Способ получения ферментов фага spz7


 


Владельцы патента RU 2460537:

Дятлов Иван Алексеевич (RU)
Попов Денис Викторович (RU)
Жиленков Евгений Леонидович (RU)
Морозова Ольга Алексеевна (RU)
Репин Владимир Евгеньевич (RU)
Седов Сергей Алексеевич (RU)
Левашов Андрей Вадимович (RU)
Попова Валентина Михайловна (RU)
Клячко Наталья Львовна (RU)
Белогурова Наталья Георгиевна (RU)
Пугачев Владимир Георгиевич (RU)
Левашов Павел Андреевич (RU)
Легоцкий Сергей Александрович (RU)

Изобретение относится к биохимии. Способ получения ферментов фага SPZ7 из коллекции федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии", заключается в следующем. В бульон Хоттингера вносят культуру Salmonella enteritidis и подращивают ее. В полученную культуру добавляют очищенный фаголизат SPZ7 и культивируют с аэрацией. Осаждают клетки Salmonella enteritidis на центрифуге. Полученные клетки помещают в 0,05 М трис-HCl буферную смесь с рН 7,0, содержащую рибонуклеазу, культивируют. Добавляют этилендиаминтетраацетат до концентрации 5 мМ и полученную суспензию центрифугируют, супернатант отделяют от осадка и фильтруют. Затем фермент осаждают добавлением (NH4)2SO4 до 100%-ного насыщения при температуре 0°С. Осадок белка растворяют в буферной смеси, полученный раствор фермента вносят в хроматографическую колонку с декстраном модифицированным, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М Nad и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, хроматографическое разделение производят со скоростью подачи элюента - 24 мл/ч, полученный раствор фермента подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии. Хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента - 35 мл/ч, выделяют и объединяют фракции, содержащие 70% общей активности фермента. Изобретение позволяет исключить множественные противопоказания и побочные эффекты, имеющие место при применении препаратов живых фагов.

 

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и медицине, в частности к способам получения действующего вещества из очищенного препарата фаговых бактериолитических ферментов для изготовления лечебных препаратов, в частности новых поколений антимикробных препаратов и высокоэффективных, высокоселективных диагностических систем.

Уровень техники

Известен бактериофаг сальмонеллезный групп ABCDE жидкий и сухой с кислотоустойчивым покрытием (Bacteriophagum salmonellae gr. ABCDE liquidum et siccum cum indumento acidoresistentis) (см. http://www.medtrust.ru/pls/farmspravochnic/show.html? ontosObjectId=13606).

Состав его - фильтрат фаголизатов активный против наиболее распространенных возбудителей сальмонеллеза.

Фаговые препараты при применении не нарушают нормального биоценоза человека и незаменимы при устойчивости возбудителей к антибиотикам; могут применяться в комплексной терапии с другими лекарственными средствами.

Применение фаговых препаратов может вызывать различные реакции, например высыпание на коже, покраснение и воспаление (при подкожном и внутримышечном введении) и др. Противопоказаниями является индивидуальная непереносимость препарата.

Недостатком известного технического решения является - множественные противопоказания и побочные эффекты при его применении.

Известно средство для применения в терапии (лечении) бактериальных инфекций, представляющее собой фермент эндолизин бактериофага SPZ7, разрушающий в том числе клетки Salmonella enteritidis (Плешакова В.А. и др. Биолюминесцентное определение АТФ: возможности использования ферментов для повышения специфичности определения бактериальных клеток. Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция Химия, подсекция «цикл наук о живом», 8-11 апреля 2008, с.288).

Цель изобретения - получение фермента фага SPZ7.

Указанная цель достигается за счет того, что способ получения ферментов фага SPZ7 из коллекции федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии", состоит в том, что в бульон Хоттингера вносят 18-часовую культуру Salmonella enteritidis с концентрацией 1·1010 КОЕ/мл и подращивают ее при температуре 37°C с аэрацией в течение 2-3 часов, в полученную культуру добавляют очищенный фаголизат SPZ7 с концентрацией 1·1014 БОЕ/мл и культивируют с аэрацией в течение 25 минут, осаждают клетки Salmonella enteritidis на центрифуге с ускорением 6500 g в течение 15 минут, полученные клетки помещают в 0,05 М трис-НСl буферную смесь с рН 7,0, содержащую рибонуклеазу, культивируют при 37°С в течение 60 минут, добавляют этилендиаминтетраацетат до концентрации 5 мМ и полученную суспензию центрифугируют при ускорении 27000 g в течение 2,5 часов при температуре 5°С, супернатант отделяют от осадка и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм, затем раствор фермента осаждают добавлением (NH4)2SO4 до 100%-ного насыщения при температуре 0°С, осадок белка растворяют в буферной смеси 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, полученный раствор фермента вносят в хроматографическую колонку с декстраном модифицированным, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента 24 мл/ч, г полученный предварительно очищенный раствор фермента подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке размером 2 см2 12 см со сшитым поливиниловым спиртом с функциональными группами диэтиламиноэтана, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, элюцию белков осуществляют градиентом концентрации NaCl 0-0,5 М, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента 35 мл/ч, выделяют и объединяют фракции, содержащие 70% общей активности фермента.

Раскрытие изобретения

Способ получения фаговых ферментов фага SPZ7 из коллекции Федерального Государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" включает несколько этапов:

- получение раствора неочищенного фермента;

- получение предварительно очищенного раствора фермента (далее - препарат №1);

- получение очищенного раствора фермента (далее - препарат №2).

В качестве исходного материала для получения фаговых ферментов был использован фаг SPZ7 из коллекции федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии".

Получение раствора неочищенного фермента производится следующим образом. 30 мл 18-часовой культуры Salmonella enteritidis (сведения о Salmonella enteritidis приведены, например на сайте http://dic.academic.ru/dic.nsf/medic2/41291) с концентрацией 1·1010 КОЕ/мл (колоний образующих единиц) вносятся в 3 л бульона Хоттингера (сведения о бульоне Хоттингера приведены, например на сайте http://dic.academic.ru/dic.nsf/medic2/50634) и подращиваются при температуре 37°C с аэрацией в течение 2-3 часов до концентрации 1·1010 КОЕ/мл. Далее 300 мл очищенного фаголизата (взвеси фаговых частиц в физиологическом растворе) с концентрацией 1·1014 БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) добавляются в приготовленную культуру Salmonella enteritidis и культивируются с аэрацией в течение 25 минут. Затем инфицированные фагом клетки осаждаются на центрифуге с ускорением 6500 g в течение 15 минут. Клетки ресуспендируются в 100 мл 0,05 М трис-НСl буферной смеси рН 7,0, содержащей 7,5 мг рибонуклеазы (сведения о рибонуклеазах приведены, например на сайте http://slovari.yandex.ru/рибонуклеазы/ Естественные %20науки/Рибонуклеазы./). Суспензия культивируется при 37°С в течение 60 минут. При этом клетки разрушаются, выпуская литический фермент. Затем добавляется этилендиаминтетраацетат (далее - ЭДТА) до концентрации 5 мМ и суспензия центрифугируется при ускорении 27000 g в течение 2,5 часов при температуре 5°С. Супернатант отделяется от осадка, фильтруется через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм. Супернатант, содержащий бактериолитический фаговый фермент, исследуется на бактериолитическую активность и наличие свободного фага. Полученный раствор неочищенного фермента может храниться не более 1 суток в замороженном виде при температуре -20°С.

При получении препарата №1 используется следующая технология проведения первичной очистки раствора неочищенного фермента. Раствор фермента размораживается, и производится осаждение белка добавлением (NH4)2SO4 до 100%-ного насыщения при температуре 0°С. В препараты с концентрацией общего белка менее 1 мг/мл перед осаждением дополнительно добавляется бычий сывороточный альбумин (сведения о бычем сывороточном альбумине приведены, например на сайте http://ru. wikipedia.org/wiki/%D0%91%D1%8B%D1%87%D0%B8%D0%B9_%D1%81%D1%8B%D0%B2%D0%BE%D1%80%D0%BE%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%B0%D0%BB%D1%8C%D0%B1%D1%83%D0%BC%D0%B8%D0%BD) до достижения концентрации общего белка не менее 1 мг/мл. Добавленный бычий сывороточный альбумин практически полностью отделяется от активных фракций на стадии гельфильтрации. Осадок белка растворяется в 5-8 мл буферной смеси 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Полученный раствор фермента вносится в хроматографическую колонку 5 см2 33 см с декстраном модифицированным (например, Sephadex G75 superfine), уравновешенную буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Хроматографическое разделение производится при температуре 2-3°С. Скорость подачи элюента 24 мл/ч. Фракции, содержащие 60% общей активности фермента, объединяются, замораживаются и хранятся при температуре -20°С. Полученный препарат №1 может храниться в таком замороженном виде не менее 2 недель без потери активности.

Полученный препарат №1 подвергается дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке размером 2 см2 12 см со сшитым поливиниловым спиртом с функциональными группами диэтиламиноэтана (например, DEAE-Toyopearl 650M), уравновешенной буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Элюция белков осуществляется градиентом концентрации NaCl 0-0,5 М (50×50 мл). Хроматографическое разделение производится при температуре 2-3°С. Скорость подачи элюента 35 мл/ч. Фракции, содержащие 70% общей активности фермента, объединяются, замораживаются и хранятся при температуре -20°С. Полученный препарат №2 может храниться в замороженном виде при температуре -20°С без потери активности не менее 10 месяцев. Размороженный препарат №2 сохраняет свою бактериолитическую активность в течение не менее 45 суток при температурах 20-37°С.

В качестве основного субстрата выбирают хозяина фага - живые клетки Salmonella enteritidis, в качестве дополнительного субстрата - живые клетки Escherichia coli (сведения о Escherichia coli приведены, например на сайте http://lingvo.yandex.ru/Escherichia%20coli%20/). При этом субстрат Escherichia coli используется для протоколирования процесса очистки фермента, так как не обнаружено никаких фракций, активных только по отношению к Salmonella enteritidis и неактивных по отношению к Escherichia coli и наоборот.

Для целей определения бактериолитической активности ферментов клетки Salmonella enteritidis и Escherichia coli выращивались на гидролизате рыбной муки с агаром (ГРМ-агаре) при температуре 37°С в течение 14 часов. Выращенные клетки суспендировались в 0,9% растворе NaCl, центрифугировались с ускорением 5000 g в течение 5 минут, затем ресуспендировались в 0,9% растворе NaCl, при этом концентрация клеток в данной суспензии подбирается такой, чтобы при разведении в 50 раз ее оптическая плотность составляла бы 0,5-0,6 при длине волны 650 нм. Для измерений должны использоваться свежевыращенные клетки или клетки, однократно замороженные жидким азотом, которые хранились при температуре -70°С не более 1 месяца. В течение эксперимента по определению бактериолитической активности ферментов (длительностью до 1 часа) препарат субстрата клеток должен сохраняться при температуре 5°С.

В качестве способа измерения бактериолитической активности в сравниваемых препаратах фермента выбрана турбидиметрия, а именно измерение падения оптической плотности (D) суспензии клеток при длине волны 650 нм. Для суспензий клеток с оптической плотностью D<0,7 начальное значение оптической плотности (D0) пропорционально количеству добавленных клеток. При глубоком лизисе клеток остаточная оптическая плотность препаратов стремится к некоторому относительно постоянному значению оптической плотности (D∞), которое условно принято за значение оптической плотности суспензии «глубоко лизированных разрушенных клеток». Таким образом, значение величины Θ=(D0-D)/(D0-D∞) дает оценку полноты лизиса препарата, что подтверждается независимыми экспериментами по подсчету остаточных КОЕ.

В качестве стандартного раствора для измерения активности должна использоваться буферная смесь 0,01 трис-HCl с рН8,5. Измерения каталитической активности фермента должны проводиться при температуре 37°С.

Пример использования бактериолитического ферментативного препарата фаговых ферментов. Специфичность фагового фермента весьма заметно отличается от специфичности яичного лизоцима. Фаговый фермент более избирательно и с большей эффективностью по сравнению с куриным яичным лизоцимом воздействует на клетки как Salmonella enteritidis, так и на клетки Escherichia coli. Проведенное сравнение субстратной специфичности очищенного фагового фермента (препарат №2) с концентрацией очищенного фагового фермента 1,9 мкг/мл и куриного яичного лизоцима с концентрацией лизоцима 5,6 мкг/мл, при начальной оптической плотности суспензии клеток показало, что воздействие фагового фермента на клетки Escherichia coli и Salmonella enteritidis соответственно в 2-2,2 и 6,4-6,6 раза выше воздействия на них куриного яичного лизоцима.

Исследование влияния различных добавок на скорость ферментативного лизиса клеток очищенным фаговым ферментом (препарат №2) показало, что почти все исследованные добавки не оказывают заметного влияния на ферментативный лизис, т.е. установлена относительная индифферентность к данным добавкам очищенного фагового фермента.

Использование бактериолитического ферментативного препарата фаговых ферментов позволяет достичь исключения множественных противопоказаний и побочных эффектов, характерных при применении препаратов живых фагов.

Использование бактериолитического ферментативного препарата фаговых ферментов совместно с антибиотиком - полимиксином-М в малых концентрациях, заметно усиливает лизис клеток ферментом. Наибольший эффект наблюдается в узком диапазоне концентраций полимиксина-М (2,5·10-6 М-3,5·10-6 М). В указанном диапазоне концентраций отчетливо проявляется синергизм действия фермента и антибиотика, т.е. воздействие на бактериальные клетки смеси двух веществ существенно превышает сумму действий веществ по отдельности. При этом меньшие или большие концентрации полимиксина-М дают меньший синергетический эффект.

Изучение стабильности препарата очищенного фагового фермента (препарата №2) показало, что высокоочищенный фермент демонстрирует превосходную стабильность, сохраняя активность в течение 45 суток инкубации при температурах в диапазоне 25-37°С.

Способ получения ферментов фага SPZ7 из коллекции Федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии", состоящий в том, что в бульон Хоттингера вносят 18-часовую культуру Salmonella enteritidis с концентрацией 1·1010 КОЕ/мл и подращивают ее при температуре 37°C с аэрацией в течение 2-3 ч, в полученную культуру добавляют очищенный фаголизат SPZ7 с концентрацией 1·1014 БОЕ/мл и культивируют с аэрацией в течение 25 мин, осаждают клетки Salmonella enteritidis на центрифуге с ускорением 6500 g в течение 15 мин, полученные клетки помещают в 0,05 М трис-HCl буферную смесь с рН 7,0, содержащую рибонуклеазу, культивируют при 37°С в течение 60 мин, добавляют этилендиаминтетраацетат до концентрации 5 мМ и полученную суспензию центрифугируют при ускорении 27000 g в течение 2,5 ч при температуре 5°С, супернатант отделяют от осадка и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм, затем раствор фермента осаждают добавлением (NH4)2SO4 до 100%-го насыщения при температуре 0°С, осадок белка растворяют в буферной смеси 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, полученный раствор фермента вносят в хроматографическую колонку с декстраном модифицированным, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента - 24 мл/ч, полученный предварительно очищенный раствор фермента подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке размером 2 см2 12 см со сшитым поливиниловым спиртом с функциональными группами диэтиламиноэтана, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, элюцию белков осуществляют градиентом концентрации NaCl 0-0,5 М, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента - 35 мл/ч, выделяют и объединяют фракции, содержащие 70% общей активности фермента.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в молекулярной диагностике, связанной с выявлением РНК-мишеней. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в препаративной биохимии РНК. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена тиоредоксинредуктазы-1.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена пероксиредоксина-1.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается целлюлазных слитых белков. .

Изобретение относится к биохимии и фармакологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения плазминогена или плазмина. .

Изобретение относится к области медицины. .

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым биологически активным веществам класса N-гетериламидов 4-арил-3-галоген-2,4-диоксобутановых кислот.

Изобретение относится к способу получения наноразмерной доставки антибиотиков ряда блеомицина в клетки млекопитающих. .

Изобретение относится к различным наборам. .

Изобретение относится к производному полимиксина, где R1, R2 и R3 являются возможными, но не обязательными и R1, R2, R3, R5, R8 и R9 представляют собой катионные или нейтральные аминокислотные остатки, выбранные таким образом, чтобы суммарное число положительных зарядов при физиологическом значении рН составляло по меньшей мере два, но не более чем три.
Изобретение относится к области медицины и может быть применено для санирования свищей при инфицированном панкреонекрозе. .
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при плановых хирургических вмешательствах на толстой кишке. .

Изобретение относится к области ветеринарии. .

Изобретение относится к соединениям общей формулы I, где R1 представляет собой ОН, ОРО3Н 2 или OCOR5; R2 представляет собой Н, ОН или ОРО3Н2; А представляет собой N или CR6; R3 представляет собой фтор; R4 представляет собой Н, С1-3алкил или С3-6циклоалкил; R5 представляет собой остаток аланина; R6 представляет собой Н, C1-6алкоксигруппу или галоген; и n=0 или 1; и к фармацевтически приемлемым солям соединений формулы I.
Наверх