Способ получения овомукоида


 

C07K1/36 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение
C07K1/34 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение
C07K1/30 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение
C07K1/14 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2460734:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук (ИНХС РАН) (RU)

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения овомукоида. К белку утиных яиц добавляют равный объем смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3. Отделяют образующийся осадок фильтрованием при 0-5°С. Затем добавляют к фильтрату органический растворитель в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1. Удаляют надосадочную жидкость декантированием при 0-5°С. Удаляют низкомолекулярные примеси из овомукоида ультрафильтрацией. Лиофильно высушивают овомукоид. В качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35. Изобретение способствует повышению выхода овомукоида до 1,66 г/100 мл яичного белка и увеличению степени чистоты овомукоида до 99,5%. 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу получения из белка утиных яиц овомукоида, который является эффективным ингибитором протеолитических ферментов и может быть использован для создания антипротеиназных лекарственных препаратов, биоспецифических сорбентов для удаления протеолитических ферментов из биологических жидкостей, включая кровь, для получения стабилизированных белковых препаратов и высокоочищенных протеолитических ферментов, а также для получения носителей полипептидных лекарственных препаратов с повышенной устойчивостью к действию пищеварительных ферментов.

Известен способ получения овомукоида (Авторское свидетельство СССР №1404513, Бюл. №23, 1988), который состоит в добавлении к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удалении надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удалении низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильном высушивании овомукоида. В качестве органического растворителя используют этанол, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем диализа против дистиллированной воды.

Известный способ позволяет получать овомукоид с выходом 0,89-1,06 г на 100 мл белка утиных яиц и степенью чистоты овомукоида 85-91%.

Цель изобретения - повышение выхода и степени чистоты овомукоида.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения овомукоида, который состоит в добавлении к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удалении надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удалении низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильном высушивании овомукоида, в качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем ультрафильтрации.

Пример 1

Яйца утки разбивают и отделяют белок от желтка. К 300 мл яичного белка при комнатной температуре (18-22°С) и перемешивании добавляют 300 мл смеси 107,15 мл 0.5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 193 мл смеси этанола (125,5 мл) и ацетона (67,5 мл) (объемное отношение равно 65:35). Объемное отношение водного раствора трихлоруксусной кислоты и указанного растворителя - 1:1,8.

После добавления всего количества смеси реакционную массу дополнительно перемешивают в течение 1 часа при 0°С. Выпавший осадок отфильтровывают и отбрасывают. К фильтрату добавляют 1960 мл смеси этанола и ацетона указанного выше состава при объемном отношении фильтрата к смеси этанола и ацетона, равном 3,5:1, и смесь оставляют стоять на сутки при 0°С для более полного осаждения овомукоида. Затем надосадочную жидкость удаляют декантированием при 0°С, осадок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и раствор помещают в ячейку объемом 250 мл аппарата для ультрафильтрации Amicon (США). Ультрафильтрацию проводят при давлении 3 атм в течение 1 часа, используя мембрану UM-10 (Amicon). Затем в ячейку добавляют 100 мл дистиллированной воды и операцию повторяют 3 раза до полного удаления низкомолекулярных примесей. Контроль за полнотой удаления проводят спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность промывных вод при 280 нм. Раствор овомукоида переносят в аппарат для лиофильной сушки и высушивают. Получают 4,31 г овомукоида (1,44 г на 100 мл яичного белка).

Оценку качества выделенного овомукоида проводят следующим образом. Сначала готовят раствор красителя. Для этого 60 мг Кумасси бриллиант (Coomassie Brilliant Blue G) растворяют в 50 мл этанола и перемешивают в течение нескольких часов. К раствору добавляют 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты, доводят до 1000 мл водой и фильтруют. Краску выдерживают в течение суток, а затем доводят концентрацию красителя до 0.005% (E350=0.6 для кюветы с оптическим путем 1 см). Затем к 1000 мл раствора красителя добавляют 1 мл раствора додецилсульфата натрия - SDS (3.003 г SDS/100 мл). Для проведения измерения 0.1 мл раствора овомукоида смешивают с 2 мл раствора красителя, смесь инкубируют 10-60 минут при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность раствора при 595 нм. Концентрацию овомукоида рассчитывают по предварительно построенной калибровке с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Стандартный раствор БСА получают растворением 5 мг БСА в 5 мл дистиллированной воды. Для расчета концентрации БСА измеряют оптическую плотность раствора при 280 нм и используют формулу [БСА] мг/мл=А280×1.49.

Выделенный препарат овомукоида содержит 98,9% белка и 1,1% связанной воды.

Определение степени чистоты овомукоида проводят путем изучения природы N-концевой аминокислоты (гомогенный белок должен содержать только одну N-концевую аминокислоту). 30 мкл раствора овомукоида в 0.1 М бикарбонате натрия (общее количество белка равно 1 нмоль) помещают в ампулу и добавляют 30 мкл раствора дансил хлорида (dansyl chloride) в ацетоне (6 мг/мл). Смесь инкубируют 45 минут при 37°С. Затем смесь упаривают досуха в вакууме при 50°С. К остатку добавляют 50 мкл 5,7 N HCl, содержимое ампулы замораживают жидким азотом, ампулу вакуумируют и выдерживают 16 часов при 105°С для полного кислотного гидролиза дансилированного белка. Затем ампулу вскрывают, кислоту удаляют выпариванием в вакууме при 50°С. К остатку добавляют 20 мкл воды и высушивают в тех же условиях. Затем остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и анализируют дансильные производные аминокислот HPLC в обращенной фазе на колонке Superspher RP 6 (125×2 мм, Merk, Германия), используя линейный градиент 60% ацетонитрила, содержащего 0.1% трифторуксусной кислоты.

Содержание дансил-валина составляет более 0,995 нмоль, т.е. степень чистоты овомукоида составляет более 99,5%.

Пример 2

Процесс проводят по примеру 1, используя различные соотношения компонентов. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.

Пример 3

Процесс проводят по примеру 1, используя различные соотношения компонентов и на всех стадиях вместо температуры 0°С используют температуру 5°С. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.

Примеры 4-5 (контрольные)

Процесс проводят по примеру 1, используя соотношения компонентов, лежащие вне заявленных пределах. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.

Таблица
Параметры процесса получения овомукоида и характеристики конечного продукта
№ примера Объемное отношение этанол:ацетон Объемное отношение 0.5 М раствор ТХУ*:смесь этанола и ацетона Объемное отношение фильтрат:смесь этанола и ацетона Выход овомукоида, г/100 мл яичного белка Степень чистоты овомукоида, %
1 65:35 1:1,8 3,5:1 1,44 >99,5
2 50:50 1:2,3 3,2:1 1,53 >99,5
3 40:60 1:2,0 3,0:1 1,66 >99,6
4 (к) 70:30 1:2,2 3,4:1 1,13 95,1
5 (к) 30:70 1:2,2 3,4:1 1,22 94,8
6 (прототип) Этанол=100% 1:1,8-2,3 3,0-3,5:1 0,89-1,06 85-91
* - ТХУ - трихлоруксусная кислота.

Использование предложенного способа позволяет получать овомукоид со степенью чистоты до 99,6% и выходом до 1,66 г на 100 мл белка утиных яиц. Замена диализа на ультрафильтрацию существенно ускоряет процесс выделения овомукоида (часы вместо суток) и способствует повышению выхода овомукоида. Выбор состава органического растворителя обусловлен тем, что при увеличении количества ацетона в смеси выше 60% резко снижается степень чистоты овомукоида (до 95%) при выходе до 1,2 г на 100 мл белка, а при увеличении количества этанола в смеси выше 65% снижается выход овомукоида до 1,1 г на 100 мл белка и степень его чистоты (до 95%).

Таким образом, предложенный способ позволяет более эффективно использовать сырье, то есть снизить стоимость самого овомукоида и продуктов на его основе, интенсифицировать процесс, а главное, существенно повысить степень чистоты овомукоида, то есть повысить ингибиторную активность овомукоида в расчете на единицу массы и избежать нежелательных реакций при использовании овомукоида в качестве лекарственного препарата, обусловленных большим количеством (до 9%) неидентифицированных примесей.

Способ получения овомукоида путем добавления к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделения образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавления к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удаления надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удаления низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильного высушивания овомукоида, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем ультрафильтрации.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к носителям для доставки лекарственного средства, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения фактора VII свертывания крови человека. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения предшественника гирудина. .

Изобретение относится к по существу кристаллической форме мелагатрана (I), которая находится в форме гидрата, имеет картину дифракции рентгеновских лучей на порошке, характеризующейся кристаллическими пиками с d-значениями 21,1, 10,5, 7,6, 7,0, 6,7, 6,4, 6,2, 5,7, 5,4, 5,3, 5,22, 5,19, 5,07, 4,90, 4,75, 4,68, 4,35, 4,19, 4,00, 3,94, 3,85, 3,81, 3,73, 3,70, 3,63, 3,52, 3,39, 3,27, 3,23, 3,12, 3,09, 3,06, 2,75, 2,38 и 2,35 Å и/или содержанием воды 4,3% (масс./масс.); к по существу кристаллической форме I , которая находится в форме ангидрата и имеет картину дифракции рентгеновских лучей на порошке, характеризующейся кристаллическими пиками с d-значениями 17,8, 8,9, 8,1, 7,5, 6,9, 6,3, 5,9, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,0, 4,71, 4,43, 4,38, 4,33, 4,14, 4,12, 4,05, 3,91, 3,73, 3,61, 3,58, 3,56, 3,47, 3,40, 3,36, 3,28, 3,24, 3,17, 3,09, 3,01, 2,96, 2,83, 2,54, 2,49, 2,41, 2,38 и 2,35 Å; способу получения этих форм, способу взаимопревращения соединения-ангидрата, к применению этих соединений в качестве фармацевтического средства и в изготовлении лекарств; фармацевтическому препарату для применения в лечении состояния, при котором требуется или желательно ингибирование тромбина и способу лечения такого состояния.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина из их соответствующих предшественников, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения плазминогена или плазмина. .

Изобретение относится к области медицины и химической технологии. .

Изобретение относится к области медицины и химической технологии. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и может быть применено в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения рекомбинантных белков паутины паука-кругопряда в клетках дрожжей, слитых белков, содержащих последовательности рекомбинантных белков паутины паука-кругопряда, рекомбинантных ДНК, кодирующих слитые белки, клеток-хозяев дрожжей и векторов экспрессии, используемых для осуществления способа, а также штаммов - продуцентов рекомбинантных белков паутины паука-кругопряда.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к расширению спектра противовирусных препаратов для нужд ветеринарии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина из их соответствующих предшественников, и может быть использовано в медицине.
Наверх