Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, модифицированных геном фактора роста нервов человека



Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, модифицированных геном фактора роста нервов человека
Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, модифицированных геном фактора роста нервов человека
Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, модифицированных геном фактора роста нервов человека
Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, модифицированных геном фактора роста нервов человека

 


Владельцы патента RU 2458984:

Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (RU)
Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, исключая человеческие, модифицированных геном фактора роста нервов человека, включающий культивирование эмбриональных стволовых клеток в среде аМЕМ с добавками, посев клеток на чашку, трансфекцию эмбриональных стволовых клеток векторами pMT-NGF и pcNGF и последующий отбор стабильных трансфектантов на селективной среде. Изобретение позволяет получать генетически-модифицированные эмбриональные стволовые клетки млекопитающих, продуцирующие в среду фактор роста нервов человека, что позволит использовать их для создания модели нейрональной дифференцировки клеток in vitro, а также использовать эти клетки для трансплантации в мозг экспериментальных животных и скрининга соединений на наличие нейропротекторной активности. 4 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение позволяет получать генетически-модифицированные эмбриональные стволовые клетки млекопитающих, продуцирующие в среду фактор роста нервов человека, что позволит использовать их для создания модели нейрональной дифференцировки клеток in vitro, а также использовать эти клетки для трансплантации в мозг экспериментальных животных и использовать такие клетки для скрининга соединений на наличие нейропротекторной активности.

Клеточная терапия - трансплантация клеток, замещающих утраченные клетки реципиента или обеспечивающих трофическую поддержку для клеток реципиента. Этот подход представляется перспективным для лечения нейродегенеративных расстройств - болезни Паркинсона [Dass, Kordower 2006], рассеянного склероза [Henriques, Schneider 2010], последствий инсульта и травм спинного мозга [Wyman, Machida 1999]. Ограничениями в этом подходе являются доступность здоровой ткани, наличие технологии получения из нее материала, пригодного для трансплантации, и иммунологическая совместимость.

Получение пригодного для трансплантации клеточного материала от взрослых доноров в случае нервной ткани невозможно. Использование эмбрионального материала представляет этические и иммунологические трудности. Альтернативным источником любых клеток нервной ткани являются эмбриональные стволовые (ЭС) клетки.

ЭС клетки - являются потенциальным источником любых типов клеток. Разработаны протоколы дифференцировки ЭС клеток в нейральные предшественники [Cai, Grabel 2007] и взрослые нейроны, по всем своим свойствам аналогичные получаемым из фетальной ткани.

Эти протоколы дифференцировки клеток основаны на добавлении в культуральную среду специфических рекомбинантных факторов роста и дифференцировки, использования совместного культивирования стволовых клеток с другими типами клеток, например, как это показано в Ann N Y Acad Sci. "Culture and genetic modification of mouse germline stem cells", Kanatsu-Shinohara M et al, 2007 Dec; 1120: 59-71. Выживаемость и миграция клеток, получаемых из ЭС клеток, и образование кровеносных сосудов в зоне трансплантации ограничены. Эти характеристики транспланта могут быть заметно улучшены за счет одновременного применения нейротрофических факторов в зоне трансплантации.

Нейротрофические факторы включают в себя несколько семейств: семейство нейротрофинов, белки семейства GDNF, семейство факторов роста фибробластов и ряд других. Нейротрофические факторы являются необходимыми для роста, дифференцировки и выживаемости специфических популяций нейронов центральной и периферической нервной системы. Нейротрофины, в свою очередь, представляют собой семейство полипептидных факторов, представителями которого являются: фактор роста нервов (ФРН), нейротрофический фактор мозга (НФМ или в английской транскрипции BDNF), нейротрофины (НТ) 3,4/5, 6,7. При повреждениях нервной системы и в нейротрансплантах показано усиление экспрессии рецепторов к нейротрофическим факторам. [Lee Itoyama 1998].

Наиболее изученным нейротрофическим фактором является фактор роста нервов (ФРН). Данный пептид экспрессируется в эмбриогенезе и регулирует иннервацию периферических органов. [Shelton Reichardt 1984]. ФРН индуцирует дифференцировку и выживаемость моторных и сенсорных нейронов, рост аксонов и сосудообразование в трансплантированных графтах (ФРН). [Calzà, Levi-Montalcini, 2001].

Таким образом, ЭС клетки являются удобным источником материала для нейротрансплантации, и нейротрофические факторы способны увеличить выживаемость и миграцию клеток транспланта, а также повысить способность пересаженных клеток образовывать синаптические контакты с клетками реципиента за счет увеличения роста дендритов. Изучение сочетания клеточной терапии и генной терапии применения нейротрофических факторов представляет на сегодняшний день значительный интерес. Для изучения потенциальных возможностей данного подхода к терапии нейродегенеративных расстройств была создана модель на основе ЭС клеток. С помощью методов генной инженерии были сконструированы плазмидные вектора, позволяющие экспрессировать рекомбинантный человеческий фактор роста нервов в ЭС клетки млекопитающих. Данными векторами были трансфицированы ЭС клетки мыши, и с помощью селективного маркера были отобраны линии клеток, имеющие стабильную геномную интеграцию гена ФРН человека hNGF.

Примеры.

Пример 1.

Конструкция векторов.

Для конститутивной и регулируемой экспрессии ФРН человека в ЭС клетках млекопитающих авторами были сконструированы плазмидные вектора pcNGF (рис.1) и pMT-NGF (рис.2).

pcNGF представляет собой плазмиду длиной 6154 п.о., несущую гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, и ген ФРН человека под регуляцией конститутивного цитомегаловирусного промотора Р CMV. Последовательность препропептида ФРН человека, кодируемая 3'-экзоном человеческого гена NGFB, была клонирована в плазмиду pUC19 из кДНК библиотеки, полученной из гиппокампа человека в институте Молекулярной Генетики РАН, сотрудниками лаборатории белковой инженерии.

Последовательность ФРН была амплифицирована с помощью ПЦР с использованием малоошибочной полимеразы pfu (из Pyrococcus Furiosus) и pUC19-hNGF в качестве матрицы. В реакции использовали праймеры, фланкированные сайтами рестрикции HindIII и BamHI. ПЦР ампликон был рестрицирован по вышеозначенным сайтам и лигирован в полилинкер вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen, США).

pMT-NGF представляет собой аналогичный вектор с генами неомициновой и ампициллиновой устойчивости, в котором промотор CMV заменен на мышиный промотор металлотионеина-I Р MT-I. Активность данного промотора регулируется ионами тяжелых металлов [Stuart GW, Palmiter RD, 1984]. Показано, что ионы двухвалентного цинка в концентрациях 150-300 мкМ способны вызывать высокий уровень экспрессии трансгенов под этим промотором в культурах клеток [Wyman, Machida 1999]. Плазмида pcDNA3.1(+) была рестрицирована по сайтам BglII и HindIII, при этом был удален фрагмент промотора Р CMV, и вместо него лигирована линкерная вставка BglII-EcoRI и последовательность 256 bp промотра Р МТ, вырезаная по сайтам EcoRI и HindIII из плазмиды pBS-MT1.

Пример 2.

Культура клеток и трансфекция.

Стволовые клетки культивировали в среде аМЕМ с добавками глутамина, пирувата натрия, заменимых аминокислот, нуклеозидов, витаминов, меркаптоэтанола и гентамицина и 15% фетальной сыворотки коровы. В среду также добавляли рекомбинантный фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), обеспечивающий сохранение клетками плюрипотентного фенотипа.

Плазмидами pMT-NGF и pcNGF были трансформированы компетентные клетки Е.Coli штамма XL-1, имеющего эндогенную устойчивость к тетрациклину, и трансформанты рассевали на жидкую среду Лурье-Бретони, содержащую ампициллин и тетрациклин. Плазмидная ДНК выделялась с помощью S.N.A.P. midiprep kit (США, invitrogen).

Описанными выше плазмидами pMT-NGF и pcNGF с помощью липосомального агента Metafectene (Biontex, Германия) были трансфицированы эмбриональные стволовые клетки мыши линии R1 клон 2, выделенный из линии R1 в нашей лаборатории.

Клетки высевали по 200 тысяч на 35 мм чашку, трансфекцию колоний ЭС клетки осуществляли через 24 часа после посева. Среду сливали до объема 1 мл и к клеткам добавляли прединкубированную смесь плазмидной ДНК и метафектена. На 35 мм чашку брали 7 мкг плазмидной ДНК, а соотношение ДНК-метафектен составило 1 к 2 (масса/объем). Стабильные трансфектанты отбирали на селективной среде с неомицином, 200 ед./мл.

Для изолирования индуцибельных клонов от линии pMT-NGF, проводилось клонирование. Для этого, клетки высевались на 96 луночные плашки, по 1-2 клетки на лунку в среду с добавкой LIF, и далее, клоны успешно формировавшие колонии, размножались на чашках, и рассевались параллельно - в присутствии, и в отсутствии индуктора. Индукция металлотионеинового промотора осуществлялась с помощью добавления в среду соли двухвалентного цинка, например ацетата, Zn(CH3COO)2 в концентрации 300 микромоль. Токсичность цинка в данной концентрации не проявлялось, что подтверждено данными подсчета клеток и МТТ-теста клетках исходной линии R1.

Пример 3.

ПЦР-анализ полученных линий ЭСК.

Из устойчивых линий ЭС клеток, трансфицированных pMT-NGF и pcNGF, выделялась геномная ДНК, и наличие интеграции трансгена в хромосомную ДНК определялось с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными первым и последним 24 основаниям последовательности человеческого ФРН. Определение вставки трансгена в геномной ДНК из трансфицированных клеток и клеток исходной линии, приведено на рисунке 3.

Для оценки экспрессии трансгена из полученных линий выделяли тотальную мРНК. Для удаления возможной примеси геномной ДНК препараты обрабатывали 1 час ДНКазой-I (Fermentas). кДНК получали с помощью обратной транскриптазы M-MLV и неспецифического гексапраймера. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР анализа. Условия ПЦР подбирались на кДНК из фибробластов легкого человека, экспрессирующих эндогенный ФРН. В качестве отрицательных контролей использовались образцы, с которыми проводились все те же операции, но при проведении обратной транскрипции не добавлялся фермент M-MLV. Определение экспрессии ФРН в клетках полученных трансгенных линиий и клетках исходной линии R1 приведено на рисунке 4. Представлены клоны с индуцибельной и конститутивной экспрессией.

Список цитированной литературы.

Promoter-activated expression of nerve growth factor for treatment of neurodegenerative diseases - Gene Therapy (1999) 6, 1648-1660 TC Wyman, CA Machida et al.

Gene transfer of trophic factors and stem cell grafting as treatments for Parkinson's disease - Neurology, (2006) 66: S89-S103 Dass B, Olanow CW, Kordower JH.

Neurotrophic growth factors for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis: where do we stand? - Front Neurosci. (2010); 4: 32 Henriques A, Schneider A, et al.

Nerve growth factor control of neuronal expression of angiogenetic and vasoactive factors - PNAS (2001) 98 (7): 4160-4165 Laura Calzà, Rita Levi-Montalcini, et al.

A 12-base-pair DNA motif that is repeated several times in metallothionein gene promoters confers metal regulation to a heterologous gene. PNAS (1984); 81 (23): 7318-22. Stuart GW, Palmiter RD et al.

Expression of the beta-nerve growth factor gene correlates with the density of sympathetic innervation in effector organs PNAS (1984); 81: 7951-55, Shelton DL Reichaedt LF.

Directing the Differentiation of Embryonic Stem Cells to Neural Stem Cells - Dev Dyn. (2007) 236 (12): 3255-66. Chunyu Cat and Laura Grabel.

Expression of Nerve Growth Factor and trkA After Transient Focal Cerebral Ischemia in Rats - Stroke. (1998); 29: 1687-1697 - Tsong-Hai Lee; Yasuto Itoyama et al.

Induction of Midbrain Dopaminergic Neurons from Primate Embryonic Stem Cells by Coculture with Sertoli Cells - Stem Cells (2006); 24: 1695-1706. F Yue, К Sasaki et al.

Способ получения эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, исключая человеческие, модифицированных геном фактора роста нервов человека, включающий культивирование эмбриональных стволовых клеток в среде аМЕМ с добавками глутамина, пирувата натрия, заменимых аминокислот, нуклеозидов, витаминов, меркаптоэтанола и гентамицина и 15% фетальной сыворотки коровы, рекомбинантного фактора ингибирующего лейкимию (LIF), посев клеток по 200 тысяч на 35 мм чашку, трансфекцию эмбриональных стволовых клеток векторами рМТ-NGF и pcNGF при помощи липосомального агента через 24 ч после посева, для чего среду сливают до объема 1 мл и к клеткам добавляют прединкубированную смесь 7 мкг плазмидной ДНК и метафектена, при этом соотношение ДНК-метафектен составляет 1:2 (мас./об.), и последующий отбор стабильных трансфектантов на селективной среде с неомицином, 200 ед./мл.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к исследованиям противоопухолевого действия препаратов in vitro, и может быть использовано в экспериментальной онкологии.

Изобретение относится к области биотехнологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам для регенерации кожи и слизистых оболочек, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к коллагеновой пленке и способу ее изготовления. .

Соединение, предназначенное для стимуляции пути передачи сигнала через il-15rбета/гамма, с целью индуцировать и/или стимулировать активацию и/или пролиферацию il-15rбета/гамма-положительных клеток, таких как nk-и/или t-клетки, нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, вектор экспрессии, клетка-хозяин, адъювант для иммунотерапевтической композиции, фармацевтическая композиция и лекарственное средство для лечения состояния или заболевания, при котором желательно повышение активности il-15, способ in vitro индукции и/или стимуляции пролиферации и/или активации il-15rбета/гамма-положительных клеток и способ получения in vitro активированных nk-и/или t-клеток // 2454463
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимуляторов пути передачи сигнала через IL-15Rбета/гамма, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения иммортализованной клетки человека, стабильно трансфицированной последовательностью нуклеиновой кислоты, стабильно трансфицированной иммортализованной клетке человека, полученной данным способом, способу рекомбинантной продукции целевого белка человека и применению вектора трансфекции.
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитостатической активностью против клеток колоректального рака

Изобретение относится к проведению теста на клеточный иммунный ответ в целях профилактики и лечения заболеваний, связанных с наличием определенных углеводных эпитопов, в частности положительному по углеводному эпитопу опухолей

Изобретение относится к проведению теста на клеточный иммунный ответ в целях профилактики и лечения заболеваний, связанных с наличием определенных углеводных эпитопов, в частности положительному по углеводному эпитопу опухолей

Изобретение относится к материалу на основе кремниевого золя, а также его применению для изготовления биологически рассасывающихся и биологически расщепляющихся силикагелевых материалов с улучшенными свойствами
Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической иммунологии

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к поддерживающим структурам, содержащим кристаллическую целлюлозу, для культивирования клеток, и может быть использовано в медицине

Изобретение относится к области микробиологии
Наверх