Сополимер, содержащий звенья n-винилпирролидона, 2-метил-5-винилпиридина и 4-винилпиридина
Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Предложен сополимер на основе N-винилпирролидона общей формулы (I):
где мономерное звено M1 представляет собой фрагмент 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено М2 - фрагмент 4-винилпиридина (ВП):
содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05-(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=15-250 кДа. Предложено также применение указанного сополимера в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1, агента против рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы, активатора фагоцитоза и адъюванта при изготовлении вакцины против гриппа. Технический результат - предложенный сополимер расширяет арсенал биологически активных соединений на основе сополимеров N-винилпирролидона и имеет более широкий спектр действия по сравнению с известными аналогами. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 14 пр.
Область техники
Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Более конкретно изобретение относится к сополимеру на основе N-винилпирролидона, представленному общей формулой (I):
где мономерное звено M1 представляет собой фрагмент 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено M2 - фрагмент 4-винилпиридина (ВП):
содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев M2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-250 кДа.
Указанные сополимеры обладают противоопухолевой, иммуномодулирующей, фагоцитной и адъювантной активностью.
Уровень техники
В авторском свидетельстве SU 1578143 (опубл. 15.07.1990) описан сополимер N-винилпирролидона и 5-изопропенил-тетразола с молекулярной массой, определенной методом светорассеяния, равной 85 кДа, в котором содержание 5-изо-пропенилтетразольных звеньев составляет 0,40-0,74 мольн. доли, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита B.
Указанный сополимер получают радикальной сополимеризацией 5-изопропенилтетразола и N-винилпирролидона в присутствии динитрила азоизомасляной кислоты в качестве инициатора сополимеризации с одновременной загрузкой всех компонентов реакционной смеси. В одном варианте радикальную сополимеризацию проводят в среде этанола, а целевой продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир. В другом варианте реакцию проводят в водной среде, необязательно, с добавлением водного раствора NaOH для повышения pH до 5,5, а целевой продукт выделяют фильтрованием или центрифугированием. В случае добавления щелочи стадии выделения продукта предшествует его осаждение в 0,1М раствор HCl. Наилучшей адъювантной активностью обладает сополимер, содержащий 0,74 мольн. доли 5-изопропенилтетразольных звеньев. В патенте RU 2000004 (опубл. 15.02.1993) раскрыты сополимеры N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой в диапазоне 29-40 кДа, содержащие 25-40 мольн.% 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев, обладающие иммуностимулирующим действием. В патенте RU 2015993 (опубл. 15.07.1994) указано, что эти сополимеры также проявляют противоопухолевое действие.
Указанные сополимеры получают радикальной сополимеризацией N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты в качестве инициатора сополимеризации, пероксида водорода и циклогексана в качестве регулятора молекулярной массы, а целевой продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир.
Наиболее близкий аналог настоящего изобретения раскрыт в патенте RU 2415876 (опубл. 10.04.2011), касающемся сополимера N-винилпирролидона, содержащего 25-90 мол.% мономерных звеньев 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой 46-250 кДа, который может применяться в качестве адъюванта при изготовлении вакцины против гриппа.
Описание изобретения
Целью данного изобретения является расширение арсенала биологически активных соединений на основе сополимеров N-винилпирролидона, которые могут найти применение в медицине. Авторы настоящего изобретения провели исследования и установили, что сополимеры на основе N-винилпирролидона (N-ВП), содержащие не только мономерные звенья 2-метил-5-винилпиридина (МВП), но также и фрагменты 4-винилпиридина (ВП), обладают более широким спектром действия, и в некоторых случаях их активность значимо превышает активность известных аналогов.
Авторы установили, что отношение наблюдаемых констант сополимеризации N-ВП с МВП и N-ВП с ВП практически постоянно во всем диапазоне температур и концентраций реагентов, в которых проводят сополимеризацию. При этом константы полимеризации N-ВП и МВП или ВП различаются более чем на порядок, вследствие чего МВП и ВП расходуются быстрее, чем N-ВП. Поэтому для синтеза сополимера заданного состава необходимо компенсировать расход мономеров подпиточной смесью. Учет выявленных закономерностей позволяет получать сополимеры в соответствии с изобретением, в которых мольные доли звеньев МВП и ВП определяются соотношениями МВП и ВП в подпиточной смеси.
В соответствии с первым вариантом данного изобретения получают сополимер формулы (I), в котором содержание мономерных звеньев Ml и М2 (m+k) составляет 20-50 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-40 кДа.
Предпочтительно содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-40 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,15·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-30 кДа.
В соответствии со вторым вариантом данного изобретения получают сополимер формулы (I), в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=45-250 кДа.
Предпочтительно содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 55-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10·(m+k)-0,25·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=50-150 кДа.
Настоящее изобретение относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1α и интерлейкина-β.
Среди белков семейства ИЛ-1 главным эндогенным медиатором защитных реакций организма служит интерлейкин-1β (ИЛ-1β). В частности, различные типы клеток синтезируют и секретируют ИЛ-1β в ответ на повреждение тканей, например, под воздействием ионизирующих излучений, тогда как ИЛ-1α существует, в основном, в виде мембранной формы. Одно из главных свойств обоих типов ИЛ-1 заключается в способности стимулировать функциональную активность многих типов лейкоцитов и лимфоцитов в ходе развития иммунного ответа на воспаление и пролиферацию злокачественных клеток. Кроме того, ИЛ-1 стимулирует костномозговое кроветворение и воздействует на функции фибробластов и эндотелиальных клеток.
Благодаря своим свойствам рекомбинантный ИЛ-β человека находит применение в клинической практике. Например, медицинский препарат «Беталейкин» разрешен к медицинскому применению в РФ (Приказ Минздрава РФ №51 от 18.02.1997 г., рег. №97/51/6) в качестве иммуностимулятора и как средство восстановления костномозгового кроветворения у раковых больных после интенсивных курсов химио- и радиотерапии. С этой целью препарат применяется у онкологических больных для восстановления подавленного лейкопоэза. Его применение ведет к значительному сокращению сроков нейтропении, снижению частоты суперинфекций и увеличению выживаемости, что подтверждается результатами сравнений с данными медицинской статистики за предшествующие десятилетия. Кроме того, «Беталейкин» используется как гемостимулирующее средство при пересадках костного мозга.
Таким образом, сополимеры настоящего изобретения могут найти применение в качестве агентов, повышающих терапевтическую эффективность обеих форм интерлейкина-1 при лечении онкологических заболеваний, особенно с применением лучевой терапии, а также как средства, улучшающие общее состояние больного, за счет восстановления показателей гемопоэза. К указанным онкологическим заболеваниям относятся, в первую очередь, злокачественные поражения печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы.
В связи с вышеописанным настоящее изобретение также относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве противоракового агента, где рак выбран из группы, состоящей из рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы.
Далее настоящее изобретение относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве активатора фагоцитоза.
Настоящее изобретение далее относится к применению сополимера в соответствии с изобретением в качестве адъюванта при изготовлении вакцин. Предпочтительно применять сополимер для приготовления вакцины против гриппа.
Для реализации первого и второго вариантов изобретения проводят радикальную сополимеризацию N-ВП и смеси МВП и ВП в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты (ДАК) в качестве инициатора сополимеризации, пероксида водорода (ПВ) и циклогексана (ЦГ) в качестве регулятора молекулярной массы. Продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир (ДЭ).
Исходная реакционная смесь содержит 83,5-92,0 мас.% N-ВП, 1,5-9,5 мас.% смеси МВП и ВП, 6,5-7,0 мас.% ЦГ, 0,1 мас.% ПВ и 0,4 мас.% ДАК. Подпиточная смесь содержит 7-72 мас.% N-ВП, 27,5-92,5 мас.% смеси МВП и ВП, 0,2 мас.% ПВ и 0,4 мас.% ДАК.
Требуемое содержание 4-винилпиридиновых мономерных звеньев М2 (k) обеспечивается введением соответствующих количеств ВП как в исходную, так и в подпиточную смеси. Например, если требуется получить сополимер, содержащий около 60 мольн.% N-ВП с содержанием мономерных звеньев M1 и М2 (m+k), равным приблизительно 40 мольн.% и долей мономерных звеньев М2 на уровне 0,05·(m+k), то подпиточная смесь должна содержать 60 мольн.% N-ВП, 38 мольн.% МВП и 2 мольн.% ВП. Учитывая различие в скоростях полимеризации, исходная реакционная смесь должна иметь на порядок меньшее содержание МВП и ВП: 3,8 мольн.% МВП и 0,2 мольн.% ВП, и ее остаток, т.е. 96 мольн.%, должен составлять N-ВП.
Применяя проиллюстрированный выше подход, можно заранее оценивать составы исходной реакционной смеси и подпиточной смеси. При необходимости, можно более точно определять содержания каждого из реагентов по данным анализа полученного продукта. Продукт характеризуется, в частности, числом мономерных звеньев МВП (m) и ВП (k). В одном варианте его вычисляют по данным элементного анализа с учетом стехиометрии сополимера. Получение необходимых для этого расчетных формул доступно среднему специалисту в данной области. В другом варианте строение полученного продукта определяют по данным ЯМР-спектрометрии, например 1H-, 13C- или 15N-ЯМР, по соотношениям интегральных интенсивностей сигналов определенных ядер. Решение указанной задачи также доступно среднему специалисту в данной области.
Объем подпиточной смеси вычисляют каждые 10-20 минут по результатам анализа соотношения концентраций мономеров в реакционной смеси. Реакцию сополимеризации проводят при температуре 60-70°C. По достижении степени конверсии по мономерам около 20-25% реакционную массу охлаждают до 20°C и осаждают в диэтиловый эфир.
В одном варианте подпиточную смесь готовит и добавляет оператор (аппаратчик), основываясь на данных анализа и регламенте синтеза. В другом варианте добавление подпиточной смеси осуществляется автоматически с помощью системы контроля и управления синтезом. Такая система объединяет высокоэффективный жидкостный хроматограф, управляющее устройство и исполнительные устройства. В качестве управляющего устройства может быть использована ЭВМ, реализующая алгоритм управления синтезом, построенный на основе математической модели процесса. В качестве исполнительных устройств могут быть использованы управляемые запорные устройства, например клапаны с пневматическим или электромеханическим приводом.
Для контроля протекания реакции, а также для определения физико-химических характеристик продукта, применяют средства анализа и методы, описанные выше. Кроме того, для обеспечения экспрессности анализа применяют ВЭЖХ. Условия хроматографирования и способ детектирования аналитического сигнала могут быть определены средним специалистом в данной области на основании знаний в рамках известного уровня техники. Предпочтительно применение ОФ-ВЭЖХ с элюированием водно-спиртовыми элюентами, в частности - с градиентным элюированием. В качестве детектора может применяться УФ-спектрометр.
Полученный продукт также характеризуется средневязкостной молекулярной массой, которую вычисляют по характеристической вязкости сополимеров. Выбор методики и подбор условий измерения вязкости является рутинной процедурой, доступной среднему специалисту в данной области. В одном варианте характеристическую вязкость определяют в растворителе, состоящем из 85 об.% ДМФА и 15 об.% 0,1М водного раствора LiBr.
При необходимости для усиления определенного вида активности сополимера в соответствии с настоящим изобретением продукт реакции с широким молекулярно-массовым распределением может быть дополнительно фракционирован, например, методом гель-хроматографии. Условия выполнения фракционирования известны среднему специалисту в данной области. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением имеется возможности регулировать диапазон средневязкостной молекулярной массы Mµ сополимера на стадии синтеза, изменяя количества ПВ и ЦГ.
В частности, сополимеры по п.1, в которых содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-50 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=15-40 кДа, обладают более выраженными свойствами активаторов фагоцитоза и продуцирования интерлейкинов, а также противораковыми свойствами по сравнению с адъювантными свойствами. Сополимеры, в которых содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-90 мольн.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10·(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Mµ сополимера равна Mµ=45-250 кДа, обладают более выраженными адъювантными свойствами и свойствами активаторов фагоцитоза.
Присутствие у соединений указанных видов активности может быть подтверждено исследованиями in vivo. Специалисту в данной области очевиден выбор вирусов и их серотипов, а также подопытных животных, в качестве которых могут быть использованы млекопитающие и птицы. В одном из вариантов млекопитающими являются беспородные белые мыши. В другом варианте млекопитающими являются морские свинки.
Сополимеры в соответствии с любым из вариантов настоящего изобретения являются нетоксичными. В качестве признаков токсического воздействия сополимера на подопытных животных могут рассматриваться, например, гибель, снижение массы тела, изменения походки и поведения, цвета мочи, консистенции экскрементов, состояния глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата.
Далее приведены иллюстративные примеры осуществления изобретения, способствующие более точному и полному пониманию его сути. Специалисту в данной области очевидны возможные модификации и замены, например, относящиеся к протоколам исследований, которые не выходят за рамки формулы изобретения.
Пример 1. Получение сополимера N-винилпирролидона (N-ВП), 2-метил-5-винилпиридина (МВП) и 4-винилпиридина (ВП)
В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 2,30 кг (2,21 л) N-ВП (90,5 мас.%), 35,9 г (44 мл) МВП (1,5 мас.%), 1,7 г (1,8 мл) ВП (0,1 мас.%), 2,9 г (3,1 мл) 30% водного раствора пероксида водорода (ПВ)(0,1 мас.%), 190 г (245 мл) циклогексана (ЦГ) (7,5 мас.%) и 10,0 г ДАК (0,4 мас.%). Реакционную массу нагревают до 60-70°C и ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб C-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOH/H2O 6:94, 2,5 мл/мин (50°C), 254 нм) и подавая подпиточную смесь, содержащую 450 г (433 мл) N-ВП (77,5 мас.%), 121,3 г (127 мл) МВП (20,9 мас.%), 5,6 г (5,9 мл) ВП (1,0 мас.%), 1,2 г (1,1 мл) 30% водного раствора ПВ (0,2 мас.%) и 2,6 г ДАК (0,4 мас.%). По достижении степени конверсии по мономерам 20-25% реакционную массу охлаждают до 20°C и осаждают в диэтиловый эфир. Целевой продукт промывают на фильтре 2 л ДЭ, выделяют фильтрацией и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°C, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°С. Получают 550 г аморфного порошка белого цвета, растворимого в воде (10 мас.% водный раствор имеет pH 7,12), с суммарным содержанием звеньев МВП и ВП равным 21 мольн.% и долей звеньев ВП равной 0,048. Мµ сополимера: 15-40 кДа.
Примеры 2-7. Синтез и выделение сополимеров осуществляют в условиях, указанных в Примере 1. Состав исходной и подпиточной смесей, а также выход сополимера (Вых), содержание в нем звеньев МВП и ВП (m+k, мольн.%), доля звеньев ВП (k) и интервалы средневязкостной молекулярной массы Mµ сополимера приведены в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||||||||||||
| Пр. | Реакционная смесь | Подпиточная смесь | Вых. г | m+k | k | Mµ, кДа | |||||||
| N-ВП, г | МВП, г | ВП, г | ПВ, г | ЦГ, г | N-ВП, г | МВП, г | ВП, г | ПВ, г | |||||
| 2 | 2300 | 86,7 | 8,4 | 1,7 | 195 | 350 | 114,8 | 11,1 | 1,3 | 557 | 25 | 0,09 | 15-30 |
| 3 | 2300 | 163,0 | 25,3 | 1,7 | 195 | 180 | 119,1 | 18,7 | 1,3 | 542 | 42 | 0,15 | 45-90 |
| Таблица 1 (продолжение) | |||||||||||||
| Пр. | Реакционная смесь | Подпиточная смесь | Вых. г | m+k | k | Mµ, кДа | |||||||
| N-ВП, г | МВП, г | ВП, г | ПВ, г | ЦГ, г | N-ВП, г | МВП, г | ВП, г | ПВ, г | |||||
| 4 | 2300 | 183,8 | 69,5 | 1,6 | 195 | 52 | 40,3 | 15,1 | 1,2 | 565 | 51 | 0,30 | 75-150 |
| 5 | 2300 | 194,1 | 71,8 | 1,5 | 195 | 49 | 34,1 | 11,7 | 1,1 | 552 | 50 | 0,29 | 135-250 |
| 6 | 2300 | 92,1 | 8,9 | 1,6 | 195 | 420 | 132,4 | 13,5 | 1,3 | 683 | 25 | 0,10 | 15-40 |
| 7 | 2300 | 174,9 | 38,7 | 1,6 | 195 | 170 | 231,9 | 67,8 | 1,2 | 678 | 63 | 0,25 | 55-95 |
| 8 | 2300 | 201,2 | 76,2 | 1,7 | 200 | 45 | 405,8 | 143,2 | 1,1 | 756 | 92 | 0,29 | 80-145 |
| 9 | 2300 | 214,4 | 82,3 | 1,7 | 200 | 41 | 402,6 | 132,3 | 1,1 | 735 | 91 | 0,30 | 140-250 |
Пример 10. Исследование in vivo острой токсичности сополимеров в соответствии с изобретением
Исследование проводят в группе из 6 здоровых беспородных белых мышей массой 18-22 г. Сополимер, полученный в соответствии с каждым из Примеров 1-6, растворяют в стерильном изотоническом растворе NaCl из расчета 5 мас.% и вводят каждому животному 1,0 мл этого раствора. Соединение считают выдержавшим испытание, если через 7 суток наблюдения в группе не погибло ни одно животное. В исследовании, проведенном для сополимеров, полученных в Примерах 1-9, гибели животных не отмечено.
Пример 11. Исследование in vivo аномальной токсичности противогриппозной вакцины, содержащей сополимеры в соответствии с Примерами 1, 3, 5 и 9
Аномальную токсичность исследуют при однократном внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам одной прививочной дозы вакцины (0,5 мл), содержащей соединения Примера 4, 6 или 7 в качестве адъюванта. Самцов и самок мышей с массой тела 18-22 г разделяют на 5 опытных и 1 контрольную группу по 5 животных в каждой. Перед началом исследований животные проходят карантин при групповом содержании в клетках, а также подробный клинический осмотр непосредственно перед формированием групп.
Проявление аномальной токсичности определяют по результатам наблюдений в течение 7 суток, регистрируя следующие события и характеристики (качественные оценки): гибель животного, походка и поведение, цвет мочи, консистенция экскрементов, состояние глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата. Количественной оценкой может служить усредненное по группе изменение массы тела животных за 7 суток.
Ни одного факта гибели животного как в контрольной, так и в опытных группах, не наблюдалось. Походка, поведение, цвет мочи, консистенция экскрементов, состояние глаз и ушей оставались неизменными в течение всего периода наблюдений. Выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата также не отмечено.
Данные об изменении массы тела подопытных животных, наблюдаемых в течение 7 суток, представлены в Таблице 2.
| Таблица 2 | |||||
| Группа | СС*, мкг | Изменение массы тела подопытных животных, г (среднее по группе) | |||
| Пример 1 | Пример 3 | Пример 5 | Пример 9 | ||
| 1 | 125 | 5,7 | 3,1 | 4,9 | 2,9 |
| 2 | 250 | 5,2 | 3,3 | 4,3 | 3,2 |
| 3 | 500 | 6,1 | 2,8 | 4,7 | 4,0 |
| 4 | 1000 | 5,4 | 3,5 | 5,1 | 3, 6 |
| 5 | 2000 | 5, 6 | 3,3 | 4,9 | 3,1 |
| Контроль | - | 6,3 | 4,4 | 5,2 | 3,7 |
| *СС - содержание сополимера. |
Анализ данных свидетельствует об отсутствии аномальной токсичности у противогриппозной вакцины, содержащей сополимеры в соответствии с изобретением.
Пример 12. Исследование адъювантного действия сополимеров в соответствии с изобретением
Метод исследования основан на выявлении прироста специфических антител в сыворотке крови после двукратного, с интервалом 7 суток, внутрибрюшинного введения вакцины беспородным белым мышам.
Вакциной является гриппозная тривалентная субъединичная жидкая вакцина. В 1 дозе (0,5 мл) вакцины содержится по 5 мкг гемагглютинина вируса гриппа подтипов A (H1N1) и A (H3N2), 11 мкг гемагглютинина вируса гриппа подтипа B и 85-115 мкг/мг консерванта (мертиолят). В качестве иммуномодулятора (адъюванта) применяют сополимеры, полученные в соответствии с Примерами 3 и 8 (Серии 1 и 2 соответственно) или сополимер, раскрытый в Примере 11 патента RU 2415876 (Серия 3). Данные о приросте титра представлены в Таблице 3.
| Таблица 3 | ||||||||||
| Гр. | CA, мкг | Титр антител (среднее по группе) | ||||||||
| Серия 1* | Серия 2* | Серия 3* | ||||||||
| H3N2 | H1N1 | В | H3N2 | H1N1 | B | H3N2 | H1N1 | B | ||
| 1 | 125 | 1:70 | 1:15 | 1:15 | 1:90 | 1:20 | 1:20 | 1:70 | 1:15 | 1:10 |
| 2 | 250 | 1:60 | 1:2 | 1:10 | 1:75 | 1:15 | 1:10 | 1:50 | 1:20 | 1:10 |
| 3 | 500 | 1:70 | 1:20 | 1:10 | 1:90 | 1:20 | 1:10 | 1:60 | 1:15 | 1:15 |
| 4 | 1000 | 1: 90 | 1:20 | 1:10 | 1:100 | 1:20 | 1:20 | 1:70 | 1:20 | 1:15 |
| 5 | 2000 | 1:70 | 1:20 | 1:15 | 1:90 | 1:30 | 1:15 | 1:70 | 1:20 | 1:10 |
| Контр. | - | 1:10 | 1:10 | 1:10 | 1:10 | 1:10 | 1:10 | 1:10 | 1:10 | 1:10 |
| СА - содержание адъюванта; * исходный титр - 1:10. |
На основании полученных данных можно заключить, что вакцина, содержащая соединение в соответствии с Примером 8 настоящего изобретения, является более эффективной, чем аналогичная вакцина известного уровня техники. Вакцина, содержащая соединение в соответствии с Примером 3 настоящего изобретения, проявляет сопоставимую активность.
Пример 13. Исследование противораковой активности сополимеров в соответствии с изобретением
Самок беспородных белых крыс с массой тела 250-300 г разделили на 6 групп по 50 крыс в каждой группе. Животным первой группы по схеме вводили изотонический раствор (негативный контроль), вторая группа получала внутримышечно по схеме сополимер в соответствии с Примером 2 настоящего изобретения, третья группа получала внутримышечно по схеме сополимер в соответствии с Примером 3 патента RU 2415876. Животным четвертой группы по схеме вводили изотонический раствор после введения дозы нитрата плутония-239, достаточной для индуцирования подострого поражения (405 кБк/кг, позитивный контроль). Крысам пятой группы была введена такая же доза нитрата плутония-239, после чего они получали внутримышечно по схеме сополимер в соответствии с Примером 2 настоящего изобретения. Крысам шестой группы, также получившим нитрат плутония-239 в дозе, соответствующей 405 кБк/кг, внутримышечно по схеме вводили сополимер в соответствии с Примером 3 патента RU 2415876. Схема введения сополимеров: первый месяц - 0,5 мл 1 раз в неделю, второй месяц - 0,5 мл 1 раз в 2 недели, третий месяц - 0,5 мл 1 раз в 4 недели.
Через 420 суток после начала исследования в группе негативного контроля (группа 1) осталось 37 крыс (смертность: 26%). В группах 2 и 3 осталось 27 и 28 крыс соответственно (смертность: 10 и 7%). В группе позитивного контроля выжило 2 крысы (смертность: 93%), тогда как в группах 4 и 5, получавших сополимеры внутримышечно и перорально, выжило по 5 крыс (смертность: 83%).
Показатели периферической крови по группам крыс приведены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||
| № | Тип воздействия | Лейкоциты, тыс./мм3 | Эритроциты, млн./мм3 | Гемоглобин |
| 1 | Негативный контроль | 8,5±1,1 | 4,723 | 180 |
| 2 | Сополимер Примера 2* | 7,2±0,6 | 4,310 | 175 |
| 3 | Сополимеры Примера 3** | 7,7±0,7 | 4,508 | 174 |
| 4 | Позитивный контроль | 21, 8±3,3 | 5,170 | 155 |
| 5 | 239Pu+сополимеры Примера 2* | 15,2±2,2 | 4,863 | 164 |
| 6 | 239Pu+сополимеры Примера 3** | 15,2±2,2 | 4, 863 | 164 |
| * Пример 2 настоящего изобретения. | ||||
| ** Пример 3 патента RU 2415876. |
Результаты некропсии крыс, умерших до момента окончания исследования, а также животных, умерщвленных по окончании исследования, показывают, что опухоль в подмышечной впадине в группах 5 и 6, в среднем, имеет объем в 2-3 раза меньший, чем в группе позитивного контроля. Злокачественные изменения печени и/или почек в этих группах также зарегистрированы в 2-3 раза реже по сравнению с группой позитивного контроля.
В результате проведенных исследований констатируется, что введение сополимеров в соответствии с настоящим изобретением оказывает статистически значимое подавляющее действие на развитие злокачественных опухолей в печени и почках подопытных животных, а также улучшает общие показатели анализа крови. При этом, введение сополимера в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения по показателям общего анализа крови (снижение выраженности лейкопении, снижение содержания эритроцитов) способствует улучшению состояния подопытных животных в большей степени, чем введение его известного аналога.
Пример 14. Исследование активности перитонеальных макрофагов в присутствии красителя Нейтрофильного красного
Оценку фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов проводили по интенсивности поглощения ими красителя Нейтрофильного красного (Таблица 5) или коллоидной туши (Таблица 6). Сополимеры применяли в дозе 50 мг/кг в объеме 250 мкл. Животным контрольной группы вводили равный объем воды для инъекций.
Краситель вводили мышам внутрибрюшинно в виде 0,05% суспензии в объеме 2 мл. Исследование проводили через 24 часа после завершения курса введения сополимера или воды. Количество поглощенного красителя определяли по оптической плотности перитонеального лизата при длине волны 620 нм.
| Таблица 5 | ||||
| Препарат | Показатели фагоцитарной активности (ФА) | |||
| 3 сутки | 5 сутки | |||
| ФА, % | Изменение ФА, % | ФА, % | Изменение ФА, % | |
| Сополимер Пример 1* | 67 | 163 | 52 | 149 |
| Сополимер Пример 4* | 58 | 141 | 49 | 138 |
| Сополимер Пример 6* | 63 | 154 | 53 | 151 |
| Сополимер Пример 3** | 59 | 144 | 48 | 137 |
| Контроль | 41 | 100 | 35 | 100 |
| * Примеры 1, 4 и 6 настоящего изобретения. | ||||
| ** Пример 3 патента RU 2415876. |
В аналогичных условиях мышам внутрибрюшинно вводили 2 мл 0,05% суспензии коллоидной туши. Исследование проводили через 24 часа после введения сополимера мышам. Через 10 минут после введения туши брюшную полость мышей промывали 5 мл изотонического раствора NaCl. Собранные клетки перитонеального экссудата трижды отмывали и суспендировали в 1 мл изотонического раствора NaCl. Процент фагоцитирующих клеток (%ФК) определяли по результатам микроскопического подсчета. После этого клетки осаждали центрифугированием, удаляли супернатант, и осадок клеток лизировали водой для инъекций. Лизаты помещали в фотометрические планшеты и определяли светопоглощение при длине волны 620 нм, пропорциональное количеству туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами. Фагоцитарный индекс (ФИ), вычисляемый как отношение светопоглощения к числу фагоцитирующих клеток, отражает степень активации фагоцитоза. Индекс завершенности фагоцитоза, т.е. отношение среднего числа частиц (ФК), поглощенное одной фагоцитирующей клеткой за 1 ч, к ФК за 2,5 ч, отражает переваривающую способность фагоцитов.
| Таблица 6 | |||
| Препарат | %ФК | ФИ | ИЗФ |
| Сополимер Пример 1* | 71,2±1,7 | 8,9±1,2 | 34,7±9,4 |
| Сополимер Пример 4* | 67,1±2,2 | 8,2±1,1 | 30,7±8,3 |
| Сополимер Пример 6* | 70,9±1,4 | 8,5±1,1 | 32,6±9,7 |
| Сополимер Пример 3** | 68,7±1,3 | 8,3±1,0 | 31,4±12,8 |
| Контроль | 56,0±5,7 | 7,0±1,0 | 13,5±5,1 |
| * Пример 2 настоящего изобретения; | |||
| ** Пример 3 патента RU 2415876; | |||
| %ФК - процент фагоцитирующих клеток; | |||
| ФИ - фагоцитарный индекс; | |||
| ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза. |
Исследованные соединения, вводимые внутримышечно в дозе 50 мг/кг, статистически достоверно увеличивали фагоцитарную активность на 15-45% по сравнению с контролем в исследованиях с красителем Нейтрофильным красным, а также повышали долю фагоцитирующих клеток на 8-23%, а индекс завершенности фагоцитоза - на 85-138% в исследованиях с частицами коллоидной туши. В последнем случае отмечалось, что введение сополимеров, практически не изменяя числа фагоцитирующих клеток, в 1,5-2 раза увеличивает переваривающую способность макрофагов. Сополимеры, полученные в соответствии с Примерами 1 и 6 настоящего изобретения, обладают несколько более высокой активностью, чем их известный аналог. Активность сополимера Примера 4 сопоставима с активностью аналога.
1. Сополимер на основе N-винилпирролидона, представленный общей формулой (I):
,
где мономерное звено M1 представляет фрагмент 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено М2 представляет фрагмент 4-винилпиридина (ВП):
,
содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=15-250 кДа.
2. Сополимер по п.1, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-50 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=15-40 кДа.
3. Сополимер по п.2, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-40 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05-(m+k)-0,15·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=15-30 кДа.
4. Сополимер по п.1, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 25-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10-(m+k)-0,30·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=45-250 кДа.
5. Сополимер по п.4, в котором содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 55-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,10-(m+k)-0,25·(m+k), а средневязкостная молекулярная масса Мµ сополимера равна Мµ=50-150 кДа.
6. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1α и интерейкина-1β.
7. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве агента против рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы.
8. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве активатора фагоцитоза.
9. Применение сополимера по любому из пп.1-5 в качестве адьюванта при изготовлении вакцины против гриппа.
