролитров 5% SDS (додецилсульфата натрия) добавляют в каждую лунку для лизирования клеток. Клеточный лизат из каждой лунки затем переносят в пробирку и подсчитывают в сцинтилляторе.

Полученные результаты представлены на Фигуре 7. Значение IC₅₀ для ингибирования с помощью D2E7 hTNFα-индуцированной экспрессии ELAM-1 на HUVEC составляет в данных экспериментах приблизительно 6×10^-11 М. Данные результаты демонстрируют, что человеческое антитело против DTNFα D2E7 ингибирует hTNFα-индуцированную экспрессию ELAM-1 на HUVEC в концентрациях, приблизительно равных концентрациям мышиного mAb МАК 195 против hTNFα.

В другой серии экспериментов исследуют способность формы lgG1 D2E7 ингибировать hTNFα-индуцированную экспрессию ELAM-1 на HUVEC, как описано выше. Результаты трех независимых экспериментов и среднее значение из них представлены ниже в Таблице 11:

Таблица 11 Ингибирование TNFα-индуцированной экспрессии ELAM-1 рецептором lgG1 D2E7
Эксперимент	IC50 [M]
1	1,95×10-10
2	1,69×10-10
3	1,90×10-10
Среднее	1,85±0,14×10-10

Данная серия экспериментов подтверждает, что D2E7 в форме lgG1 полной длины ингибирует TNFα-индуцированную экспрессию ELAM-1 на HUVEC со средней IC₅₀ [M] 1,85±0,14×10^-10.

Нейтрализующую активность lgG1 D2E7 исследуют также в отношении rhTNFα-индуцированной экспрессии двух других молекул адгезии IСАМ-1 и VCAM-1. Поскольку кривая титрования rtTNFα для экспрессии IСАМ-1 через 16 часов очень близка к кривой экспрессии ELAM-1, используют такую же концентрацию rhTNFα в экспериментах по нейтрализации с помощью антител. HUVEC инкубируют с rhTNFα в присутствии различных концентраций D2E7 при 37°С в инкубаторе с СО₂ в течение 16 часов и измеряют экспрессию 1САМ-1 с помощью мышиного антитела против 1САМ-1 и затем ¹²⁵I-меченого овечьего антитела против мыши. Проводят два независимых эксперимента и вычисляют значения IC₅₀. Неродственное человеческое антитело lgG1 не ингибирует экспрессию IСАМ-1.

Экспериментальный способ тестирования ингибирования экспрессии VCAM-1 является таким же, как способ экспрессии ELAM-1 за исключением того, что вместо Mab против ELAM-1 используют Mab против VCAM-1. Проводят три независимых эксперимента и вычисляют значения IC₅₀. Неродственное человеческое антитело lgG1 не ингибирует экспрессию VCAM-1.

Результаты суммируют ниже в Таблице 12:

Таблица 12 Ингибирование экспрессии IСАМ-1 и VCAM-1 посредством lgG1 D2E7
Ингибирование IСАМ-1	IC50 [M]
Эксперимент	IC50 [M]	Эксперимент	IC50 [M]
1	1,84×10-10	1	1,03×10-10
2	2,49×10-10	2	9,26×10-11
		3	1,06×10-10
Среднее	2,17±0,46×10-10	Среднее	1,01±0,01×10-10

Данные эксперименты демонстрируют, что обработка первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека rhTNFα приводит к оптимальной экспрессии молекул адгезии: ELAM-1 и VCAM-1 через 4 часа и к максимуму регулируемой экспрессии 1САМ-1 через 16 час. D2E7 способно ингибировать экспрессию трех молекул адгезии доза-зависимым образом. Величины IC₅₀. Для ингибирования ELAM-1, ICAM-1 и VСАМ-1 составляют 1,85×10^-10, 2,17×10^-10 и 1,01×10^-10 M соответственно. Данные значения очень близки, что указывает на близкие требования к дозе сигнала активации rhTNFα, необходимой для индукции экспрессии ELAM-1, ICAM -1 и VCAM-1. Интересно, что D2E7 имеет близкую эффективность при анализе более продолжительного ингибирования экспрессии ICAM-1. Анализ ингибирования VСАМ-1 требует 16-часового совместного инкубирования rhTNFα и D2E7 с HUVEC в противоположность 4 часам, требующимся для анализов ингибирования ELAM-1 и VCAM-1. Поскольку D2E7 имеет низкую скорость распада в отношении rhTNFα, то понятно, что во время 16-часового периода совместного инкубирования не происходит значительной конкуренции за рецепторы TNF на HUVEC.

D. Нейтрализация rhTNFα in vivo

Три различные системы in vivo используют для демонстрации того, что D2E7 является эффективным при ингибировании активности rhTNFα in vivo.

I. Ингибирование TNF-индуцированной гибели у D-галактозамин-сенсибилизированных мышей

Инъекция рекомбинантного человеческого TNFα (rhTNFα) D-галактозамин-сенсибилизированным мышам вызывает гибель в течение 24-часового периода времени. TNFα-нейтрализующие агенты, как показывают, предотвращают гибель на этой модели. Для исследования способности человеческих антител против hTNFα нейтрализовать rhTNFα in vivo на этой модели мышам С57В1/6 внутрибрюшинно (i.p.) инъецируют различные концентрации D2T7-lgG1 или контрольного белка в PBS. Через 30 минут мышам вводят 1 мкг rhTNFα и 20 мг D-галактозамина в PBS i.p. и проводят наблюдения через 24 часа. Данное количество rhTNFα и D-галактозамина, как ранее устанавливают, вызывает 80-90% летальность у этих мышей. Полученные результаты, представленные как график в виде столбиков выживаемости в % по отношению к концентрации антител показаны на Фигуре 8. Черные столбики означают D2E7, тогда как заштрихованные столбики означают МАК 196. Инъекция 2,5-25 мкг антитела D2E7 каждой мыши защищает животных от TNFα-индуцированной гибели. Значение ED₅₀ составляет приблизительно 1-2,5 мкг на мышь. Антитела положительного контроля МАК 195 близки по своей защищающей способности. Инъекция D2E7 в отсутствие rhTNFα не вызывает никакого вредного эффекта на мышей. Инъекция неспецифического человеческого антитела lgG1 не дает никакой защиты от TNFα-индуцированной гибели.

Во втором эксперименте сорок девять мышей делят на 7 равных групп. Каждая группа получает различные дозы D2E7 за тридцать минут до получения дозы LD₈₀ смеси rhTNFα/D-галактозамин (10 мкг rhTNFα и 20 мг D-галактозамина на мышь). Контрольная группа 7 получает нормальное человеческое каппа-антитело lgG1 в дозе 25 мкг на мышь. Мышей исследуют через 24 часа. Выживаемость для каждой группы представлена ниже в Таблице 13.

Таблица 13 Выживаемость через 24 час после обработки D2E7
Группа	Выживаемость (живые/общее кол-во)	Выживаемость, %
1 (без антител)	0/7	0
2 (1 мкг)	1/7	14
3 (2,6 мкг)	5/7	71
4 (5,2 мкг)	6/7	86
5 (26 мкг)	6/7	86
6 (26 мкг; без rhTNF)	7/7	100
7 (25 мкг Ни lgG1)	1/7	14

II. Ингибирование TNF-индуцированной гипертермии у кроликов

Исследуют эффективность D2E7 в ингибировании rhTNFα-индуцированной гипертермии (лихорадки) у кроликов. Группам из трех самок кроликов NZW с массой приблизительно 2,5 кг каждая внутривенно инъецируют D2E7, rhTNFα и иммунные комплексы D2E7 и rhTNFα. Ректальную температуру измеряют температурными зондами на термографе Кауе каждую минуту в течение приблизительно 4 часов. Рекомбинантный человеческий TNF в солевом растворе, инъецированный в дозе 5 мкг/кг, вызывает повышение температуры более чем на 0,4°С приблизительно через 45 минут после инъекции. Сам препарат антител в солевом растворе в дозе 138 мкг/кг не вызывает повышение температуры у кроликов даже через 140 минут после введения. Во всех дальнейших экспериментах D2E7 или контрольные реагенты (человеческий IgGq или солевой раствор-носитель) инъецируют кроликам внутривенно через 15 минут после внутривенной инъекции rhTNFα в солевом растворе в дозе 5 мкг/кг. Репрезентативные результаты некоторых экспериментов представлены ниже в Таблице 14:

Таблица 14 Ингибирование rhTNFα-индуцированной гипертермии у кроликов
с помощью D2E7
	Повышение температуры*, °С		Молярное соотношение	Пик температуры
Доза D2E7 (мкг/кг)	rhTNF	rhTNF+ D2E7	% ингибирования**	D2E7: rhTNF	минуты после rhTNF
14	0,53	0,25	53	1	60
24	0,43	0,13	70	1,6	40
48	0,53	0,03	94	3,3	50
137	0,53	0,00	100	9,5	60
792	0,80	0,00	100	55	60

* - пик температуры

** - % ингибирования - (1-{повышение температуры при rhTNF & D2E7/повышение температуры при одном rhTNF})×100.

Внутривенное предварительное введение D2E7 в дозе 14 мкг/кг частично ингибирует пирогенную реакцию по сравнению с кроликами, которым предварительно вводят только солевой раствор. D2E7, введенный в дозе 137 мкг/кг, полностью супрессирует пирогенную реакцию rhTNFα в данном эксперименте. Во втором эксперименте D2E7, введенный в дозе 24 мкг/кг, также частично супрессирует пирогенную реакцию по сравнению с кроликами, которым предварительно вводят только солевой раствор. Молярное соотношение D2E7 к rhTNFα составляет в данном эксперименте 1/6:1. В третьем эксперименте D2E7, инъецируемый внутривенно в дозе 48 мкг/кг (молярное соотношение D2E7: rhTNFα=3.3:1), полностью супрессирует пирогенную реакцию по сравнению с кроликами, которым предварительно вводят человеческий lgG1 (контроль) в солевом растворе в дозе 30 мкг/кг. В последнем эксперименте у кроликов, которым предварительно вводят D2E7 (792 мкг/кг) при очень высоком молярном соотношении с rhTNFα (55:1), не появляется никакого повышения температуры в течение 4 часов наблюдения. Лечение кроликов иммунными комплексами, полученными из смеси D2E7 и rhTNFα, которую инкубируют при 37°С в течение 1 часа при молярном соотношении 55:1, без последующего введения rhTNFα также не приводит к какому-либо повышению температуры в данном эксперименте.

III. Профилактика полиартрита у трансгенных мышей Тg197

Эффект D2E7 на развитие заболевания исследуют на модели артрита на трансгенных мышах. Получают трансгенных мышей Тg197, которые экспрессируют человеческий TNF дикого типа (модифицированный в 3'-участке после кодирующей последовательности), и у данных трансгенных мышей развивается хронический полиартрит со 100% вероятностью в возрасте 4-7 недель (см. EMBO J. (1991) 10:4025-4031 для дальнейшего описания модели полиартрита на Тg197).

Трансгенных мышей идентифицируют с помощью ПЦР в возрасте трех дней. Потомство трансгенных мышей делят на шесть групп. Трансгенных мышей проверяют гибридизационным анализом типа слотблоттинг в возрасте 15 дней. Представляют следующие протоколы лечения для шести групп:

Группа 1 = без лечения; Группа 2 = солевой раствор (носитель); Группа 3 = D2E7, 1,5 мкг/г; Группа 4 = D2E7, 15 мкг/г; Группа 5 = D2E7, 30 мкг/г и Группа 6 = контроль изотипа lgG1, 30 мкг/г. Потомство с нетрансгенными мышами также включают в исследования в качестве контроля (Группа 7 - нетрансгенные, без лечения). Каждая группа получает три внутрибрюшинные инъекции в неделю в соответствии с назначенным лечением. Инъекции продолжают 10 недель. Каждую неделю регистрируют макроскопические изменения морфологии суставов для каждого животного. На 10 неделе всех животных умерщвляют и ткани мышей хранят в формалине. Проводят микроскопическое исследование ткани.

Массу животных в граммах определяют для каждой мыши в начале каждой недели. В это же время определяют размер сустава (в мм) как показателя остроты заболевания. Размер сустава определяют как среднее из трех измерений задней правой лодыжки с использованием микрометра. Показатели артрита регистрируют еженедельно следующим образом: 0 = отсутствие артрита (нормальный внешний вид и флексия); + = слабый артрит (деформация сустава); ++ = средний артрит (распухание, деформация сустава) и +++ = тяжелый артрит (анкилоз, определяемый по флексии и сильно затрудненному движению). Гистопатологические показатели на базе окрашивания срезов суставов гемотоксилином/эозином обозначают следующим образом: 0 = отсутствие определяемого заболевания; 1 = пролиферация синовиальной оболочки; 2 = значительное синовиальное уплотнение; 3 = деструкция хряща и эрозия кости.

Эффект лечения с помощью D2E7 на средний размер сустава трансгенных мышей с артритом Тg197 представлен на графике Фигуры 11. Гистопатологические показатели и показатели артрита трансгенных мышей Tg197 в возрасте 11 недель суммированы ниже в Таблице 15:

Таблица 15 Эффект D2E7 на гистопатологию и показатель артрита у мышей Tg197
Группа	Лечение	Гистопатологический показатель	Показатель артрита
1	без лечения	3 (7/7)	+++ (7/7)
2	солевой раствор	3 (8/8)	+++ (8/8)
6	контроль IgG1	3 (9/9)	+++ (7/9)
3	D2E7, 1,5 мкг/г	0 (6/8)	0 (8/8)
4	D2E7, 15 мкг/г	0 (7/8)	0 (8/8)
5	D2E7, 30 мкг/г	0 (8/8)	0 (8/8)

Данный эксперимент демонстрирует, что антитело D2E7 имеет определенный благоприятный эффект в отношении трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий TNF (Тg197) дикого типа, выражающийся в отсутствии артрита после периода лечения.

Е. Нейтрализация rhTNFα других видов животных с помощью D2E7

Специфичность связывания D2E7 исследуют посредством определения их способности нейтрализовать факторы некроза опухоли других видов приматов и мыши, используя анализ цитотоксичности L929 (как описано выше в Примере 4, подраздел А). Результаты представлены ниже в Таблице 16:

Таблица 16 Способность D2E7 к нейтрализации TNF различных видов в анализе с L929
TNFα*	Источник	IC50 для нейтрализации D2E7 (М)**
Человек	Рекомбинантный	7,8×10-11
Шимпанзе	LPS-стимулированный РВМС	5,5×10-11
Павиан	Рекомбинантный	6,0×10-11
Игрунка	LPS-стимулированный РВМС	4,0×10-10
Циномолгус	LPS-стимулированный РВМС	8,0×10-11
Резус	LPS-стимулированный РВМС	3,0×10-11
Собака	LPS-стимулированный WBC	2,2×10-10
Свинья	Рекомбинантный	1,0×10-7
Мышь	Рекомбинантный	>1,0×10-7

Результаты в Таблице 16 показывают, что D2E7 может нейтрализовать активность ТМFα пяти приматов, приблизительно эквивалентно человеческому TNFα и, более того, может нейтрализовать активность собачьего TNFα (приблизительно в 10 раз слабее чем человеческого TNFα), а свиного и мышиного TNFα (приблизительно в -1000 раз слабее чем человеческого TNFα). Более того, связывание D2E7 с растворимой фазой rhTNFα не ингибируется другими цитокинами, такими как лимфокин (TNFβ), IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFNγ и TGFβ, указывая на то, что D2E7 является очень специфичным в отношении своего лиганда TNFα.

F. Отсутствие выхода цитокина в цельной крови человека, инкубируемой с D2E7

В данном примере исследуют способность D2E7 индуцировать секрецию цитокинов или выделять поверхностные клеточные молекулы у нормальных клеток крови человека. D2E7 инкубируют с разведенной цельной кровью от трех различных нормальных доноров в различных концентрациях в течение 24 час. LPS-положительны и контроль проводят в это же время с использованием предварительно определенных концентраций, стимулирующих секрецию цитокинов у иммунокомпетентных клеток крови. Супернатанты собирают и тестируют на панели наборов для ELISA из десяти растворимых цитокинов, рецепторов и молекул адгезии: IL-1α, IL-1β, антагонист рецептора IL-1, IL-6, IL-8, TNFβ, растворимый рецептор I TNF, растворимый рецептор II TNF, растворимый IСАМ-1 и растворимый Е-селектин. В результате совместного инкубирования антитела D2E7 при концентрациях до 343 мкг/мл не было определено каких-либо значительных количеств цитокинов или выделяемых поверхностных клеточных молекул. Контрольные культуры без добавления антитела также не образуют цитокины в определяемых количествах, тогда как контроль с совместной культурой LPS дает повышенные значения в интервале от многих пикограмм до нескольких нанограмм. Данные результаты указывают, что D2E7 не индуцирует секрецию цитокинов или выделение поверхностных клеточных белков сверх нормальных уровней в культурах ex vivo.

Составной частью данного описания является прилагаемый Список Последовательностей, содержание которого представлено в таблице ниже:

SEQ ID No:	Цепь антитела	Участок	Тип последовательности
1	D2E7	VL	аминокислота
2	D2E7	VH	аминокислота
3	D2E7	VL CDR3	аминокислота
4	D2E7	VH CDR3	аминокислота
5	D2E7	VL CDR2	аминокислота
6	D2E7	VH CDR2	аминокислота
7	D2E7	VL CDR1	аминокислота
8	D2E7	VH CDR1	аминокислота
9	2SD4	VL	аминокислота
10	2SD4	VH	аминокислота
11	2SD4	VL CDR3	аминокислота

SEQ ID No:	Цепь антитела	Участок	Тип последовательности
12	ЕРВ12	VL CDR3	аминокислота
13	VL10E4	VL CDR3	аминокислота
14	VL100A9	VL CDR3	аминокислота
15	VLL100D2	VL CDR3	аминокислота
16	VLLOF4	VL CDR3	аминокислота
17	LOE5	VL CDR3	аминокислота
18	VLLOG7	VL CDR3	аминокислота
19	VLLOG9	VL CDR3	аминокислота
20	VLLOH1	VL CDR3	аминокислота
21	VLLOH10	VL CDR3	аминокислота
22	VL1B7	VL CDR3	аминокислота
23	VL1C1	VL CDR3	аминокислота
24	VL0.1F4	VL CDR3	аминокислота
25	VL0.1H8	VL CDR3	аминокислота
26	LOE7.A	VL CDR3	аминокислота
27	2SD4	VH CDR3	аминокислота
28	VH1B11	VH CDR3	аминокислота
29	VH1D8	VH CDR3	аминокислота
30	VH1A11	VH CDR3	аминокислота
31	VH1B12	VH CDR3	аминокислота

SEQ ID No:	Цепь антитела	Участок	Тип последовательности
32	VH1E4	VH CDR3	аминокислота
33	VH1F6	VH CDR3	аминокислота
34	ЗС-Н2	VH CDR3	аминокислота
35	VH1-D2.N	VH CDR3	аминокислота
36	D2E7	VL	нуклеиновая кислота
37	D2E7	VH	нуклеиновая кислота

Эквивалентные решения

Специалисты признают или смогут убедиться, используя не более чем рутинные исследования, что существует множество решений, эквивалентных специфическим вариантам осуществления, описанным здесь. Предусматривается, что такие эквивалентные решения охватываются следующими пунктами формулы изобретения.

1. Выделенное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент, обладающее активностью против hTNFα при следующих характеристиках:
a) диссоциирует из человеческого TNFα с константой скорости K_off 1×10^-3 с^-11 или менее, что определено с помощью поверхностного плазменного резонанса;
b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную заменой одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;
c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную заменой одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

2. Выделенное антитело человека по п.1, отличающееся тем, что диссоциирует из человеческого TNFα с константой скорости K_off 5×10^-4 с^-1 или менее.

3. Выделенное антитело человека по п.1, отличающееся тем, что диссоциирует из человеческого TNFα с константой скорости K_off 1×10^-4 с^-1 77 или менее.

4. Выделенное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент, обладающее активностью против hTNFα, имеющее вариабельный участок легкой цепи (LCVR), имеющий домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную заменой одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 и с вариабельным участком тяжелой цепи (HCVR), имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную заменой одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

5. Выделенное антитело человека по п.4, отличающееся тем, что LCVR далее имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, и HCVR далее имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 6.

6. Выделенное антитело человека по п.5, отличающееся тем, что LCVR далее имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 7, и HCVR далее имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 8.

7. Выделенное антитело человека по пп.1-6, отличающееся тем, что имеет константный участок тяжелой цепи IgG1.

8. Выделенное антитело человека по пп.1-6, отличающееся тем, что имеет константный участок тяжелой цепи lgG4.

9. Выделенное антитело человека по пп.1-6, отличающееся тем, что представляет собой фрагмент Fab.

10. Выделенное антитело человека по пп.1-6, отличающееся тем, что представляет собой фрагмент Fv из одной цепи.

11. Выделенное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент, обладающее активностью против hTNFα, имеющее вариабельный участок легкой цепи (LCVR), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No1, вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No2, и константный участок тяжелой цепи IgG1 или константный участок тяжелой цепи lgG4.

12. Выделенное антитело человека по п.11, отличающееся тем, что представляет собой фрагмент Fab.

13. Выделенное антитело человека по п.11, отличающееся тем, что представляет собой фрагмент Fv из одной цепи.

14. Выделенное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент, обладающее активностью против hTNFα, имеющее вариабельный участок легкой цепи (LCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 3, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26 или вариабельный участок тяжелой цепи HCVR с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 4, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ ID No 33 и SEQ ID No 34.

15. Рекомбинантное антитело человека или его антиген-связывающий фрагмент, обладающее активностью против hTNFα, которое нейтрализует активность человеческого TNFα, но не человеческого TNFα, идентифицирующееся признаками антитела или его антиген-связывающего фрагмента по п.1.

16. Рекомбинантное антитело человека по п.15, отличающееся тем, что нейтрализует также активность TNFcy шимпанзе и по меньшей мере одного дополнительного TNFα примата, выбранного из группы, состоящей из TNFα павиана, TNFαr игрунки, TNFα циномолгуса и TNFα резуса.

17. Рекомбинантное антитело человека по п.15, отличающееся тем, что нейтрализует также активность TNFα собаки.

18. Рекомбинантное антитело человека по п.15, отличающееся тем, что нейтрализует также активность TNFα свиньи.

19. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-18 в качестве средства способа лечения заболеваний, опосредованных hTNFα, выбранных из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, заболеваний, связанных с отторжением трансплантанта, злокачественных новообразований, легочных нарушений, кишечных нарушений или сердечных нарушений.

20. Применение по п.19, отличающееся тем, что аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ревматоидного спондилита, остеоартрита и подагрического артрита, аллергии, рассеянного склероза, аутоиммунного диабета, аутоиммунного увеита и почечного синдрома.

21. Применение по п.19, отличающееся тем, что инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из малерии, менингита, вторичной после инфекции кахексии, СПИДа, бактериального менингита и СПИД-ассоциированного комплекса.

22. Применение по п.19, отличающееся тем, что заболевание, связанное с отторжением трансплантанта, выбрано из группы, состоящей из отторжения аллотрансплантата или болезни трансплант против хозяина.

23. Применение по п.19, отличающееся тем, что легочное заболевание выбрано из группы, состоящей из респираторного дистресс-синдрома взрослых, легочного шока, хронического легочного воспалительного заболевания, легочного саркоидоза, легочного фиброза и силикоза.

24. Применение по п.19, отличающееся тем, что кишечное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспалительного кишечного нарушения, идиопатического воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона и язвенного колита.

25. Применение по п.19, отличающееся тем, что сердечное заболевание выбрано из группы, состоящей из ишемии сердца или сердечной недостаточности.

26. Применение по п.19, отличающееся тем, что нарушение, связанное со злокачественным новообразованием, выбрано из группы, соcтоящей из стимуляции роста опухоли, усиления метастатического потенциала и появления цитотоксичности при злокачественных новообразованиях, а также для ингибирования роста опухоли или метастазов.

27. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-18 в качестве средства способа лечения заболевания, опосредованного hTNFα, представляющее собой сепсис.

28. Применение по п.27, отличающееся тем, что антитело вводят человеку вместе с антагонистом цитокинов интерлейкином-6 (IL-6) или вводят человеку, у которого концентрация IL-6 в сыворотке или плазме превышает 500 пг/мл.

29. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-18 в качестве средства способа лечения нарушения, опосредованного hTNFα, выбранного из группы, состоящей из воспалительных костных заболеваний, заболеваний, связанный с резорбцией кости, алкогольного гепатита, вирусного гепатита, нарушений свертывания крови, ожогов, реперфузионных повреждений, образованием келоида, формирования рубцовой ткани, лихорадки, септического шока, эндотоксического шока, грамоотрицательного сепсиса, токсического шокового синдрома, цитомегаловирусной инфекции, вторичной от трансплантации, нарушений, сопровождающихся высокой температурой и болью в мышцах в результате инфекции, вторичная кахексия из-за инфекции, гепатит.

30. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-18 в качестве средства лечения заболевания, опосредованного hTNFα, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

31. Применение антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-18 в качестве средства способа лечения заболевания, опосредованного hTNFα, совместно с дополнительным терапевтическим агентом.

32. Применение по п.31, отличающееся тем, что дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из нестероидных противовоспалительных лекарственных веществ, цитокин-супрессирующих противовоспалительных лекарственных веществ, CDP-571/BAY-10-3356, сА2, TNFR-IgG мол. массы 75 кД, TNFR-IgG мол. массы 55 кД, IDEC-CE9.1/SB 210396, DAB 486-IL-2, DAB 389-IL-2, Anti-Тас, IL-4, IL-10, агонистов IL-4, агонистов IL-10, IL-1RA, TNF-bp/s-TNFR, S284, R973401, MK-966, илопроста, метотрексата; талидомида, близких талидомиду лекарственных веществ, лефлуномида, транексамовой кислоты, Т-614, простагланидина Е1, тенидапа, напроксена, мелоксикама, пироксикама, диклофенака, индометацина, сульфасалазина, азатиоприна, ингибиторов ICE, ингибиторов zap-70, ингибиторов Ick, ингибиторов VEGF, ингибиторов VEGF-R, кортикостероидов, ингибиторов TNF-конвертазы, антител против IL-12, интерлейкина-11, интерлейкина-13, ингибиторов интерлейкина-17, золота, пеницилламина, хлорохина, гидроксихлорохина, хлорамбуцила, циклофосфамида, циклоспорина, глобулина против тимоцитов, антител против CD4, токсинов CD5, пептидов для перорального применения, коллагена, динатрия лобензарит, цитокин-регулирующих агентов НР228 и НР466, антисмысловых фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов 1САМ-1, растворимого рецептора комплемента 1, преднизона, орготеина, гликозаминогликана полисульфата, миноциклина, антител против IL2R, морских липидов, растительных липидов, ауранофина, фенилбутазона, меклофенамовой кислоты, флуфенамовой кислоты, иммунного глобулина для внутривенного введения, зилеутона, микофеноловой кислоты, такролимуса, сиролимуса, амиприлозы, кладрибина, азарибина, буденозида, эпидермального ростового фактора, аминосалицилатов, 6-меркаптопурина, метронидазола, ингибиторов липоксигеназы, месаламина, олсалазина, балсалазида, антиоксидантов, ингибиторов тромбоксана, антагонистов рецептора IL-1, моноклональных антител против IL-1β, моноклональных антител против IL-6, ростовых факторов, ингибиторов эластазы, соединений пиридинил-имидазола, глюкуронид-конъюгированных пролекарственных форм преднизолона, дексаметазона или будезонида, декстран-конъюгированных пролекарственных форм преднизолона, растворимого рецептора комплемента 1, месалазина с медленным выходом, антагонистов фактора активации тромбоцитов (PAF), ципрофлоксацина, лигнокаина, преднизолона, метилпреднизолона, циклофосфамида, 4-аминопиридина, тизанидина, интерферона-β1a, интерферона-β1b, сополимера 1, гипербарического кислорода, иммуноглобулина для внутривенного введения, клабрибина, гипертонических солевых растворов, антибиотиков, непрерывной гемофильтрации, карбапенемов, антагонистов цитокинов, таких как TNFα, IL-1β, IL-6 и/или IL-8, SKE&F 107647, четырехвалентного гуанилгидразона CNI-1493, ингибитора пути биосинтеза тканевого фактора, РНР, хелаторов и хелатов железа, включая комплекс диэтилентриаминпентауксусная кислота - железо (III), лизофиллина, PGG-глюкана, аполипопротеина А-1, реконструированного липидами, хиральных гидроксамовых кислот, антител против эндотоксина, Е5531, rBPIgi, синтетических пептидов против эндотоксина, терапии замещением поверхностно-активных веществ и антител против IL-8.

33. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, опосредованных hTNFα, содержащая антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-16 и фармацевтически приемлемый носитель.

34. Фармацевтическая композиция по п.33, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент.

35. Фармацевтическая композиция по п.34, отличающаяся тем, что дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из нестероидных противовоспалительных лекарственных веществ, цитокин-супрессирующих противовоспалительных лекарственных веществ, CDP-571 /BAY-10-3356, cA2, TNFR-IgG мол. массы 75 кД, TNFR-IgG мол. массы 55-кД, IDEC-CE9.1/SB210396, DAB486-IL-2, DAB389-IL-2, Anti-Tac, IL-4, IL-10, агонистов IL-4, агонистов IL-10, IL-1RA, TNF-bp/s-TNFR, S284, R973401, МК-966, илопроста, метотрексата; талидомида, близких талидомиду лекарственных веществ, лефлуномида, транексамовой кислоты, Т-614, простагланидина Е1, тенидапа, напроксена, мелоксикама, пироксикама, диклофенака, индометацина, сульфасалазина, азатиоприна, ингибиторов ICE, ингибиторов zар-70, ингибиторов Ick, ингибиторов VEGF, ингибиторов VEGF-R, кортикостероидов, ингибиторов TNF-конвертазы, антител против IL-12, интерлейкина-11, интерлейкина-13, ингибиторов интерлейкина-17, золота, пеницилламина, хлорохина, гидроксихлорохина, хлорамбуцила, циклофосфамида, циклоспорина, глобулина против тимоцитов, антител против CD4, токсинов CD5, пептидов для перорального применения, коллагена, динатрия лобензарит, цитокин-регулирующих агентов НР228 и НР466, антисмысловых фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов 1САМ-1, растворимого рецептора комплемента 1, преднизона, орготеина, гликозаминогликана полисульфата, миноциклина, антител против IL2R, морских липидов, растительных липидов, ауранофина, фенилбутазона, меклофенамовой кислоты, флуфенамовой кислоты, иммунного глобулина для внутривенного введения, зилеутона, микофеноловой кислоты, такролимуса, сиролимуса, амиприлозы, кладрибина, азарибина, буденозида, эпидермального ростового фактора, аминосалицилатов, 6-меркаптопурина, метронидазола, ингибиторов липоксигеназы, месаламина, олсалазина, балсалазида, антиоксидантов, ингибиторов тромбоксана, антагонистов рецептора IL-1, моноклональных антител против IL-1^, моноклональных антител против IL-6, ростовых факторов, ингибиторов эластазы, соединений пиридинил-имидазола, глюкуронид-конъюгированных пролекарственных форм преднизолона, дексаметазона или будезонида, декстран-конъюгированных пролекарственных форм преднизолона, растворимого рецептора комплемента 1, месалазина с медленным выходом, антагонистов фактора активации тромбоцитов (PAF), ципрофлоксацина, лигнокаина, преднизолона, метилпреднизолона, циклофосфамида, 4-аминопиридина, тизанидина, интерферона-β1a, интерферона-β1b, сополимера 1, гипербарического кислорода, иммуноглобулина для внутривенного введения, клабрибина, гипертонических солевых растворов, антибиотиков, непрерывной гемофильтрации, карбапенемов, антагонистов цитокинов, таких как TNFα, IL-1β, IL-6 и/или IL-8, SK&F 107647, четырехвалентного гуанилгидразона CNI-1493, ингибитора пути биосинтеза тканевого фактора, РНР, хелаторов и хелатов железа, включая комплекс диэтилентриаминпентауксусная кислота - железо (III), лизофиллина, PGG-глюкана, аполипопротеина А-1, реконструированного липидами, хиральных гидроксамовых кислот, антител против эндотоксина, Е5531, rBPI^ синтетических пептидов против эндотоксина, терапии замещением поверхностно-активных веществ и антител против IL-8.

36. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая домен CDR3 легкой цепи антитела, специфичный к hTNFα и содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную заменой одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9.

37. Выделенная нуклеиновая кислота по п.36, отличающаяся тем, что кодирует вариабельный участок легкой цепи антитела (LCVR).

38. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что домен CDR2 LCVR антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 5.

39. Выделенная нуклеиновая кислота по п.38, отличающаяся тем, что домен CDR1 LCVR антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 7.

40. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая домен CDR3 тяжелой цепи антитела, специфичный к hTNFα. и содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную заменой одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

41. Выделенная нуклеиновая кислота по п.40, отличающаяся тем, что кодирует вариабельный участок тяжелой цепи антитела (HCVR).

42. Выделенная нуклеиновая кислота по п.41, отличающаяся тем, что домен CDR2 HCVR антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 6.

43. Выделенная нуклеиновая кислота по п.42, отличающаяся тем, что домен CDR1 HCVR антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 8.

44. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая домен CDR3 антитела против hTNFα, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ, ID No 33 и SEQ ID No 34.

45. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный участок легкой цепи антитела против hTNFα, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No 1.

46. Выделенная нуклеиновая кислота по п.45, отличающаяся тем, что она кодирует вариабельный участок легкой цепи антитела и константный участок легкой цепи антитела.

47. Выделенная нуклеиновая кислота по п.46, отличающаяся тем, что она включена в рекомбинантный экспрессионный вектор.

48. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный участок тяжелой цепи антитела против hTNFα, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No 2.

49. Выделенная нуклеиновая кислота по п.48, отличающаяся тем, что она кодирует вариабельный участок тяжелой цепи антитела и константный участок тяжелой цепи антитела.

50. Выделенная нуклеиновая кислота по п.49, отличающаяся тем, что константный участок тяжелой цепи антитела представляет собой константный участок IgG1.

51. Выделенная нуклеиновая кислота по п.49, отличающаяся тем, что константный участок тяжелой цепи антитела представляет собой константный участок lgG4.

52. Выделенная нуклеиновая кислота по п.49, отличающаяся тем, что она включена в рекомбинантный экспрессионный вектор.