Вакцина против лаймской болезни собак



Вакцина против лаймской болезни собак
Вакцина против лаймской болезни собак
Вакцина против лаймской болезни собак
Вакцина против лаймской болезни собак
Вакцина против лаймской болезни собак
Вакцина против лаймской болезни собак
Вакцина против лаймской болезни собак

 


Владельцы патента RU 2460538:

ШЕРИНГ-ПЛОУ ЛТД. (CH)

Группа изобретений относится к области ветеринарии и представляет собой вакцину от лаймской болезни собак и способы ее применения. Вакцинная композиция содержит иммунологически эффективное количество организмов из первого штамма геновида Borrelia и иммунологически эффективное количество организмов из второго штамма геновида Borrelia. При этом организмы упомянутого второго штамма проявляют OspA антиген, OspB антиген, или проявляют оба антигена OspA и OspB на поверхности своей клетки, а введение указанной вакцинной композиции собаке вызывает значительные уровни боррелиацидных антител против В.burgdorferi 50772 (АТСС No. PTA-439). Вакцинная композиция позволяет индуцировать значительные уровни боррелиацидных антител OspA и OspC, которые в свою очередь способны стерилизовать инфицированных клещей. Также вакцина предотвращает восстановление В.burgdorferi ss из кожи, серологическое проявление инфекции, выраженные нарушения в конечностях/суставах, эрозивные изменения, связанные с инфицированием. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 ил., 17 табл., 8 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка не является предварительной заявкой и испрашивает приоритет согласно 35 Свода законов США §119(е) предварительной заявки США No. 60/864,258, поданной 3 ноября 2006 г., содержание которой во всей полноте включено здесь посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к вакцине против лаймской болезни собак. Также обеспечиваются способы изготовления и применения вакцины как таковой или в комбинации с другими защитными агентами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лаймская болезнь собак вызывается инфицированием спирохетами видов Borrelia (spp.), включая, главным образом, В.burgdorferi sensu stricto (ss) в Соединенных Штатах и В.burgdorferi ss, В.garnii и В. afzelii в Европе (Baranton et al.. Int. J.Sys. Bacteriol. 1992, 42:378-383. Hovius et al., J.Clin. Microbiol. 2000, 38:2611-2621). Спирохеты передаются, когда инфицированные клещи Ixodes spp. высасывают кровь, и получение инфекции собаками приводит к клиническим симптомам от бессимптомного синовита до острой аритмии и артралгии (Jacobson et al.. Int. J. Sys. Bacteriol. 1996, 11:172-182; Summers et al., J.Comp. Path. 2005, 133:1-13). Важно, что частота случаев заболевания лаймской болезнью собак ежегодно увеличивается синхронно с увеличивающимся числом случаев заболевания у людей (Haninckova et al., Emerg. Infect. Dis., 2006, 12:604-610).

Антитела, продуцируемые в ответ на инфицирование Borrelia spp., имеют две различные функции, но, тем не менее, оба ответа могут быть неэффективными в уничтожении секвестированных спирохет в хозяевах-млекопитающих. Был предложен ряд объяснений этого дефекта в нормальном иммунном ответе на природное инфицирование, включая антигенную вариацию (Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112; Tokarz et al., Infect. Immun. 2004, 72:5419-5432), хозяйскую мимикрию (Barbour et al., Microbiol. Rev. 1986, 50:381-400) и внутриклеточную локализацию (Ма et al., Infect. Immun. 1991, 59:671-678).

Наиболее обычным гуморальным иммунным ответом является продуцирование неспецифических связывающих/опсонизирующих (обволакивающих) антител, которые «отмечают» спирохету для поглощения фагоцитами. К сожалению, опсонизирующие антитела индуцируются несколькими белками, обычными для других микроорганизмов (а именно 41 кДа белками, которые включают бактериальный жгутик), что делает их значение для индуцируемого вакцинацией опосредуемого антителами иммунитета, в лучшем случае, сомнительным.

Вторым обычным иммунным ответом является продуцирование боррелиацидных (летальных для Borrelia) антител. В противоположность опсонизирующим антителам, боррелиацидные антитела распознают эпитопы только на нескольких белках Borrelia spp. После связывания со специфической мишенью на спирохете боррелиацидные антитела весьма часто индуцируют комплемент с образованием атакующего мембраны комплекса, который убивает организм без необходимости удаления его фагоцитами.

Бактерины лаймской болезни собак, используемые в настоящее время в вакцинах, были разработаны, чтобы обеспечить защиту посредством индуцирования OspA-боррелиацидных антител (Hsien-Chu et al., JAVMA 1992, 201:403-411; Ма et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Wikle et al.. Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28; Straubinger et al., Vaccine 2001, 20:181-193), которые уничтожают спирохеты, экспрессирующие OspA в инфицированных клещах, когда паразиты высасывают кровь (Fikrig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89:5418-5421). Straubinger et al., (Vaccine 2002, 20:181-193) сообщили, что цельно-клеточная вакцина индуцировала значительно более высокие титры боррелиацидных антител, чем рекомбинантный OspA. Несмотря на то что такие вакцины были достаточно успешны, сообщалось о неудачных вакцинациях (Levy et al., JAVMA 1993, 202:1834-1838; Ма et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Schutzer et al., N.Engl. J.Med. 1997, 337:794-795).

Теперь понятно, что производимыми OspA-боррелиацидными антителами часто не удается стерилизовать развивающихся клещей, так как антитела только лишь распознают В. burgdorferi ss (Jobe et al., J. din. Microbiol. 1994, 32:618-622; Lovrich et al., Infect. Immunol. 1995, 63:2113-2119), которые экспрессируют OspA, а клещи обычно инфицированы спирохетами В. burgdorferi ss, которые не экспрессируют OspA (Fikrig et al., Infect. Immun. 1995, 63:1658-1662; Ohnishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98:670-675). Кроме того, клещи обычно также инфицированы другими патогенными Borrellia spp., включая В.afzelii и В.garinii (Ornstein et al., J. din. Microbiol. 2001, 39:1294-1298), в то время как OspA-антитела являются специфическими для геновида (Lovrich et al., Infect. Immunol. 1995, 63:2113-2119). Более того, «окно возможностей» для защиты с помощью OspA-боррелиацидных антител ограничено, даже когда спирохеты являются восприимчивыми, поскольку экспрессия OspA, которая опосредуется присоединением к средней кишке клеща (Pat et al. J. din., Invest. 2000, 106:561-569), быстро идет на спад после того, как инфицированные клещи начинают высасывание (Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913).

В. burgdorferi ss OspC является другой потенциальной мишенью для опосредованного боррелиацидными антителами иммунитета (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). Этот белок, очевидно, имеет эпитоп, который ответственен за индуцирование боррелиацидных антител, и является консервативным среди патогенных Borrellia spp. (Lovrich et al., din. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751). Хотя специфическая функция OspC остается неизвестной, предполагают, что экспрессия OspC требуется для инфицирования млекопитающих, но не для инфицирования клещами (Grimm et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. 101(9):3142-3147). В любом случае, спирохеты лаймской болезни экспрессируют OspC сразу же после того, как клещи начинают высасывание (Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913), и должны продолжать экспрессировать OspC, чтобы осуществить инфицирование у млекопитающих (Stewart et al.. Infect. Immune. 2006, 74:3547-3553, Tilly et al., Infect. Immun. 2006, 74:3554-3564). Следовательно, «окно эффективности» OspC-боррелиацидных антител значительно увеличено по сравнению с OspA-боррелиацидными антителами.

Было показано, что OspC-белок может индуцировать защитные боррелиацидные антитела (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741, Ikushima et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29:15-21), но в соответствии с некоторыми предшествующими исследованиями по «картированию» эпитопы были локализованы в высокогетерологичных областях белка (Buckles et al., din. Vacc. Immunol. 2006, 13:1162-1165). Поэтому боррелиацидные OspC-антитела, созданные против этих областей, обеспечивали бы лишь опосредуемый антителами иммунитет против небольшого числа изолятов Borrelia spp. Lovrich et al. (Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751) идентифицировали эпитоп OspC боррелиацидных антител в пределах 7 С-концевых аминокислот (OspC7) белка. Более существенно, что этот эпитоп является консервативным среди патогенных Borrelia spp. Однако с традиционными лабораторными изолятами В. burgdorferi ss, которые экспрессируют OspA (т.е., содержат ospA/ospB оперон), невозможно манипулировать в лабораторных условиях, чтобы также индуцировать значительные уровни OspC боррелиацидных антител без существенного ослабления их способности индуцировать OspA боррелиацидные антитела. Более того, вакцинация, которая убивает традиционные лабораторные изоляты В. burgdorferi ss, которые экспрессируют OspA, не индуцирует боррелиацидные OspC-антитела (Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913, Obonio et al., 1999, J. Clin. Microbiol., 37:2137-2141).

Callister et al. (патенты США №№6,210,676 и 6,464,985, включенные здесь посредством ссылки) предложили использовать иммуногенный полипептидный фрагмент OspC, один или в комбинации с OspA-полипептидом, для приготовления вакцины для защиты людей и других млекопитающих от лаймской болезни. Livey et al. (патент США №6,872,550, включенный здесь посредством ссылки) также предложили вакцину для иммунизации от лаймской болезни, приготовленную из комбинации рекомбинаннтых OspA-, OspB- и OspC-белков. Однако на сегодняшний день никакая вакцина из рекомбинантных белков не показала улучшения по сравнению с вакцинами, которые в настоящее время продаются на рынке. Таким образом, сохраняется долгожданная потребность в средствах для улучшенной вакцины для защиты млекопитающих, и особенно собак, от лаймской болезни.

Цитирование любой приведенной здесь ссылки не должно толковаться как допущение, что такая ссылка представляет собой известный «уровень техники» для настоящей заявки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает новые иммуногенные композиции, которые могут быть использованы в вакцинах. В одном аспекте настоящего изобретения, вакцина защищает от лаймской болезни. В конкретном воплощении этого типа, реципиентом вакцины является собака. В другом воплощении, реципиентом вакцины является домашняя кошка. Другие домашние млекопитающие могут быть защищены вакциной и/или способами настоящего изобретения, такие как лошади и/или скот. Настоящее изобретение далее обеспечивает комбинацию вакцин для вызывания защитного иммунитета к лаймской болезни и других болезней, например других инфекционных болезней собак. Также обеспечиваются способы изготовления и применения вакцин согласно настоящему изобретению.

Вакцина согласно настоящему изобретению включает иммунологически эффективное количество организмов первого или единственного штамма (при необходимости инактивированного), который экспрессирует OspC-антиген. Штамм является таким, который, когда выращен при стандартных условиях культивирования, убит в присутствии OspC-специфических боррелиацидных антител (при необходимости требуется комплемент), включая боррелиацидные антитела против консервативного эпитопа OspC7, вызванного у животного, вакцинированного В.burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439). В конкретном воплощении этого типа, первый или единственный штамм геновида Borrelia конститутивно экспрессирует OspC-антиген. В более конкретном воплощении, первым штаммом является В.burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439).

Вакцинная композиция согласно настоящему изобретению далее может включать иммунологически эффективное количество инактивированных организмов из одного или более дополнительных штаммов (которые могут быть обобщенно обозначены здесь как второй штамм) из патогенного геновида Borrelia. В конкретном воплощении второй штамм обнаруживает OspA- и OspC-антигены.

Примеры подходящих вторых штаммов включают один или более из следующих:

В. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC №РТА-1680), В.burgdorferi ss B-31 (АТСС №РТА-35210), В.afzelii (например, доступный как АТСС №51567) и В. garnii (например, доступный как АТСС №№51383 и 51991), В.burgdorferi ss DK7, В.burgdorferi ss 61BV3, В.burgdorferi ss ZS7, В.burgdorferi ss Pka, B.burgdorferi ss IP1,IP2,IP3, B.burgdorferi ss HII, B.burgdorferi ss P1F, B.burgdorferi ss Mil, B.burgdorferi ss 20006, B.burgdorferi ss 212, B.burgdorferi ss ESP1, B.burgdorferi ss Ne-56, B.burgdorferi ss Z136, B.burgdorferi ss ia и/или любые их комбинации.

Вакцинная композиция по широте охвата включает примерно от 1×104 до примерно 1×1010 организмов на миллилитр каждого соответствующего штамма. В конкретном воплощении, вакцина включает примерно от 1×106 до примерно 5×109 организмов на миллилитр каждого соответствующего штамма. В другом воплощении, вакцина включает примерно от 1,0×108 до примерно 5×108 организмов на миллилитр (или каждого) второго штамма и примерно от 5,0×108 до примерно 5×109 организмов на миллилитр первого штамма.

Вакцинная композиция также может включать фармацевтически приемлемый адъювант, например, такой как соединения алюминия (например, фосфат алюминия, гидроксид алюминия), метаболизируемые и неметаболизируемые масла, блок-полимеры, иммуностимулирующие комплексы, витамины и минералы и CARBOPOL® (например, CARBOPOL 941). В конкретном воплощении фармацевтически приемлемый адъювант включает однородно диспергированные капли масла микронного размера в в водной эмульсии (например, как продающиеся под торговой маркой Emulsigen®).

При необходимости, вакцинная композиция также включает фармацевтически приемлемый иммуностимулятор, например цитокины, факторы роста, хемокины, супернатанты из клеточных культур лимфоцитов, моноцитов или клеток из лимфоидных органов, препаратов из клеток и/или экстрактов из растений, бактерий или паразитов, или митогенов.

Изобретение далее обеспечивает способ иммунизации собаки или другого млекопитающего против патогенного Borrelia spp., особенно В. burgdorferi ss, включающий инъецирование собаки иммунологически эффективным количеством вышеупомянутой вакцины согласно изобретению. Такие вакцины могут включать примерно от 1×108 до примерно 3×109 организмов каждого соответствующего штамма, например. Вакцины могут вводиться такими способами, как внутримышечная инъекция, подкожная инъекция, внутривенная инъекция, внутрикожная инъекция, оральное введение, интраназальное введение и их комбинации. В конкретном воплощении, после вакцинации иммунизированная собака продуцирует боррелиацидные антитела.

Изобретение далее обеспечивает сыворотку, полученную от вакцинированного животного, которая содержит боррелиацидные антитела, которые связываются с В. burgdorferi ss OspC. Аналогично, изобретение обеспечивает очищенные антитела, которые связываются с OspC. В конкретном воплощении, сыворотка содержит значительную долю OspC-специфических боррелиацидных антител.

Изобретение далее обеспечивает комбинированные вакцины, которые включают один или более штаммов геновида Borrelia согласно настоящему изобретению в комбинации с одним или более другими патогенами собак и/или иммуногенами, включая, например, иммуногены для вызывания иммунитета к вирусу чумы собак, аденовирусу собак, парвовирусу собак, вирусу парагриппа собак, коронавирусу собак, вирусу гриппа собак и/или сероварам Leptospira, например, Leptospira kirscheneri серовар grippotyphosa, Leptospira interrogans серовар canicola, Leptospira interrogans серовар icterohaemorrhagiae, и/или Leptospira interrogans серовар potmona. Другие патогены собак, которые могут быть добавлены в комбинированную вакцину согласно настоящему изобретению, включают организмы Leishmania, такие как Leishmania major и Leishmania infantum;

Bordetella bronchiseptica; виды Mycoplasma (например, Mycoplasma cynos), вирус бешенства; организмы anaplasma, такие как anaplasma phagocytophilum и anaplasma platys; и Ehrlichia cams.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут лучше оценены ссылкой на следующие чертежи и подробное описание.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлен Western-блот контроля нормальной собачьей сыворотки (NS) или сывороток из собаки после вакцинации (43-й день исследования) с тестируемым продуктом (ТР) или после контрольного заражения (134-й день исследования) В. burgdorferi ss-инфицированными клещами (N1). Отмечается присутствие специфических для инъекции антител против белка с молекулярным весом приблизительно 20 кДа.

На фиг.2А представлен Western-блот контроля нормальной собачьей сыворотки (NS) или сывороток из отдельных групп индивидуальных собак (пронумерованных 1-15) после вакцинации плацебо и контрольного заражения В. burgdorferi ss-инфицированными клещами (134-й день исследования).

На фиг.2В представлен Western-блот контроля нормальной собачьей сыворотки (NS) или сывороток из отдельных групп индивидуальных собак (пронумерованных 1-15) после вакцинации тестируемым продуктом. Отмечается присутствие специфических для инъекции 20 кДа-антител у 14 собак (93%), вакцинированных плацебо (Фиг.2А) и у 0 собак (p<0,0001), вакцинированных тестируемым продуктом (Фиг.2 В).

Фиг.3А является характерным примером гистопатологических изменений в суставах вакцинированных плацебо собак, которые были инфицированы В.burgdorferi ss. Область внутри прямоугольника показывает значительную инфильтрацию нейтрофильных и мононуклеарных клеток, характерных для артрита, вызываемого лаймской болезнью собак.

Фиг.3В является характерным примером отсутствия гистопатологических изменений в суставах вакцинированных тестируемым продуктом собак, которые были инфицированы В.burgdorferi ss. Область внутри овала свободна от каких-либо инфильтрующих нейтрофильных и мононуклеарных клеток.

Фиг.4 иллюстрирует определение OspC7 ELISA-реактивности, используя нормальные сыворотки (N) от особей без предыдущей истории (сводная диаграмма) лаймских или родственных лаймским симптомов (n=36), неохарактеризованные сыворотки от доноров крови (BD, n=100) или особей, подвергшихся холестерольным скринингам (CS, n=100), или сыворотки от добровольцев с факторами крови или болезнями, которые обычно перекрестно-реактивны с антигенами В.burgdorferi ss, включая антинуклеарные антитела (ANA, n=20), ревматоидным фактором (RF, n=20), мононуклеозом (EBV, n=10), цитомегаловирусом (CMV, n=10), сифилисом (SYPH, n=13) или американским клещевым риккетсиозом (RMSF, n=4). Сплошная линия обозначает три стандартных отклонения от средней величины поглощения нормальной и потенциально перекрестно-реактивной сывороток. Значения над линией соответствуют положительным результатам с 99%-ной вероятностью (1% - фоновое значение).

Фиг.5 иллюстрирует OspC7 ELISA-реактивность, используя сыворотки от пациентов с вероятной лаймской болезнью с мигрирующей эритемой (n=86), представительных пациентов с типичными поражениями лаймской болезнью, пациентов с вероятной лаймской болезнью с «атипичными поражениями» (n=22) и пациентов с возможной лаймской болезнью с конституциональными симптомами (n=49) [самые ранние клинические симптомы]. Сплошная линия обозначает три стандартных отклонения от средней величины поглощения нормальной и потенциально перекрестно-реактивной сывороток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает вакцинные композиции, которые включают иммунологически эффективное количество организмов из одного или более штаммов геновида Borrelia, которые индуцируют эффективный опосредованный боррелиацидными антителами иммунитет у реципиентного вакцинированного животного. Когда организмы таких штаммов выращивают при стандартных для роста геновида Borrelia условиях, они поражаются в присутствии OspC-специфических антител, например, антитела или антител, вызванных у животных, вакцинированных В. burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439).

В одном аспекте настоящего изобретения, окно эффективности антител, индуцируемых вакциной согласно настоящему изобретению, значительно увеличено по сравнению с традиционными вакцинами, основанными единственно на OspA боррелиацидных антителах. В другом аспекте, вакцина согласно настоящему изобретению обеспечивает лучшую возможность стимулирования выгодного иммунологического ответа памяти, например, благодаря экспрессии OspC in vivo, и/или дополнительную и/или усиленную защиту от многочисленных патогенных штаммов Borrelia spp.

В одном воплощении настоящего изобретения, когда организмы таких штаммов выращивают в стандартных для роста геновида Borrelia условиях, они конститутивно экспрессируют OspC-антиген. В конкретном воплощении этого типа, когда организмы таких штаммов выращивают в стандартных для роста геновида Borrelia условиях, они уничтожаются специфической комплементарной реакцией. В еще одном воплощении, значительная доля OspC-специфических боррелиацидных антител в сыворотке, индуцируемых вакциной, включающей организмы таких штаммов, является специфичной к консервативному эпитопу OspC7 и, тем самым, обеспечивает защиту от многочисленных патогенных геновидов Borrelia (например, В.burgdorferi ss, В.afzelii и В.garinii). В еще одном воплощении, в организмах таких штаммов не обнаруживается ни OspA-, ни OspB-антигена. В другом воплощении, организмы таких штаммов имеют любые два или более из этих свойств. В еще одном воплощении, организмы таких штаммов имеют любые три или более из этих свойств. И в еще одном воплощении, организмы таких штаммов имеют любые четыре или более из этих свойств. В конкретном воплощении, организмы таких штаммов имеют все эти свойства. Одним из таких конкретных штаммов является В.burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439).

В альтернативном воплощении, изобретенная вакцина представляет собой композицию, которая включает оба описанных выше первых штамма и эффективное количество организмов, по крайней мере, второго штамма. Второй штамм предпочтительно относится к патогенному геновиду Borrelia, который индуцирует боррелиацидные OspA-антитела, когда вводится как часть изобретенной вакцины. В композицию могут быть дополнительно включены один или более дополнительных вакцинных геновидов. Кроме того, вакцины согласно настоящему изобретению могут включать один или более других патогенов и/или иммуногенов млекопитающих (например, собак).

Для более полной оценки изобретения ниже приводятся следующие определения.

Использование терминов в единственном числе в целях удобства в описании никоим образом не предполагает, что оно является ограничением. Так, например, ссылка на композицию, включающую «полипептид», включает ссылку на один или более таких полипептидов. Кроме того, ссылка на «организм» включает ссылку на множество таких организмов, если не указано иначе.

Используемый здесь термин «приблизительно» применяется взаимозаменяемо с термином «около» и означает, что величина находится в пределах пятидесяти процентов от указанного значения, т.е. композиция, содержащая «приблизительно» 1×1010 организмов на миллилитр, содержит от 5×109 до 5×1010 организмов на миллилитр.

Термин «геновид» впервые был использован и получил определение у Baranton et al., 1992, International J. of Systematic Bacteriology 42: 378-383, и используется здесь в том же значении, что и термин «вид» используется при описании таксономии организмов, не относящихся к Borrelia.

«Стандартные условия выращивания» для культивирования геновидов Borrelia требуют роста при температуре в интервале от около 33°С до около 35°С в среде BSK (Barbour Stoenner Kelly). BSK-среду, как она здесь описана, приготовляли в соответствии с Callister et al. [Detection of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry, Section 11.5.1 - 11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc. Supplement 26, (2003) - включена здесь во всей полноте в качестве ссылки]. (BSK-среда также коммерчески доступна, например, от Sigma, St. Louis, МО).

Как используется здесь, «OspC7» означает иммунодоминантный эпитоп OspC боррелиацидного антитела, расположенный в области из 7 аминокислот (Lovrich et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, включенная здесь во всей полноте в качестве ссылки) в пределах 50 С-концевых аминокислот OspC, как раскрыто Callister et al. (Патенты США №6,210.676 В1 и №6,464,985 В1, которые во всей полноте включены здесь в качестве ссылки), которая является абсолютно консервативной среди известных патогенных Borrelia spp. Консервативность легко подтверждается blast-поиском кодонного сегмента, кодирующего сегмент из 7 аминокислот, описанный Lovrich et al. Такой поиск, проведенный 9 октября 2006 г., дал список результатов из 100 видов Borrelia, содержащих упомянутый выше 7-мерный кодирующий сегмент эпитопа OspC.

«OspC-специфическое боррелиацидное антитело» представляет собой антитело, которое обнаруживается, например, в сыворотке животного, вакцинированного В. burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439), и является антителом, которое избирательно связывается с любым эпитопом OspC-антигена и уничтожает спирохеты, зависимые или независимые от комплемента. «OspC-специфическое боррелиацидное антитело» представляет собой антитело, которое обнаруживается, например, в сыворотке животного, вакцинированного В. burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439), и является антителом, которое избирательно связывается с 7 С-концевыми аминокислотами OspC, как описано Lovrich et al. [Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005), включенная здесь во всей полноте в качестве ссылки] и уничтожает спирохеты (как правило, посредством индуцирования атаки комплемент-опосредованным мембранным комплексом). Специфичность OspC боррелиацидных антител твердо установлена. Например, OspC боррелиацидные антитела обычно обнаруживаются в сыворотке заболевшего лаймской болезнью с помощью измерения восприимчивости В.burgdorferi ss 50772 в тесте боррелиацидных антител. Сыворотки от пациентов-людей с близкородственными заболеваниями редко (2%) содержат перекрестно-реактивные антитела, которые также убивают штамм 50772 (подробно описано Callister et al., 1996, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4):399-402). Более того, пептидный ELISA, который использует OspC боррелиацидный эпитоп, точно захватывает боррелиацидные антитела в сыворотке лаймской болезни, а сыворотки от пациентов с другими близкородственными заболеваниями редко (2%) содержат перекрестно-реактивные антитела, которые связывают OspC7-пептид (иллюстрируется Фиг.4 и 5).

Когда «значительная доля» OspC-специфических боррелиацидных антител в сыворотках, индуцируемых вакциной, являются специфическими для консервативного эпитопа OspC7, это означает, что имеется измеримое уменьшение OspC-специфических боррелиацидных антител в сыворотках после поглощения этих сывороток OspC7. Предпочтительно, оно определяется как, по крайней мере, 2-кратное уменьшение титра боррелиацидных антител сывороток, обнаруживаемое при использовании В. burgdorferi ss 50772, и более предпочтительно, как 2-4-кратное или большее уменьшение титра боррелиацидных антител сывороток после поглощения этих сывороток OspC7.

«Комплемент-специфическая реакция» - это реакция антител, которая требует присутствия сывороточного комплемента, чтобы организм(ы) Borrelia spp.были уничтожены боррелиацидным антителом.

Для целей данного изобретения «инактавированный» организм Borrelia burgdorferi ss означает организм, который способен вызывать иммунный ответ у животного, но не способен инфицировать это животное. Изоляты Borrelia burgdorferi ss могут быть инактивированы агентом, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, бета-пропиолактона, тимеросала или тепла. В конкретном воплощении, изоляты Borrelia burgdorferi ss инактивируют бинарным этиленимином.

Термины «адъювант» и «иммуностимулятор» используются здесь взаимозаменяемо и определяются как одно или более веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В данном контексте, адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или более вакцинных антигенов/изолятов. Адъювант может вводиться животной мишени до, в комбинации с или после введения вакцины. Адъюванты согласно настоящему изобретению могут быть получены из любого числа источников, включая природные источники, рекомбинантные источники и/или может быть химически синтезированным, и т.д. Примеры химических соединений, которые могут быть использованы в качестве адъювантов, включают, но не ограничиваются ими, соединения алюминия, метаболизируемые или неметаболизируемые масла, блок-полимеры, ISCOМы (иммуностимулирующие комплексы), витамины и минералы (включая, но без ограничения ими: витамин Е, витамин А, селен и витамин В12), Quil А (сапонины) и полимеры акриловой кислоты, перекрестно-связанной с полиалкениловыми эфирами или дивинил гликолем, например, CARBOPOL®.

Дополнительные примеры адъювантов, которые иногда специфически называют иммуностимуляторами, включают компоненты бактериальных и грибковых клеток (например, липополисахариды, липопротеины, гликопротеины, мурамилпептиды, бета-1,3/1,6-глюканы), различные сложные углеводы, происходящие из растений (например, гликаны, ацеманнан), различные белки и пептиды, происходящие из животных (например, гормоны, цитокины, ко-стимулирующие факторы), и новые нуклеиновые кислоты, происходящие из вирусов и других источников (например, двунитевая РНК, CpG). Кроме того, любое число комбинаций вышеупомянутых веществ может обеспечить эффект адъюванта и, следовательно, может представлять собой адъювант согласно настоящему изобретению. Одним из предпочтительных адъювантов является Emulsigen®.

В.burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439), как он заявлен в патенте US 6,210,676, и В.burgdorferi ss S-1-10 (АТСС №РТА-1680), как он заявлен в патенте US 6,316,005, были депонированы в Американской Коллекции Типов Культур, 10801 University Boulevard Manassas (VA) 20110, 30 июля 1999 и 11 апреля 2000, соответственно. Совладельцы прав на настоящее изобретение по отдельности имеют права на эти два вышеупомянутые патента.

Следует также понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными конфигурациями, стадиями процессов и материалами, раскрытыми здесь, поскольку конфигурации, стадии процессов и материалы могут в определенной мере варьироваться. Также следует понимать, что использованная здесь терминология применяется единственно с целью описания конкретных воплощений и без намерения являться ограничительной, поскольку объем настоящего изобретения ограничивается только прилагаемыми пунктами притязаний и их эквивалентами.

Дополнительные вакцинные штаммы

Дополнительные OspC штаммы

В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает применение В.burgdorferi ss 50772 (АТСС №РТА-439) в вакцине, которая защищает от лаймской болезни, одного или в комбинации с другими штаммами геновида Borrelia. Примечательно, что В. burgdorferi ss 50772 первоначально был отвергнут в качестве кандидата для использования в вакцине, потому что было некорректно сообщено, что этот штамм не экспрессирует OspC (Anderson et al., 1996, J. Clin. Microbiol., 34: 524-529).

Настоящее изобретение далее обеспечивает уникальные и специфические критерии отбора/идентификации других таких полезных изолятов для вакцин согласно настоящему изобретению. В частности, изоляты могут быть отобраны/идентифицированы, как чувствительные к уничтожению OspC-специфическими антителами, и, предпочтительно, также, как обладающие одним или более, или всеми из следующих свойств: (i) чувствительность к возможности быть уничтоженными OspC-специфическими антителами у реципиента, вакцинированного этим изолятом, (ii) способность индуцировать OspC-боррелиацидные антитела у реципиента, вакцинированного этим изолятом;

(iii) чтобы значительная доля OspC-боррелиацидных антител, индуцированных указанным образом, являлась специфической для консервативного эпитопа в пределах 7 С-концевых аминокислот (OspC7); (iv) отсутствие способности экспрессировать OspA или OspB; и/или (v) способность конститутивно экспрессировать OspC in vitro.

А. Супрессия OspA/B-экспресии и усиление экспрессии OspC с помощью условий культивирования

Obonyo et al. (J. Clin. Microbiol. 1999, 37: 2137-2141) было показано, что экспрессия OspA может быть ослаблена, а экспрессия OspC может быть повышена в течение пятидневного периода посредством со-культивирования нормального патогенного штамма Borrelia spp (штаммы JMNT и N40 В.burgdorferi ss) с клеточной линией клеща (Ixodes scapularis ISE6). Самый отчетливый эффект наблюдался при культивировании при 37°С. Таким образом, данный способ превращает один или более традиционных патогенных штаммов Borrelia в форму, полезную для вакцины согласно настоящему изобретению.

В. Супрессия OspA/B-экспрессии и усиление экспрессии OspC с помощью мутации

В следующем воплощении, использовалось генетическое манипулирование со штаммом Borrelia spp., который первоначально экспрессирует OspA и OspB, для уменьшения экспрессии или чтобы делегировать гены, которые кодируют экспрессию OspA и OspB, что приводит к увеличению экспрессии OspC. Подразумевается, что любой известный в данной области техники способ генетического манипулирования может использоваться для этой цели. Например, инактивированный аналог OspA/OspB-гена вводится во множество организмов доступного штамма Borrelia spp. в форме, совместимой с Borrelia spp. плазмиды, полученной с помощью антибиотического селективного маркера (см., например, Grimm et al., 2004, Proc. Nat11 Acad. Sci. 101(9): 3142-3147, где сообщается, что экспрессия OspC может блокироваться в Borrelia spp. путем введения OspC-инактивирующих и комплементационных плазмид в В.burgdorferi B31-A3 штамм). Рекомбинационные события между введенной плазмидой и природно встречающейся плазмидой, несущей OspA/OspB, приводят к определенному числу успешно рекомбинировавших организмов Borrelia spp., несущих мутированную OspA/OspB-плазмиду. Селекция может предполагаться, например, через связанную с антибиотиками устойчивость и рост в присутствии соответствующего антибиотика. Подразумевается, что организмы Borrelia spp.с селективно ликвидированной экспрессией OspA/OspB будут иметь повышенную экспрессию OspC.

В следующем возможном воплощении, один или более дополнительных организмов В. burgdorferi ss или Borrelia spp., которые экспрессируют OspA, OspB и/или один или более дополнительных Osp антигенов, могут быть включены в вакцинную композицию как дополнительные организмы.

Предпочтительно, каждый соответствующий инактивированный организм представлен в вакцине в концентрации в интервале примерно от 1×104 до примерно 1×1010 организмов/мл. В частности, вакцину предпочтительно вводят собаке в дозе не менее 1,0×108 организмов/мл В. burgdorferi ss S-1-19 и не менее 5,0×108 организмов/мл В. burgdorferi ss 50772.

Дополнительные OspA-штаммы

Вторым штаммом, обеспечивающим OspA-антиген, может быть традиционный лабораторный патогенный изолят В. burgdorferi ss (Barbour et al., 1985, J. din. Microbiol. 52: 478-484), такой как В. burgdorferi ss B-31 (ATCC №35210). Конкретный второй организм может быть представлен В. burgdorferi ss S-1-10 (ATCC №РТА-1680). Дополнительные штаммы, пригодные для использования в качестве второго организма для вакцинной композиции, оптимизированной для регионов за пределами Северной Америки, включают, например, штаммы: В.burgdorferi ss B-31 (ATCC №35210), В.afzelii (например, доступный как ATCC №51567) и В.garinii (например, доступный как ATCC №№51383 и 51991), а также те, которые перечислены ниже в Таблице 1.

Таблица 1
Штамм Страна культивирован из
В.burgdorferi ss DK71 Дания кожи
В.burgdorferi ss 61BV31 Германия кожи
В.burgdorferi ss ZS71 Швейцария клеща
В.burgdorferi ss Pka1 Германия клеща
В.burgdorferi ss IP1, IP2, IP31 Франция CSF
В.burgdorferi ss НII1 Италия крови
В.burgdorferi ss P1F1 Швейцария синовиальной жидкости
В.burgdorferi ss Mil1 Словакия клеща
В.burgdorferi ss 200061 Франция клеща
В.burgdorferi ss 2121 Франция клеща
В.burgdorferi ss ESP11 Испания клеща
B.burgdorferi ss Ne-561 Швейцария клеща
B.burgdorferi ss Z1361 Германия клеща
B.burgdorferi ss ia2 Финляндия CSF
1Lagal et al., J. Clin. Microbiol. 2003, 41: 5059-5065.
2Heikkia et al„ J. Clin. Microbiol. 2002, 40: 1174-1180.

Вакцинная композиция может включать фармацевтически приемлемый адъювант.«Адъюванты» - это агенты, которые неспецифически увеличивают иммунный ответ на конкретный патоген, уменьшая, таким образом, количество антигена, необходимого в любой данной вакцине, и/или частоту введения инъекций, необходимую для того, чтобы создать адекватный иммунный ответ к представляющему интерес антигену. Подходящие адъюванты для вакцинации животных включают, но без ограничения ими, Адъювант 65 (содержащий арахисовое масло, маннида моноолеат и алюминия моностеарат); полный или неполный адъювант Фрейнда; минеральные гели, такие как алюминия гидроксид, алюминия фосфат и алюминиевые квасцы; сурфактанты, такие как гексадесиламин, октадециламин, лизолецитин, диметилдиоктадециламмония бромид, N,N-диактадецил-N′,N′-бис(2-гидроксиметил) пропандиамин, метоксигексадецилглицерол и плюрониевые полиолы; полианионы, такие как пиран, декстран сульфат, поли 1C, полиакриловая кислота и CARBOPOL® (например, CARBOPOL 941); пептиды, такие как мурамил дипептид, диметилглицин и тафцин; и масляные эмульсии. Сведения, касающиеся адъювантов, раскрыты, например, в выпуске Р.Tijssen [Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3rd Edition, 1987, Elsevier, New York, включенном здесь в качестве ссылки].

При необходимости, вакцинная композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый иммуностимулятор, такой как компоненты стенок бактериальных и/или грибковых клеток (например, липополисахариды, липопротеины, гликопротеины, мурамилпептиды), различные сложные углеводы, происходящие из растений (например, гликаны, ацеманнан), различные белки и пептиды, происходящие из животных (например, гормоны, цитокины, ко-стимуляторные факторы) и новые нуклеиновые кислоты, происходящие из вирусов и/или других источников (например, двунитевую РНК, CpG).

Вакцинная композиция легко вводится любым стандартным путем, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную, оральную, интраназальную, внутрикожную и/или внутрибрюшинную вакцинацию. Специалисту будет понятно, что вакцинная композиция предпочтительно составляется конкретно для каждого типа реципиентного животного и способа введения.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает также способы иммунизации собаки против В. burgdorferi ss и других Borrelia spp. Один из таких способов включает инъецирование собаки посредством иммунологически эффективного количества вакцины согласно настоящему изобретению, так что собака продуцирует соответствующие OspA и OspC боррелиацидные антитела.

В одном воплощении, подкожное введение согласно настоящему изобретению приводит к продуцированию высоких концентраций OspA и OspC боррелиацидных антител, включая боррелиацидные антитела, специфические для OspC7. В другом воплощении, настоящее изобретение обеспечивает вакцину, которая включает специфическое минимальное количество каждого штамма В.burgdorferi ss, которое является эффективным против приносящего вред Borrelia spp. В еще одном воплощении, вакцина согласно настоящему изобретению является эффективной для защиты от В.burgdorferi ss и других патогенных инфекций Borrelia spp. у собак. В конкретном воплощении, вакцина включает безопасную и иммунологически эффективную комбинацию двух штаммов В.burgdorferi ss согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый адъювант.

В настоящем изобретении раскрывается, что вакцина, включающая специфически минимальное количество двух штаммов В.burgdorferi ss, защищает собак от последующего инфицирования клещевого Borrelia spp. Настоящее изобретение далее раскрывает вакцину, которая вызывает выработку специфически минимальных количеств В.burgdorferi ss-специфических OspA и Borrelia spp.-специфических OspC боррелиацидных антител у вакцинированных собак. Вакцины согласно настоящему изобретению могут также вводиться с приемлемым иммуностимулятором и/или адъювантом.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры служат для дальнейшей оценки изобретения, но никоим образом не означают ограничения эффективного объема изобретения.

ПРИМЕР 1

ВАКЦИНАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫМ OSPA

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Животные:

LVG-хомяков возраста пяти-десяти недель получали от Charles River Breeding Laboratories, Inc. (Wilmington, Mass.). Хомяков помещали по трое или четверо на клетку при температуре окружающей среды 21°С и обеспечивали пищей и водой вволю.

- Вакцинация хомяков и сбор сыворотки:

Хомяков вакцинировали подкожно в спину или шею 0,5 мл коммерчески доступной рекомбинантной вакциной OspA (rOspA), RECOMBITEK® Lyme (Merial Limited, Duluth, GA), и делали повторную иммунизацию спустя три недели после первой вакцинации. На 3, 7, 9 и 15 неделе после первичной вакцинации группы из пяти хомяков, каждую, мягко анестезировали ингаляцией эфира, содержавшегося в носоротовой чашке, и отбирали внутрисердечную пункцию. Крови давали свернуться, отделяли сыворотку и хранили при -70°С до использования. Кроме того, объединили сыворотки из трех невакцинированных хомяков и использовали в качестве нормального сывороточного контроля. В качестве дополнительного контроля 20 хомяков вакцинировали в оба задних бедра 0,25 мл коммерчески доступной вакциной против лаймской болезни собак из целых клеток (Galaxy, Solvay Animal Health, Inc., Mendota Heights, Minn., сейчас - Schering-Plough Animal Health, Elkhom, Nebraska), которая содержала В. burgdorferi ss S-1-10. Животных повторно иммунизировали, и собирали сыворотку, как описано выше.

- Приготовление среды BSK

Для in vitro культивирования В. burgdorferi использовали питательную среду Barbour-Stoenner-Kelly (BSK), и первичный субстрат использовали при тестировании боррелиацидных антител и в способах, описываемых в настоящей заявке. BSK-среду готовили как описано Callister et al., [Detection of Borreliacidical Antibodies by Flow Cytometry, Section 11.5.1 - 11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc., Supplement 26, (2003), включенная здесь во всей полноте в качестве ссылки]. Вкратце, BSK-среду готовили следующим способом.

Материалы:

HEPES (Sigma)

Неопептон (Difco)

Натрия цитрат (Sigma)

Глюкоза (Sigma)

Натрия бикарбонат (Sigma)

ТС дрожжевой экстракт (Difco)

Пирувиковая кислота (Sigma)

N-ацетилглюкозамин (Sigma)

Бычий сывороточный альбумин (Sigma)

Желатин (микробиологически чистый; Difco)

5N NaOH

10x Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066 (MP Biomedical) или Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 среда (Sigma) с L-глутамином и без бикарбоната натрия

Кроличья сыворотка (Life Technologies), инактивированная теплом 45 мин при 56°С

56°С водяная баня

Нагнетательный насос

Миллипористый фильтрующий трубопровод

Фильтр предварительной очистки (124 мм)

0,2-; 0.45- и 0,8-мкм фильтры (142-мм в диаметре)

0,2-мкм воронкообразные фильтры

Стерильные 100-мл контейнеры

Темнопольный микроскоп

Приготовление среды BSK

1. Следующие компоненты смешивали в 2-литровой колбе от 2 до 4 часов. 900 мл дважды отфильтрованной Mini-Q или деионизированной дистиллированной воды:

6,0 г HEPES

5,0 г неопептона

0,7 г цитрата натрия

5,0 г глюкозы

2,2 г бикарбоната натрия

2,5 г ТС дрожжевого экстракта

0,8 г пировиноградной кислоты

0,4 г N-ацетил глюкозамина

50 г бычьего сывороточного альбумина (фракция V).

2. Компоненты смешивали медленно, используя самую медленную установку смешивающей пластины, так как интенсивное смешивание могло привести к разложению продуктов, токсичных для В. burgdorferi.

3. В то время как компоненты BSK смешивали, приготовляли раствор желатина следующим образом: в 500-мл колбе смешивали 200 мл дважды отфильтрованной Mini-Q или деионизированной дистиллированной воды и 14 г желатина и нагревали на установке для среды с помешиванием до растворения. Раствор затем автоклавировали в течение 15 мин при 121°С и после этого помещали в 56°С водяную баню.

4. Когда компоненты BSK полностью растворялись, раствор регулировали до pH 7,5 посредством 5N NaOH.

5. Затем 200 мл раствора желатина, 100 мл 10х CMRL 1066 среды и 64 мл инактивированной теплом кроличьей сыворотки (45 мин при 56°С) смешивали с другими компонентами BSK и хорошо перемешивали.

Стерилизованная среда BSK

6. Используя нагнетательный насос, BSK-среду прокачивали через миллипористый фильтрующий трубопровод, оборудованный 124-мм фильтром предварительной очистки, и 142-мм фильтры с диаметром пор 0,2-, 0,45 и 0,8 мкм, установленные последовательно от фильтров с самым маленьким размером пор (на дне) до с самым большим (в верхней части). [BSK-среду нельзя стерилизовать автоклавированием. Предварительная очистка была необходимой для удаления крупных частиц перед фильтрующей стерилизацией.].

7. Затем BSK-среду стерилизовали фильтрацией в стерильный контейнер, используя нагнетательный насос и стерильный 0,2-мкм воронкообразный фильтр.

Подтверждение стерильности

8. 1-мл аликвоту стерильной BSK асептически брали и переносили в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку и инкубировали в течение ночи при 35°С. Остальную стерилизованную фильтрацией BSK хранили при 4°С.

9. После инкубирования стерильную BSK исследовали, используя темнопольный микроскоп, для подтверждения стерильности.

10. Затем стерильную BSK передавали в стерильные контейнеры для хранения.

Контроль качества Barbour-Stoenner-Kelty (BSK) среды

Перед использованием BSK-среды важно убедиться, что BSK поддерживает рост небольшого количества Borrelia spp. и что жизнеспособные спирохеты растут без агрегирования. Высоко вариабельным компонентом BSK-среды является бычий сывороточный альбумин (BSA). Использованный здесь протокол контроля качества применяли к тестируемым культурам для инкубирования и изучения получаемых культур, как описано подробно Callister et al., 2003, Id.

- Обнаружение OspA боррелиацидных антител:

OspA боррелиацидные антитела обнаруживали, используя жидкостную цитометрическую процедуру и В. burgdorferi ss S-1-10 (Callister et al.. Arch. Intern. Med. 1994, 154:1625-1632). Свежую культуру спирохет разводили свежей BSK до концентрации приблизительно 5×106 спирохет/мл. Параллельно, образцы сыворотки разводили 1:40 свежей BSK и стерилизовали проведением через микроцентрифужный фильтр с размером 0,2 микрон (мкм). 200 мл акливоту затем передавали в стерильную 1,5 мл центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и серийно разводили в BSK от 1:80 до 1:20480. Образцы сыворотки инактивировали теплом при 56°С в течение 10 мин, и добавляли 10 мкл аликвоту суспензии спирохет (5×105 спирохет) и 10 мкл стерильного комплемента морской свинки (Sigma). Все вместе хорошо перемешивали и инкубировали в течение 16-24 часов при 35°С.

После инкубирования, 100 мкл каждого образца суспензии переносили в полипропиленовую пробирку, содержащую 400 мкл PBS и 1 мкг/мл акридинового оранжевого. Затем использовали FACSan проточный цитометр (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) для обнаружения боррелиацидной активности. Спирохеты выделяли путем фильтрования (CellQuest software, Becton Dickinson) и анализировали в течение 1-2 мин при низкой скорости потока. OspA боррелиацидные антитела обнаруживали косвенно отслеживанием повышенной интенсивности флуоресценции, которая имеет место, когда акридиновый оранжевый интеркалирует во вспузырившиеся нежизнеспособные спирохеты. А≥13% сдвиг в средней интенсивности флуоресценции по сравнению с нормальным сывороточным контролем рассматривали как положительный (Callister et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9: 908-912). Наличие вспузырившихся неподвижных В. burgdorferi затем подтверждали с помощью темнопольного микроскопа. Положительный контроль включали в каждый анализ, и для минимизации вариабельности между анализами требовали идентичную реактивность (+/- одно разведение) от опыта к опыту. Кроме того, параллельно анализировали образцы сыворотки, собранные от каждой собаки.

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

Вакцинация rOspA вакциной индуцировала лишь минимальные количества (средний титр < 61) боррелиацидных антител спустя 7 недель, при этом спустя 15 недель антитела уже не обнаруживались (Таблица 2). В противоположность этому, хомяки, вакцинированные вакциной для собак, которая содержала типичный штамм В. burgdorferi ss (S-1-10), индуцировали высокие уровни боррелиацидных OspA антител с максимумом на неделе 7 (титр > 2560), которые оставались повышенными на протяжении исследования.

Таблица 2
Средний титра OspA боррелиацидных антителb после вакцинации rOspA или GALAXY™ (S-1-10) вакцинами против лаймской болезни собак
Вакцина Неделя 3 Неделя 7 Неделя 9 Неделя 15
rOspA 9 61 4 HOc
S-1-10 1470 >2560 970 735
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженное с использованием В.burgdorferi ss S-1-10.
сНО = Не обнаружено.

Таким образом, рекомбинантная OspA вакцина для собак не вызывает значительного титра OspA боррелиацидных антител у хомяков.

ПРИМЕР 2

ВАКЦИНАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ OSPC

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Животные:

LVG хомяков от пяти- до 10-недельного возраста получали от Charles River Breeding Laboratories, Inc. (Wilmington, Mass.). Хомяков размещали по трое или четверо на клетку при температуре окружающей среды 21°С и вдоволь обеспечивали пищей и водой.

- Приготовление рекомбинантной ("r") OspC вакцины

rOspC получали из Е. coli JM109, содержащего рХ3-22, как было описано ранее (Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178: 733-741). Если коротко, Е. coli культивировали при 37°С в 2xTY бульоне, содержащем ампициллин, и в течение фазы экспоненциального роста добавляли изопроил-β-d-галактопиранозид (IPTG) (0,1 мМ). Клетки пеллетировали центрифугированием, ресуспендировали в солевом фосфатном буфере (PBS) и лизировали ультразвуковой обработкой. Добавляли Triton Х-100 (1% об./об.), и лизат центрифугировали при 10000 × g в течение 5 мин. Разрушенные ультразвуком клетки затем пеллетировали центрифугированием, и супернатант пропускали через колонку, содержащую SoftLink полимер (Promega), который связывает OspC посредством биотинилированного очищенного хвостика на аминоконце. Связавшийся OspC затем элюировали с помощью очищающего буфера, который также содержал 5 мМ биотина (Sigma).

- Вакцинация хомяков и сбор сыворотки

Хомяков вакцинировали подкожно в заднюю часть шеи 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда, который содержал 75 мкг rOspC и затем спустя три недели после первичной вакцинации делали повторную вакцинацию 75 мкг rOspC в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 5 неделе после первичной вакцинации хомяков мягко анестезировали ингаляцией эфира, содержавшегося в носоротовой чашке, и отбирали внутрисердечную пункцию. Крови давали свернуться, сыворотку отделяли и хранили при -70°С до использования. Кроме того, объединили сыворотки из трех нормальных хомяков и использовали в качестве нормального сывороточного контроля.

- Обнаружение OspC антител

rOspC разводили до 1000 нг/мл в буфере для сенсибилизации поверхностей (0,015 М Na2CO3, 0,035 М NaHCO3, pH 9,6) и 100 мкл количества добавляли в индивидуальные плоскодонные аминосвязывающие микротитровальные лунки (Costar, Cambridge, Mass.). Микротитровальные планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубирования планшеты промывали 3 раза PBS (pH 7,2) и блокировали PBS, содержащим 0,05% TWEEN 20 (Sigma) и 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) в течение 1 часа при комнатной температуре с встряхиванием. После блокирования планшеты снова промывали PBS. Последовательно серийно разведенные от 1:80 до 1:20480 в PBS/Tween 100 мкл количества сыворотки хомяков добавляли в индивидуальные лунки, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубирования планшеты три раза промывали PBS, добавляли в каждую лунку 100 мкл конъюгата анти-хомякового IgG с пероксидазой хрена (Organon Teknika Cappel), разведенного 1:3000 в PBS/Tween, и планшеты реинкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем планшеты 3 раза промывали PBS, и в каждую лунку добавляли 100 мкл о-фенилендиамин фосфата (0,4 мг/мл; Sigma) и давали инкубироваться при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакции останавливали добавлением 100 мкл 1 N H2SO4 и сразу же определяли поглощение на 490 нм (модель EL 311; Bio-Tek Inc. Winooski, Vt).

- Обнаружение боррелиацидных OspC антител

Боррелиацидные OspC антитела обнаруживали, как описано выше (Пример 1), за исключением того, что использовали В. burgdorferi ss 50772.

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

Вакцинация rOspC вакциной индуцировала высокие уровни rOspC антител, обнаруживаемых с помощью ELISA (Таблица 3, далее), но показывала лишь низкий уровень (титр 80) боррелиацидных антител. Вакцинация с помощью rOspC, следовательно, индуцировала высокие концентрации rOspC антител, но ответ почти полностью поглощался антителами (например, опсонизирующими), что не обеспечивало бы защиту против инфекции. Особенно существенным было, когда рассматриваемую концентрацию белков 75 мкг в вакцине В. burgdorferi ss 50772 вычисляли без учета наличия многочисленных дополнительных не-OspC белков. Поэтому совместные результаты (Примеры 1 и 2) подтверждали предыдущие открытия (Straubinger et al. Vaccine 2003, 20: 181-193), что рекомбинантные Osp стимулировали значительно меньшие количества боррелиацидных антител, чем интактные В. burgdorferi ss.

Таблица 3
Средний титра антител, обнаруженных с помощью OspC ELISA или с помощью теста боррелиацидных OspC антителb после вакцинации rOspC
Титр антител, обнаруженных с помощью:
Образец OspC ELISA Тест боррелиацидных OspC антител
Нормальный HOc НО
rOspC 10240 80
аРеципрокное разведение пула сывороток от 5 хомяков.
bОбнаруженное при использовании В. burgdorferi ss 50772.
cНО = Не обнаружено.

Таким образом, рекомбинантная OspC вакцина для собак не вызывает значительных титров боррелиацидных OspC антител у хомяков.

ПРИМЕР 3

ВАКЦИНАЦИЯ ИЗОЛЯТОМ S-1-10 B.BURGDORFERI ss

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Организм

В.burgdorferi ss S-1-10 является типичным патогенным штаммом, обычно не отличимым от В. burgdorferi ss B31 (Barbour et al., J. Infect. Dis., 1985, 152: 478-484). Изолят был первоначально выделен Dr. Steven M. Callister, Gundersen Lutheran Medical Foundation, La Crosse, WI, из почки белоногой мыши, Peromyscus leucopus, пойманной в феврале 1988 г.в местечке близ La Crosse, WI, и был лицензирован Сольвейским центром здоровья животных для включения в вакцину против лаймской болезни собак. Последующий коммерческий продукт (GALAXY™ Lyme) был получен Schering Plough Animal Health 17 апреля 1997 г. Этот организм экспрессирует OspA, OspB и OspC. Однако, как это типично для инфекционных изолятов В.burgdorferi ss, существенно более высокие концентрации OspA и OspB продуцируются, когда спирохеты культивируют в лабораторной BSK-среде. Было показано, что экспрессия OspC может быть максимизирована инкубированием при 35°С (Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112).

- Приготовление B.burgdorferi ss S-1-10 вакцины

Свежую культуру В.burgdorferi ss S-1-10, которая достигла фазы логарифмического роста посредством инкубирования в BSK при 35°С, инактивировали добавлением бинарного этиленимина (BEI) до конечной концентрации 10 мМ и инкубированием в течение дополнительных 48 часов. После инактивации BEI нейтрализовали, добавляя стерильный тиосульфат натрия и инкубируя при 35°С в течение 6-12 часов. Спирохеты затем пеллетировали центрифугированием и ресуспендировали в стерильном равновесном растворе соли, содержащем ≤ 30 мкг гентамицина/мл и ≤ 30 единиц нистатина/мл. Затем спирохеты смешивали с 5% Emulsigen® (MVP Laboratories, Inc.) и 1% HEPES, так чтобы 1,0 мл доза содержала ≥ 2,5×107 спирохет.

- Вакцинация и сбор сыворотки

Собак вакцинировали подкожно в шею 1 мл дозой S-1-10 вакцины и повторно иммунизировали дополнительной 1 мл дозой спустя 21 день. Всю кровь сразу же собирали до повторной вакцинации (день исследования 21) и в дни исследования 28, 35, 47, 83 и 113 путем венепункции яремной вены. Сыворотку отделяли центрифугированием и хранили при -20°С до тестирования.

- Обнаружение боррелиацидных антител

Боррелиацидные OspA и OspC антитела обнаруживали проточной цитометрией, используя В. burgdorferi ss S-1-10 и 50772, как описано выше в Примерах 1 и 2.

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

Вакцинация В. burgdorferi ss S-1-10 надежно индуцировала высокие уровни боррелиацидных OspA антител, которые обнаруживали на день исследования 21 с максимумом на день исследования 28 и оставались обнаруживаемыми на день исследования 113 (Таблица 4, далее). В противоположность этому, боррелиацидные OspC антитела не обнаруживались (титр менее 1:80). Таким образом, традиционный штамм В. burgdorferi ss не индуцировал производство боррелиацидных OspC антител, несмотря на максимизацию экспрессии OspC при инкубировании спирохет при 35°С.

Таблица 4
Средние титрыa (n=8) боррелиацидных OspA и OspC антител после вакцинации В. burgdorferi ss S-1-10
Боррелиацидное антитело День 21 День 28 День35 День47 День 83 День 113
OspAb 202 9481 9481 4740 1613 1382
OspCc НОd НО НО НО НО НО
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженные с использованием В. burgdorferi ss S-1-10.
cОбнаруженные с использованием В. burgdorferi ss 50772.
dНе онаружено.

Таким образом, вакцина, использующая изолят S-1-10 В. burgdorferi ss, не вызывает существенного титра боррелиацидных OspC антител.

ПРИМЕР 4

ВАКЦИНАЦИЯ ИЗОЛЯТОМ 50772 B.BURGDORFERI ss

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Организм

В.burgdorferi ss 50772 является уникальным ospA-/ospB-штаммом, первоначально о котором сообщили Anderson et al., J. of Clin. Microbiol., 1996, 34: 524-529, которые не идентифицировали его как экспрессирующий OspC антиген. Штамм 50772 описан в патенте US №6,464,985, включенном здесь во всей полноте в качестве ссылки, как экспрессирующий OspC антиген, и об этом штамме в указанном патенте US сообщается как о депонированном в АТСС под №РТА-439.

- Животные

Щенков коротконогой гончей восьминедельного возраста (Ridglan Farms, Mount Horeb, WI) помещали вместе и вдоволь обеспечивали пищей и водой. Эксперимент был просмотрен и одобрен Schering Plough Animal Health Care and Use Committee (IACUC).

- Приготовление В.burgdorferi ss 50772 вакцины

В.burgdorferi ss 50772 вакцину готовили, как описано выше в Примере 3.

- Вакцинация и сбор сыворотки

Собак вакцинировали подкожно в шею 1 мл дозой 50772 вакцины и повторно иммунизировали дополнительной 1 мл дозой спустя 21 день. Всю кровь сразу же собирали до повторной вакцинации (день исследования 21) и в дни исследования 28, 35, 47, 83 и 113 путем венепункции яремной вены. Сыворотку отделяли центрифугированием и хранили при -20°С до тестирования.

- Обнаружение боррелиацидных антител

Боррелиацидные OspC антитела обнаруживали проточной цитометрией, используя В.burgdorferi ss 50772, как описано выше в Примерах 1 и 2.

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

Вакцинация В. burgdorferi ss 50772 надежно индуцировала высокие уровни боррелиацидных OspC антител с максимумом на день исследования 35 и оставались обнаруживаемыми на день исследования 113 (Таблица 5, далее). Таким образом, в противоположность вакцинации rOspC или традиционному изоляту В. burgdorferi ss (S-1-10), вакцинация уникальным штаммом 50772 индуцировала значительные уровни боррелиацидных OspC антител.

Таблица 5
Средние титрыa (n=8) боррелиацидных OspC антителb после вакцинации В. burgdorferi ss 50772
День 21 День 28 День 35 День 47 День 83 День 113
HOc 5530 1097 435 274 202
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженные с использованием В.Burgdorferi ss 50772.
cНе обнаружено.

Таким образом, вакцина, использующая изолят 50772 В. Burgdorferi ss, индуцирует высокие концентрации боррелиацидных OspC антител.

ПРИМЕР 5

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ИЗОЛЯТЫ S-1-10 И 50772 B.BURGDORFERI SS

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Выращивание

Замороженные культуры В. burgdorferi ss S-1-10 и В. Burgdorferi ss 50772 культивировали при стандартных условиях, т.е. хранившиеся культуры выращивали при 33±2°С и 35±2°С, соответственно, в индивидуальных пробирках для культур с завинчивающимися крышками, содержащими 5-17 мл BSK (Barbour Stoenner Kelly) среды [приготовленной согласно Callister et aL, 1990, J. of Clinical Microbiology 28:363-365, включенной здесь во всей полноте в качестве ссылки] при атмосфере воздуха, обогащенной 5% CO2. По достижении фазы логарифмического роста культуры использовали для инокуляции 150-200 мл свежей BSK-среды, которые далее инокулировали, но культуры не достигали фазы логарифмического роста. Полученные суспензии затем использовали для инокулирования 5-10 титров свежей BSK, содержавшейся в 10-20 литровых колбах (производство культуры), до того как дополнительно их инкубировать, как описано выше.

- Инактивирование

Спирохеты в производимых культурах инактивировали добавлением BEI до концентрации 10 мМ и инкубированием при встряхивании в течение 24-48 часов. После инактивации спирохет BEI нейтрализовали добавлением 10,6 мл стерильного 3,015 М тиосульфата натрия к каждому литру суспензии BSK/спирохеты и инокулированием при медленном встряхивании в течение 6-12 часов.

- Концентрация и смешивание

Инактивированные спирохеты пеллетировали центрифугированием и ресуспендировали в стерильном равновесном растворе, содержащем 30,0 мкг/мл гентамицина и 30 единиц/мл нистатина. Тестируемую вакцину смешивали с 5% Emulsigen® (MVP Laboratories, Inc.) и помещали в 20 мл стеклянные пробирки, так чтобы каждая доза (1,0 мл) содержала ≥ 2,5×107 организмов/мл В. burgdorferi ss S-1-10, ≥ 5,0×108 организмов/мл В.burgdorferi ss 50772, 1% HEPES, 29 мкг/мл гентамицина и 29 единиц/мл нистанита.

ПРИМЕР 6

БЕЗОПАСНОСТЬ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИНЫ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ИЗОЛЯТЫ S-1-10 И 50772 B.BURGDORFERI SS

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Животные

Щенков коротконогой гончей восьминедельного возраста (Ridglan Farms, Mount Horeb, WI) помещали индивидуально или вместе и вдоволь обеспечивали пищей и водой. Эксперимент был просмотрен и одобрен Schering Plough Animal Health Care and Use Committee (IACUC).

- Вакцинация и сбор сыворотки

Собак вакцинировали подкожно в шею 1 мл дозой 50772 вакцины и повторно иммунизировали дополнительной 1 мл дозой спустя 21 день. Всю кровь сразу же собирали перед первой (день исследования 3) и повторной вакцинацией (день исследования 21), а также в дни исследования 28, 35, 43, 78, 106, 134, 162 и 197 путем венепункции яремной вены. Сыворотку отделяли центрифугированием и хранили при -20°С до тестирования.

- Поствакцинационные наблюдения

После каждой вакцинации места инъекций ежедневно пальпировали, пока не стало никаких ощущений, и в течение 4-6 часов после вакцинации в 1-3 дни после вакцинации регистрировали ректальные температуры.

- Заражение клещами:

Спустя три недели после вторичной вакцинации собак обривали с правой стороны грудной клетки, и 10 самок и 10 самцов инфицированных В.burgdorferi ss клещей I.Scapularis помещали в резиновый колпак, который закреплялся на обритой площади лентой и перевязывался бинтом. Клещам позволяли питаться в течение 7 дней.

- Обнаружение В. burgdorferi ss у клещей

Ротовые части клещей удаляли скальпелем, и средние кишки вырывались и размазывались на предметные стекла. Им давали возможность высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. После сушки предметные стекла фиксировали в ацетоне в течение 8-10 мин и высушивали на воздухе. Видоспецифическое мышиное OspA моноклональное антитело Н5332 разводили 1:49 в PBS (рН 7,2) и покрывали козлиным антимышиным меченым флуоресцеин-изотиоцианатом IgG антителом, разведенным 1:500 в PBS. После инкубирования предметные стекла очищали PBS, сушили на воздухе и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Каждое предметное стекло независимо исследовалось двумя опытными микробиологами.

- Удаление OspA антител

Рекомбинантные (r)OspA получали из Escherichia coli ("f. coli") DH5α, экспрессирующего OsрА-глутатион-S-трансферазный слитый белок, как описано ранее (Callister et al., J.Infect. Dis. 1993, 167: 158-164). Если коротко, Е. Coli культивировали при 37°С в 2xTY бульоне, содержащем ампициллин, и во время фазы экспоненциального роста добавляли изопропил-β-d-галактопиранозид ("IPTG") (0,1 мМ). Клетки пеллетировали центрифугированием, ресуспендировали в солевом фосфатном буфере ("PBS") и лизировали с помощью ультразвука. Добавляли Triton Х-100 (1% об./об.), и лизат центрифугировали при 10000 × g в течение 5 минут (мин). Затем супернатант, содержащий слитый белок, пропускали через глутатион-сефароза 4 В колонку (Pharmacia), и рекомбинантаый OspA элюировали с помощью 50 мМ Tris-Cl (pH 8,0) плюс 5 мМ восстановленного глутатиона и ресуспендировали в буфере для очистки (50 мМ Tris [pH 8], 50 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0,1 Triton X-100).

rOspA слитый белок затем связывали с Sepharose 4В посредством цианбромидной (CNBr) активации. Конкретно, 0,8 г CNBr-активированную Sepharose 4B (Pharmacia) промывали связывающим буфером (0,1 М NaHCO3 - 0,5 М NaCl, pH 8,3), 2 мг OspA в связывающем буфере добавляли в гель, и смесь мягко встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После двукратного добавления в гель связывающего буфера добавляли 4 мл этаноламина (pH 9), и гель инкубировали в течение 2 часов, чтобы заблокировать несвязанные участки. Гель трижды промывали 50 мл 0,1М ацетата натрия-0,5 М NaCl (pH 4,0) и затем уравновешивали в PBS. 1 мл образца иммунной сыворотки, десятикратно разведенной в PBS, пропускали через колонку четыре раза.

- Удаление OspC антител

Слитый белок, содержащий 7 С-концевых аминокислот OspC (OspC7) получали из Е.Coli JM109, содержащего рХТ7, как описано ранее (Lovrich et al., din. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751, включена здесь во всей полноте в качестве ссылки). Продуцирование рекомбинантного белка индуцировали как описано выше для rOspA. Обработанные ультразвуком клетки Е. Coli затем пеллетировали центрифугированием, и супернатант пропускали через колонку, содержащую SoftLink полимер (Promega), который связывал OspC7 через очищенный биотинилированный тэг на амине-конце. Связанный OspC7 затем элюировали буфером для очистки, который содержал также 5 мМ биотин (Sigma). 1 мл объема тетрамерного авидинового полимера Tetralink (Promega) затем промывали, суспендировали в 40 мл PBS и нагружали на 10 мм 70 мм-полипропиленовой колонки, 0,5 мг диализированного rOspC в 1 мл объеме PBS пропускали через колонку и связывание подтверждали белковым анализом (Bio-Rad). 1 мл объем иммунной сыворотки, десятикратно разведенной в PBS, пропускали через колонку четыре раза.

- Обнаружение боррелиацидных антител

OspA и OspC боррелиацидные антитела обнаруживали проточной цитометрией, используя В. burgdorferi ss S-1-10 и 50772, как описано выше в Примерах 1 и 2.

- Кожная биопсия

Кожную биопсию брали из мест, соседних с местом прикрепления клеща, на дни исследования 76, 106, 134, 162 и 197 с помощью одноразового 4 мм пункционного устройства. Биопсии помещали в отдельные пробирки, содержащие 9 мл BSK (Callister et al., J. din. Microbiol. 1990, 28: 363-365), дополненного желатином (BSK+G), 40-50 микрограмм (мкг)/мл рифампина и 8 мкг/мл канамицина. Культуры инкубировали при 35±2°С в течение 3 недель и еженедельно исследовали темнопольной микроскопией на спирохеты.

- Иммунная супрессия

У собак подавляли иммунитет ежедневным введением дексаметазона (0,4 мг/фунт веса тела) в течение 5 дней, начиная с 13 недель после вакцинации.

- Клинические наблюдения

Собаки наблюдались ежедневно на повреждения конечностей/суставов, включая скованность (трудность в перенесении полного веса на конечности), ковыляние (оберегание конечности при ходьбе или беге) или прихрамывание (невыдерживание веса). Подсчет делали по согласию, по меньшей мере, двух наблюдателей, и собак исследовали по Лечащему Ветеринару (Attending Veterinarian), чтобы исключить причинение каких-либо других не относящихся к предмету исследования повреждений.

- Вскрытие:

Собак, которые имели нарушения в конечностях/суставах в течение, по меньшей мере 3 последовательных периодов наблюдения, эвтаназировали и вскрывали. Образцы тканей из локтя, запястья, колена, предплюсны, сердца, селезенки, мочевого пузыря и обеих почек собирали и обрабатывали для выделения В. burgdorferi посредством культивирования. Ткани суставов культивировали в индивидуальных пробирках, содержащих 9 мл BSK+G. Другие ткани (сердца, селезенки, мочевого пузыря и почек) комбинировали с 9 мл BSK+G, полностью гомогенизированной гомогенизатором Stomacher, и 1 мл количество переносили в отдельную пробирку, содержащую свежую BSK+G. Культуры инкубировали при 35±2°С.

Остальных собак эвтаназировали и вскрывали в конце исследования. Образцы тканей из этих собак собирали из суставной капсулы и сухожилия локтя, запястья, колена и предплюсны и хранили в 10% забуференном формалине для гистопатологического исследования. Кроме того, образцы из суставных капсул локтя, запястья, колена и предплюсны помещали в индивидуальные пробирки, содержащие 9 мл BSK+G или BSK+G с антибиотиками, и инкубировали при 35±2°С в течение 3 недель.

- Western-блоттинг

Western-блоттинг проводили, используя стандартные методики. В. Burgdorferi ss 297 кипятили в буфере для образца в течение 5 мин, и 150 мкг общего белка нагружали на 0,1% SDS-12% полиакриламидный гель (4% полиакриламидный концентрирующий гель без гребня). Концентрации белков определяли с помощью набора для определения белков, и два геля одновременно ставили в электрофорезный блок. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозу, и нитроцеллюлозу разрезали на полоски и блокировали PBS-0,3% TWEEN 20 в течение 30 мин при 22°С. Полоски инкубировали в течение 1 часа при 22°C с собачьей сывороткой, разведенной 1:100, и промывали три раза PBS-0,5% TWEEN 20. Добавляли меченый пероксидазой хрена анти-собачий IgG (Kirkegaard & Реrrу Laboratories, Gaithersburg, MD), и полоски инкубировали в течение 30 мин при 22°С до развития с помощью ТМВ Мембранной пероксидаз-субстратной системы (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

- Безопасность вакцины

Собаки оставались клинически нормальными после вакцинации, в том числе у них не наблюдалось увеличение ректальной температуры. У собак, привитых вакциной, действительно развивалась легкая припухлость в месте инъекции, которая исчезала в пределах 8 дней. Самая большая измеренная реакция - 1×1×0,5 см (24 часа после вакцинации).

- Поствакцинационная серология

Вакцинация плацебо не индуцировала антитела, специфические для В.burgdorferi ss. В противоположность этому, вакцинация вакциной индуцировала значительные уровни боррелиацидных антител, обнаруженных при использовании изолятов S-1-10 и 50772 В.burgdorferi ss. Средний титр боррелиацидных антител, обнаруженных при использовании S-1-10, был на пике в течение недели после повторной вакцинации (день исследования 28) и оставался обнаруживаемым на день исследования 197 (Таблица 6, далее). Аналогично, высокие концентрации боррелиацидных антител, специфических для изолята 50772, присутствовали на день исследования 28 и оставались повышенными на день исследования 43 и обнаруживаемыми на день исследования 197 (Таблица 7, далее).

Таблица 6
Средние титрыa (n=15) боррелиацидной активностиb после вакцинации вакциной
Группа День 3 День 21 День 28 День 35 День 43 День 78 День 106 День 134 День 162 День 197
Вакцинирован
ные
HOc >211 >8128 >6160 >4889 1404 970 970 1016 220
Контроль НО НО НО НО НО НО НО НО НО НО
аРеципрокное разведение.
bОбнаружено в тесте боррелиацидных антител с помощью В. burgdorferi ss S-1-10.
cНО = Не обнаружено.
Таблица 7
Средние титрыa (n=15) боррелиацидной активности после вакцинации вакциной
Группа День 3 День 21 День 28 День 35 День 43 День 78 День 106 День 134 День 162 День 197
Вакцинирован
ные
HOc НО 1470 884 221 50 48 46 42 42
Контроль НО НО НО НО НО Н/Пd Н/П Н/П Н/П Н/П
аРеципрокное разведение.
bОбнаружено в тесте боррелиацидных антител с помощью В. burgdorferi ss 50772.
cНО = Не обнаружено.
dН/П = He применялся.

- Подтверждение боррелиацидных OspA и OspC антител

Чтобы подтвердить, что боррелиацидная активность была обусловлена боррелиацидными OspA и OspC антителами, иммунные сыворотки от пяти собак, вакцинированных вакциной, пропускали через отдельные колонки, содержащие rOspA и rOspC, и исследовали влияние на боррелиацидную активность. Удаление OspA-специфических и OspC-специфических антител посредством поглощения сывороток рекомбинантными белками значительно (≥ 4-кратное уменьшение) понижало боррелиацидную активность, обнаруживаемую с использованием изолятов В.burgdorferi ss S-1-10 и 50772, соответственно. Собранные данные, таким образом, подтверждали, что вакцина индуцировала значительные уровни боррелиацидных OspA и OspC антител, и боррелиацидные активности, обнаруженные с помощью В. burgdorferi ss S-1-10 и 50772, являлись почти полностью специфическими боррелиацидными OspA и OspC антителами, соответственно. См. ниже Таблицу 8.

Таблица 8
Влияние удаления OspA и OspC антител на боррелиацидную активность в сыворотках от собак (n=5), вакцинированных вакциной
Титрa боррелиацидных антител
OspAb OspCc
Сыворотка до поглощения после поглощения до поглощения после поглощения
1 5120 160 5120 640
2 2560 160 5120 320
3 10240 НОd 5120 320
4 2560 НО 1280 160
5 1280 80 2560 320
OspA контроль 2560 НО - -
OspC контроль - - 2560 НО
аРеципрокное разведение.
bСыворотки, собранные на день исследования 43.
cСыворотки, собранные на день исследования 28.
dНО = Не обнаружено.

- Подтверждение боррелиацидных OspC-специфических антител

Чтобы подтвердить, что боррелиацидные OspC антитела содержали значительную долю боррелиацидных антител, специфических для OspC7, иммунные сыворотки от пяти собак, вакцинированных вакциной, пропускали через колонку, содержащую rOspC7, и исследовали влияние на боррелиацидную активность. Удаление ОsрС7-специфических антител посредством поглощения сывороток рекомбинантным OspC7 белком значительно (2- - 4-кратное уменьшение) понижало боррелиацидную активность, обнаруживаемую с использованием изолята В. burgdorferi ss 50772. Таким образом, данные экспериментов подтверждали, что вакцина индуцировала значительные уровни боррелиацидных OspC антител, специфических для консервативного OspC7 эпитопа. См. ниже Таблицу 9.

Таблица 9
Влияние удаления OspC7 антител на боррелиацидную активность в сыворотках от собак (n=5), вакцинированных вакциной
Титрa боррелиацидных антител
Сыворотка до поглощения после поглощения
1 20480 5120
2 10240 5120
3 10240 2560
4 5120 2560
5 10240 2560
OspC контроль 2560 НО
аРеципрокное разведение.
bСыворотки, собранные на день исследования 28.
cНО = Не обнаружено.

- Способность боррелиацидных OspA и OspC антител стерилизовать инфицированных клещей

Исследование средней кишки клещей, которые реагировали на вакцинированных или контрольных собак, подтверждало, что боррелиацидные OspA и OspC антитела, индуцируемые вакциной, стерилизовали клещей. В.burgdorferi ss обнаруживали в мазках 34 клещей (32%) из 106 самок клещей, которые питались на 13 из 15 плацебо-вакцинированных собаках (см. ниже Таблицу 10). В противоположность этому, никаких спирохет (0-99) не обнаруживалось в средней кишке самок клещей, которые питались на собаках, вакцинированных вакциной (p<0,0001).

Таблица 10
Обнаружение В.burgdorferi ss у самок клещей, собранных с вакцинированных или контрольных собак
Обрабатываемая группа Обработанные самки клещей (наполненные или ненаполненные кровью) Положительные мазки для В.burgdorferi Общее кол-во положительных собак
Вакцинированные 99/151 (61%) 0/99 (0%) 0/15
Контрольные 106/148 (64%) 34/106 (32%) 13/151*
*p<0,0001

- Способность вакцины предотвращать восстановление В.burgdorferi ss из кожи

Индуцированные вакциной боррелиацидные антитела также предотвращали образование колоний спирохет на коже. В.burgdorferi ss получали от 56 (79%) из 71 биопсий, собранных от плацебо-вакцинированных собак через месячные интервалы после инфицирования клещом (Таблица 11, далее), и спирохеты получались, по крайней мере, из 14 кожных биопсий от 15 собак. В противоположность этому, В.burgdorferi ss не получались из каких-либо кожных биопсий, собранных от собак, вакцинированных вакциной (p<0,0001).

Таблица 11
Выделение В. burgdorferi ss из кожи вакцинированных или невакцинированных контрольных собак
Обрабатываемая группа День 78 День 106 День 134 День 162 День 197 Общее кол-во положительных биопсий Общее кол-во положительных собак
Вакцинированные 0/15 0/15 0/15 0/15 0/13 0/73 (0%) 0/15 (0%)
Контрольные 12/15 13/15 11/15 11/14 9/12 56/71 (79%) 14/15* (93%)
p<0,0001

- Способность вакцины предотвращать серологическое проявление инфекции

Вакцина также предотвращает развитие специфических к лаймской болезни антител. Предшествующее исследование (SPAHC Report В01-184-01R) подтвердило, что инфицирование В. burgdorferi ss достоверно индуцировало собачьи антитела, которые связывают приблизительно 20 кДа белок, и ответ не вызывался вакциной (Фиг.1). В настоящем исследовании антитела, которые связывают инфекционно-специфический 20 кДа белок, легко обнаруживали в иммунных сыворотках от 14 (93%) из 15 плацебо-вакцинированных контрольных собак (Фиг.2А). Кроме того, сыворотку, которая не содержала каких-либо антител к 20 кДа белку, собирали от контрольной собаки, у которой также не содержалось спирохет в коже. В противоположность этому, антитела к 20 кДа белку не продуцировались (p<0,0001) собаками, вакцинированными вакциной (Фиг.2В).

Кроме того, собаки с лаймской болезнью продуцируют не-OspC боррелиацидные антитела, которые также обнаруживаются с помощью изолята 50772 В.burgdorferi ss (Callister et aL, J. Clin. Microbiol. 2000, 38: 3670-3674). Специфическая мишень ответа неизвестна, но антитела обеспечивают высоко специфическое серодиагностическое подтверждение инфекции. Собаки, вакцинированные вакциной, продуцировали боррелиацидные OspC антитела, ни у одной собаки не развивалось значительного (≥4-кратного) увеличения уровня В. burgdorferi ss 50772-специфических боррелиацидных антител после инфицирования клещом. Таким образом, весьма невероятно, что вакцинированные собаки были инфицированы спирохетами. В противоположность этому, боррелиацидные антитела не продуцировались плацебо-вакцинированными собаками до инфицирования, хотя 10 (67%; р=0,0002) из 15 собак, показывали значительные уровни (титры ≥1:640) боррелиацидных антител, обнаруживаемых использованием В.burgdorferi ss 50772 после того, как клещам дали возможность питаться (см. ниже Таблицу 12).

Таблица 12
Средние титрыa боррелиацидных антителb после инфицирования клещом
Обрабатываемая группа День 78 День 106 День 134 День 162 День 197 Общее число собак с увеличенным титром
Вакцирированные 50 48 46 42 42 0/15
Контрольные >121 >463 >640 >390 >403 10/15*
*р=0,0002
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженное при использовании В.burgdorferi ss 50772.

- Способность вакцины предотвращать выраженные нарушения в конечностях/суставах

Предшествующие исследования (Summers et al., J. Соmр. Path. 2005, 133: 1-13, Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med, 2006, 4:23-28) показали, что инфицирование В. burgdorferi ss редко вызывает выраженные нарушения в конечностях/суставах (например, опухание, хромоту), и наши данные подтверждают это. Только у 1 (8%) плацебо-вакцинированной контрольной собаки появилось суставное нарушение. Левая передняя лапа была тугоподвижной 9 недель спустя поражения клещом, и В.burgdorferi ss спирохеты находили в локте. Тем не менее, эти данные не являлись значимыми, поскольку две собаки, вакцинированные вакциной, также показали тугоподвижность в одной или более конечностях, но, в противоположность собаке, которая получила плацебо, спирохеты не были обнаружены ни в каких тканях.

Для усиления развития выраженных симптомов остальных собак подвергали иммуносупрессии. Параллельно, три плацебо-вакцинированные контрольные собаки стали хромать, и из двух из этих трех собак получали В.burgdorferi ss. В противоположность этому, ни у одной из иммуносупрессированных собак, вакцинированных вакциной, хромота не развилась. Таким образом, полученные сведения дают основание полагать, что вакцина предотвращала развитие лаймского артрита, хотя результаты были не значимыми (р=0,0996). Тем не менее, смотрите дополнительные сведения, представленные и обсуждаемые ниже.

- Способность вакцины предотвращать эрозивные изменения, связанные с инфицированнем В.burgdorferi ss

Когда суставы собак, обсуждаемых выше, исследовали микроскопически, тем не менее, данные ясно демонстрировали эффективность вакцины. Суставные капсулы остальных собак (n=13), вакцинированных вакциной, были нормальными. В противоположность этому, одна или более суставных тканей из 6 (р=0,0034) от остальных плацебо-вакцинированных контрольных собак (Таблица 7, выше) имела значительное воспаление, характеризующееся инфильтацией нейтрофилов и мононуклеарных клеток (Фиг.3). Более того, В. burgdorferi ss не получали из каких либо тканей от собак, вакцинированных вакциной, но спирохеты получали из суставных тканей от 5 (83%) из 6 плацебо-вакцинированных контрольных собак с эрозивными изменениями. Собранные данные, поэтому, подтверждали, что вакцина предотвращала лаймский артрит собак, и также согласовывались с предыдущими сообщениями, что данный синдром характеризуется весьма часто субклиническими синовитами (Summers et al., J. Соmр. Path. 2005, 133: 1-13; Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28).

ПРИМЕР 7

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ПРИРОДЕ БОРРЕЛИАЦИДНЫХ АНТИТЕЛ, НАПРАВЛЕННЫХ НА OSPC7 ЭПИТОП

Данные, подтверждающие, что боррелиацидные антитела, вызываемые у млекопитающих против OspC7, являющиеся специфическими, получены с помощью анализа сывороток от особей (человека) с и без истории лаймской болезни или связанных с лаймской болезнью симптомами, и представляют собой следующее.

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Сыворотки:

Нормальные сыворотки от особей без какой-либо предшествующей истории (chart-review) лаймской болезни или связанных с лаймской болезнью симптомами (n=36), не характеризовали сыворотки из крови доноров (n=100) или особей, подвергшихся холестериновым скринингам (n=100), или сыворотки от добровольцев с факторами крови или болезни, которые обычно перекрестно-реактивны с В.burgdorferi ss антигенами, включая антиядерные антитела (n=20), ревматоидный фактор (n=20), мононуклеоз (n=10), цитомегаловирус (n=10), сифилис (n=13) или Rocky Mountain spotted fever (n=4), были из архивных образцов, хранимых при 20°С. Сыворотки лаймской болезни собирали от пациентов, исследованных в Gundersen Lutheran Medical Center, в течение 2003 или 2004 г.г. Сыворотки (n=86) от пациентов с эритемными проявлениями (ЕМ), которые соответствовали CDC surveillance критериям (Center for Disease Control and Prevention. Morb. Mort. Wkly. Rep.1990, 39: 19-21), были классифицированы как вероятные лаймские, сыворотки (n=22) от пациентов с укусами клещей и атипическими повреждениями кожи были классифицированы как вероятные лаймские (n=49), и сыворотки от пациентов с укусом клеща и конституциональными симптомами, которые включали первичную головную боль, лихорадку, миалгию и артралгию, были классифицированы как возможные лаймские. Сыворотки собирали во время первоначального посещения, хранили при -20°С и затемняли до тестирования.

OspC7 пептид. 7 аминокислот OpsC7 пептида (AESPKKP; SEQ ID NO: 1) синтезировали в University of Wisconsin Biotechnology Center (Madison, WI), используя автоматический синтезатор (Protein Technologies) и Fmoc метод (Fields, et al., Peptide Res. 1991, 4: 95-101). После синтеза аминотерминальный конец пептида биотинилировали вручную посредством HBTU и очищали с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Состав подтверждали, используя времяпролентную масс-спектромертию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) (предсказанная масса 1095,4; наблюдаемая масса 1095,8).

OspC7 ELISA. Индивидуальные лунки микротитровальных планшетов (Immunolon 2HB, Thermo Labsystems, Franklin, MA) покрывали 100 мкл 4 мкг/мл суспензии стрептавидина (Pierce, Rockland, IL), содержавшегося в карбонатном буфере (90 мМ NaHCO3, 60 мМ Na2CO3, pH 9,6), и инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубирования, планшеты промывали пять раз забуференной Tris солью (TBS-T; 13 мМ Tris HCl, 3 мМ Tris основы, 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl; pH 7,4), содержащей 0,05% Tween 20. После промывки 200 мкл блокирующего буфера (15 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl, 3% зародышевой бычьей сыворотки, 0,05 Tween 20), содержащего 1 мкг/мл биотинилированного OspC7 пептида, добавляли в каждую лунку и инкубировали с вращением (150 об/мин) в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза TBS-T и подвергали реакции со 100 мкл количествами сывороток, разведенных 1:200 в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Вторичное антитело было пероксидаз-конъюгированным козлиным анти-человечьим IgM и IgG (Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, Md.), разведенными 1/15000 в блокирующем буфере. После инкубирования в течение одного часа связанное вторичное антитело определяли количественно добавлением о-фенилендиамина и перекиси водорода в цитратном буфере (Sigma, St. Louis, Mo.) и определением оптической плотности (OD) при 490 нм (SpectraMax 250; Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.).

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

Согласно предшествующим исследованиям (Jobe et al., Clin. Lab. Immunol. 2003, 10:573-578, Lovrich et al., Clin. Lab. Immunol. 2005, 12: 746-751), высококонсервативный эпитоп иммунодоминантного боррелиацидного OspC антитела локализован в пределах области 7 аминокислот, ближайших к С-концу (OspC7). Чтобы подтвердить, что эпитоп индуцирует антитела, специфические к заражению Borrelia spp., сравнивали реактивности ELISA, в котором использовался OspC7, из сывороток от пациентов с лаймской болезнью (Фиг.5) и сывороток от нормальных субъектов или пациентов с другими болезнями, у которых вероятно продуцирование антител, которые также могли бы связываться с белками Borrelia spp.(Фиг.4). На фиг.4 и 5 линия на поглощении 1.25 определяет три стандартных отклонения от среднего поглощения нормальной и потенциально перекрестно-реактивной сывороток. Любые результаты, которые попадают выше линии, следовательно, имеют 99% вероятность, что реактивность значительна (истинно положительные). В нормальной и потенциально перекрестно-реактивной сыворотках значительная реактивность обнаруживалась очень редко (Фиг.4). Следует заметить, что большинство положительных результатов было получено с использованием сывороток, которые могли бы быть получены от пациентов с лаймской болезнью, поскольку сыворотки (CS) получали от группы из 100 пациентов, наблюдаемых в Gundersen Lutheran Medical Center no множеству заболеваний. Эта область является высокоэндемичным локусом лаймской болезни, и личности, и клинические истории пациентов не были известны. В противоположность этому, положительные сыворотки не были обнаружены в образцах сыворотки (n=100), собранных случайным образом от доноров крови (BD) в Milwaukee, не эндемической области штата Висконсин. Кроме того, положительные результаты (более 3 стандартных отклонений от средних сывороток, которые должны быть нереактивными - Фиг.4) обнаруживались обычно в сыворотках от пациентов с лаймской болезнью, и величины поглощения были высокими (Фиг.5). Таким образом, собранные данные подтверждают высокую специфичность антител, направленных против OspC7 эпитопа, и иммунодоминантность ответа во время лаймского заболевания человека.

Учитывая приведенные выше в качестве примера данные, группы (15 собак) щенков 8-недельного возраста вакцинировали и повторно иммунизировали вакциной, которая содержала 5,0×108 В.burgdorferi ss 50772, 2,5×107 В.burgdorferi ss S-1-10 и 5% Emulsigen®. Вакцина вызывала легкое опухание в месте инъекции, которое быстро проходило. Более существенно, что вакцина индуцировала высокие концентрации боррелиацидных OspA и OspC антител, пик которых достигался неделю спустя после повторной иммунизации и которые оставались обнаруживаемыми на протяжении исследования. Кроме того, значительная доля OspC боррелиацидных антител была специфической для высоко консервативного эпитопа в пределах OspC7. Инфицированным В.burgdorferi ss самкам клещей I. scpularis затем позволяли питаться на вакцинированных собаках, и исследование средних кишок из клещей подтвердило, что боррелиацидные OspA и OspC антитела в высасываемой крови полностью уничтожали В. burgdorferi ss. Конкретно, В.burgdorferi ss были обнаружены у 34 (32%) клещей, собранных с контрольных собак, вакцинированных плацебо, и не были обнаружены у клещей (n=99), которые питались на собаках, вакцинированных вакциной (р<0,0001). Кроме того, вакцинированные пациенты оставались отрицательными по лаймской болезни по нескольким косвенным и прямым методам, используемым обычно для подтверждения инфекции. В противоположность этому, 10 (67%) контрольных собак продуцировали антитела против «инфекция-специфического» 20 кДа В. burgdorferi ss белка и 8 (53%) продуцировали «инфекция-специфические» боррелиацидные антитела. Более того, четыре (27%) собаки приобрели стойкую хромоту, и В. burgdorferi ss были обнаружены в суставах 3 (75%) из 4 хромающих животных. Кроме того, в суставных капсулах 6 (55%) из 11 исследованных плацебо-вакцинированных собак образовались воспалительных инфильтраты. Еще более убедительно, что В. burgdorferi ss были обнаружены в коже и суставах 14 (93%) и 8 (53%) контрольных собак, соответственно, в то время как спирохеты не были обнаружены у собак, вакцинированных тестируемым продуктом. Таким образом, вакцина против лаймской болезни собак согласно изобретению вызывала минимальные побочные эффекты и обеспечивала полную защиту против инфицирования В. burgdorferi ss.

ПРИМЕР 8

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ИММУНИТЕТА ВАКЦИНЫ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ ИЗОЛЯТЫ S-1-10 И 50772 В. BURGDORFERI SS

А. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

- Животные

Материалы и методы описаны выше в Примере 6.

- Вакцинация и сбор сывороток

Собак вакцинировали подкожно в шею 1 мл дозой вакцины и повторно вакцинировали дополнительной 1 мл дозой через 21 день. Всю кровь собирали до первой (день исследования 4) и повторной вакцинации (день исследования 21), а также в дни исследования 28, 35, 49, 79, 114, 142, 175, 210, 238, 302, 322, 357 и 394 посредством венепункции яремной вены. Сыворотки отделяли центрифугированием и хранили при -20°С до тестирования.

- Поствакцинационные наблюдения

Собаки наблюдались ежедневно.

- Заражение клещом

Год спустя после второй вакцинации собак обривали на правой стороне грудной клетки, и 10 самок и 10 самцов инфицированных В. burgdorferi ss клещей I.Scpularis помещали в резиновую чашку, которая была прикреплена к обритой области лентой и перевязана бинтом. Клещам позволяли питаться в течение 7 дней.

- Обнаружение В.burgdorferi ss у клещей

Обнаружение производили способом, описанным выше в Примере 6.

- Образцы крови

Всю кровь собирали в транспортные пробирки для сепарации сыворотки (SST) в дни исследования 43 после нанесения клещей (PC), 77 PC, 112 PC, 147 PC, 174 PC и 241 PC, и сыворотку сепарировали и хранили при -20°С до тестирования.

- Обнаружение боррелиацидных антител

OspA и OspC боррелиацидные антитела обнаруживали проточной цитометрией, как описано выше в Примерах 1 и 2.

- Кожные биопсии

Кожные биопсии брались из мест, смежных с присоединениями клещей, в дни исследования 43 после нанесения клещей (PC), 77 PC, 112 PC, 147 PC, 174 PC и 241 PC с помощью одноразового 4 мм пункционного устройства. Биопсии обрабатывали, как описано выше в Примере 6.

- Иммунная супрессия

У собак подавляли иммунитет ежедневным введением дексаметазона (0,4 мг/фунт веса тела) в течение 5 дней, начиная приблизительно с 20 недель после нанесения клещей.

- Клинические наблюдения

Клинические наблюдения производили, как описано выше в Примере 6.

- Вскрытие

Вскрытие производили, как описано выше в Примере 6.

В. РЕЗУЛЬТАТЫ

- Поствакционная серология:

Вакцинация плацебо не индуцировала антитела, специфические для В. burgdorferi ss. В противоположность этому, вакцинация вакциной индуцировала значительные уровни боррелиацидных антител, обнаруживаемых при использовании изолятов S-1-10 и 50772 В. burgdorferi ss. Средний титр боррелиацидных антител против S-1-10 достиг пика спустя неделю (день исследования 28) после повторной вакцинации, и ответ оставался обнаруживаемым до дня исследования 394 (Таблица 13). Аналогично, высокие концентрации боррелиацидных антител, специфических для изолята 50772, обнаруживали на день исследования 28, титры оставались повышенными на день исследования 49, а низкие уровни оставались обнаруживаемыми спустя 79 дней (Таблица 14).

Таблица 13
Средние титрыa (n=15) боррелиацидной активностиb после вакцинации вакциной
Группа День 4 День 21 День 28 День 35 День 49 День 79 День 114 День 142
Вакцинирован
ные
HOc 192 >7075 >5120 >4457 735 956 532
Котрольные НО НО НО НО НО НО НО НО
Группа День 175 День 210 День 238 День 266 День 302 День 322 День 357 День 394
Вакцинирован
ные
702 611 926 557 508 351 211 175
Котрольные НО НО НО НО НО НО НО НО
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженные с использованием теста боррелиацидных антител В. burgdorferi ss S-1-10.
cНе обнаружено.
Таблица 14
Средние титрыa (n=15) боррелиацидной активностиb после вакцинации вакциной
Группа День 4 День 21 День 28 День 35 День 49 День 79 День 114 День 142
Вакцинированные HOc 40 1689 532 69 41 НО НО
Котрольные НО НО НО НО НО НО НО НО
Группа День 175 День 210 День 238 День 266 День 302 День 322 День 357 День 394
Вакцинированные НО НО НО НО НО НО НО НО
Котрольные НО НО НО НО НО НО НО НО
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженные с использованием теста боррелиацидных антител В.burgdorferi ss 50772.
cНе обнаружено.

- Способность OspA и OspC боррелиацидных антител стерилизовать инфицированных клещей

Исследование средней кишки клещей, которые питались на вакцинированных или контрольных собаках, подтвердили, что OspA и OspC боррелиацидные антитела, индуцируемые вакциной, стерилизовали клещей. В.burgdorferi ss были обнаружены в мазках клещей 15 (16%) из 95 самок клещей, которые питались на 12 из 15 плацебо-вакцинированных собаках (Таблица 15). В противоположность этому, В.burgdorferi ss были обнаружены в мазках клещей только 2 (3%) из 75 самок клещей, которые питались на 2 из 15 вакцинированных собаках (р=0,0003).

Таблица 15
Обнаружение В.burgdorferi ss у самок клещей, снятых с вакцинированных или контрольных собак
Лечебная группа aОбработанные самки клещей Мазки, положительные на В.burgdorferi Общее число положительных собак
Вакцинированные 75/148 (51%) 2/75 (3%) 2/15
Контрольные 95/46 (65%) 15/95 (16%) 12/15*
*р=0,0003
aНаполненные и не наполненные кровью.

- Способность вакцины предотвращать получение В. burgdorferi ss из кожи

Индуцируемые вакциной боррелиацидные антитела предотвращали также долговременную инфекцию В.burgdorferi в коже. В.burgdorferi ss получили из 33 (44%) из 75 биопсий, собранных от плацебо-вакцинированных собак в месячные интервалы, после нанесения клещей (Таблица 16). В противоположность этому, В.burgdorferi ss получили только из 6 (8%) из 75 биопсий, собранных от собак, вакцинированных вакциной (p<0,0001). Спирохеты были получены, по крайней мере, из одной кожной биопсии от 10 (67%) из 15 контрольных собак, по сравнению с 6 (40%) из 15 вакцинированных собак. Однако выделения из вакцинированных собак были ограничены только первым месяцем после нанесения клещей, в то время как 8 (80%) из контрольных собак с положительной реакцией имели В.burgdorferi-положительные биопсийные культуры на протяжении всех последующих месяцев исследования.

Таблица 16
Выделение В.burgdorferi ss из кожи вакцинированных и невакцинированных контрольных собак
Лечеб
ная группа
День 43 PC День 77 PC День 112 PC День 147 PC День 174 PC Положительные биопсии(общее)b Собаки положительные (общее)c Собаки положительные (общее)c
Вакцинирован
ные (А)
6/15 0/15 0/15 0/15 0/15 6/75 (8%) 6/15 (40%) 0/6 (0%)
Конт
рольные (В)
9/15 8/15* 7/15a* 6/15* 3/15 33/75** (44%) 10/15 (67%) 8/10 (80%)
aОдна новая собака.
bОбщая положительная биопсия.
cОбщее число положительных собак.
dОбщее число положительных собак после первого месяца.
*p<0,05
**p<0,0001

- Способность вакцины предотвращать серологическое проявление инфекции

Вакцина также предотвращала развитие специфических для лаймской болезни антител. Собаки с лаймской болезнью продуцируют не-OspC боррелиацидные антитела, которые также обнаруживаются при использовании изолята 50772 В.burgdorferi ss (как описано в Примере 6). Значительные повышенные уровни (≥4-кратное увеличение) боррелиацидных антител против 50772 наблюдалось после нанесения клещей у 5 (33%) из 15 плацебо-вакцинированных контрольных собак по сравнению с 0 собак, вакцинированных тестовой вакциной.

Таблица 17
Средние титрыa боррелиацидных антителb после нанесения клещей
Лечебная группа День 43 PC День 77 PC День 112 PC День 147 PC День 174 PC Общее число собак с повышенными титрами
Вакцинирован
ные
40 40 40 40 40 0/15
Контрольные 48 66 88 88 106 9/15c
аРеципрокное разведение.
bОбнаруженное при использовании В.burgdorferi ss 50772.
с≥4-кратное увеличение титра.

- Способность вакцины предотвращать выраженные нарушения конечностей/суставов и эрозивные изменения, связанные с инфицированием В.burgdorferi ss

Предшествующие исследования показывали, что инфицирование В.burgdorferi ss очень редко вызывает нарушения конечностей/суставов (Пример 6), и модель клещевого заражения показала, что является менее эффективной для собак старшего возраста. Для усиления развития выраженных симптомов иммунитет собак подавляли дексаметазоном приблизительно через три месяца после нанесения клещей. Четыре плацебо-вакцинированные собаки либо стали хромать, либо у них развились эрозивные повреждения в суставной ткани. В противоположность этому, ни у одной из собак, вакцинированных вакциной согласно настоящему изобретению, не появилось никаких признаков нарушений в конечностях/суставах или эрозивных повреждений, часто наблюдаемых в суставной ткани.

Настоящее изобретение не ограничивается в объеме раскрытыми здесь конкретными воплощениями. Действительно, специалистам в данной области техники станут очевидными различные модификации изобретения в дополнение к раскрытому в предшествующем описании. Подразумевается, что такие модификации попадают в объем прилагаемых пунктов притязаний.

Также следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот, а также величины молекулярного веса и молекулярных масс, приведенных для нуклеиновых кислот и полипептидов, являются приблизительными и даны для описания.

Раскрытие различных цитированных выше публикаций включено здесь во всей их полноте в качестве ссылки.

1. Вакцинная композиция против лаймской болезни собак, содержащая иммунологически эффективное количество организмов из первого штамма геновида Borrelia и иммунологически эффективное количество организмов из второго штамма геновида Borrelia; где организмы упомянутого второго штамма проявляют OspA антиген, OspB антиген, или проявляют оба антигена OspA и OspB на поверхности своей клетки; и где введение указанной вакцинной композиции собаке вызывает значительные уровни боррелиацидных антител против В.burgdorferi 50772 (АТСС No. PTA-439).

2. Вакцинная композиция по п.1, где упомянутый первый штамм представляет собой В.burgdorferi ss 50772 (АТСС No. PTA-439).

3. Вакцинная композиция по п.2, где второй штамм является штаммом В.burgdorferi ss S-1-10 (АТСС No. РТА-1680).

4. Вакцинная композиция по п.1, где иммунологически эффективное количество организмов из первого штамма и второго штамма инактивировано.

5. Вакцинная композиция по п.1, содержащая от около 1·104 до около 1·1010 организмов на миллилитр первого штамма и от около 1·104 до около 1·1010 организмов на миллилитр второго штамма.

6. Вакцинная композиция по п.5, включающая от около 5,0·108 до около 5·109 организмов на миллилитр первого штамма и от около 1,0·108 до около 5·108 организмов на миллилитр второго штамма.

7. Вакцинная композиция по п.1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый адъювант.

8. Вакцинная композиция по п.1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый иммуностимулятор.

9. Вакцинная композиция по п.2 или 3, содержащая иммунологически эффективное количество В.burgdorferi ss 50772 (АТСС No. PTA-439) и иммунологически эффективное количество В.burgdorferi ss S-1-10 (ATCC No. РТА-1680).

10. Вакцинная композиция по п.9, где иммунологически эффективное количество В.burgdorferi ss 50772 (АТСС No. РТА-439) и В.burgdorferi ss S-1-10 (ATCC No. РТА-1680) инактивировано.

11. Вакцинная композиция по п.10, содержащая от около 1·104 до около 1·1010 организмов на миллилитр В.burgdorferi ss 50772 и от около 1·104 до около 1·1010 организмов на миллилитр В.burgdorferi ss S-1-10.

12. Вакцинная композиция по п.11, включающая от около 5,0·108 до около 5·109 организмов на миллилитр В.burgdorferi ss 50772 и от около 1,0·108 до около 5·108 организмов на миллилитр В.burgdorferi ss S-1-10.

13. Вакцинная композиция по п.12, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый адъювант.

14. Вакцинная композиция по п.13, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый иммуностимулятор.

15. Способ иммунизации собаки против патогенного геновида Borrelia, включающий инъекцию собаке иммунологически эффективного количества вакцины по п.1.

16. Способ иммунизации собаки против патогенного геновида Borrelia, содержащий инъекцию собаке иммунологически эффективного количества вакцины по п.10.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биохимии. .
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитостатической активностью против клеток колоректального рака.

Изобретение относится к области фармакологии, медицины и биотехнологии, конкретно к препаратам, способным связывать человеческий фактор некроза опухоли (TNF ). .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к биохимии и представляет собой человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с GM-CSF приматов и нейтрализуют его.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и к медицине. .

Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты антител, связывающих белок киназы анапластической лимфомы (ALK) человека

Изобретение относится к композициям и способам для лечения или профилактики заболеваний, нарушений или физической травмы, в которых гуманизированные антитела против сфинголипида вводят пациенту, чтобы связать нежелательные токсические сфинголипиды или их метаболиты

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС)

Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты антител, которые специфично связываются с внеклеточным доменом CD43 человека или СЕА человека, экспрессируемом негематопоэтическими злокачественными клетками
Наверх