Антитела и пептидные антигены для получения антител, имеющих селективную специфичность связывания с биологически активным интактным паратиреоидным гормоном (птг(ртн))1-84

Изобретение относится к иммунологии. Предложен способ получения поликлональной антисыворотки, которая иммуноспецифически связывается с биологически активным паратиреоидным гормоном (ПТГ) в части трех или четырех N-концевых аминокислотных остатков (1-84) ПТГ. Вводят первый пептидный антиген животному-хозяину, не являющемуся человеком. Проводят мониторинг титра продуцируемых антител. Экстрагируют антисыворотку. Выделяют и отбирают по меньшей мере одно антитело из антисыворотки с помощью аффинной хроматографии с использованием второго пептидного антигена. Удаляют по меньшей мере одно антитело, обладающее специфичностью в отношении пептидного антигена, выбранного из группы, состоящей из (4-34) ПТГ, (5-34) ПТГ, (4-84) ПТГ и (5-84) ПТГ, посредством аффинной хроматографии с использованием третьего пептидного антигена, выбранного из группы, состоящей из (4-34) ПТГ, (5-34) ПТГ, (4-84) ПТГ и (5-84) ПТГ, соответственно. Выделяют поликлональную сыворотку, обладающую связывающей аффинностью в отношении не более чем первых трех или четырех аминокислотных остатков N-концевой части ПТГ и не обладающую аффинностью в отношении любых аминокислотных остатков в пятом аминокислотном остатке или после пятого аминокислотного остатка N-конца ПТГ. Использование изобретения обеспечивает определение уровня биоактивно интактного ПТГ в сыворотке, плазме и/или среде культур клеток. 5 з.п. ф-лы, 4 ил.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка является частичным продолжением Патентной Заявки Соединенных Штатов, Серийный Номер 09/730164, поданной 5 декабря 2000, озаглавленной АНТИТЕЛА И ПЕПТИДНЫЕ АНТИГЕНЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ, ИМЕЮЩИХ СЕЛЕКТИВНУЮ СПЕЦИФИЧНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМ ПАРАТИРЕОИДНЫМ ГОРМОНОМ (ПТГ) 1-84, и находящейся в настоящее время на стадии выдачи, описание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.

ОТВЕТНОЕ ЗАЯВЛЕНИЕ: ИССЛЕДОВАНИЕ/РАЗРАБОТКА, СПОНСИРУЕМАЯ ФЕДЕРАЛЬНО Не применимо

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Паратиреоидный гормон (ПТГ) и его важная роль в регуляции содержания ионов кальция в крови хорошо известны. В этой связи, такой гормон продуцируется паратиреоидными железами и в комбинации с другими факторами действует, регулируя уровень ионов кальция в крови, так, чтобы он поддерживался в стабильной концентрации и в клетках, и в окружающей их жидкости. По существу, ПТГ действует, высвобождая запасы кальция в организме, когда уровень кальция в сыворотке снижается. С другой стороны, его секреция подавляется при увеличении концентрации кальция в сыворотке.

В своей полноразмерной форме ПТГ включает в себя уникальный пептид, состоящий из 84 аминокислот. Специфическая последовательность ПТГ, присутствующая у многих видов, а именно у человека, крыс, мышей, жвачных животных, собак, свиней, кошек и обезьян, изображена на фиг.1, а ее варианты - на фиг.2, которые иллюстрируют, что относительно постоянная структура этого гормона поддерживается среди указанных видов.

Из-за его важной роли в метаболизме кальция не только для человека, но для множества видов, точное измерение ПТГ не перестает иметь существенную клиническую значимость. Как хорошо задокументировано, уровень ПТГ в сыворотке служит важным параметром для пациентов, имеющих, помимо прочего, такие заболевания, как гиперкальциемия, первичный гиперпаратиреоз и остеопороз. Аналогично, ПТГ приобретает существенное клиническое значение у пациентов, страдающих хронической почечной недостаточностью, у которых из-за нарушений ПТГ может развиться почечная остеодистрофия.

Несмотря на его важную роль в метаболизме и клиническую значимость, продолжают существовать значительные трудности в отношении определения уровня циркулирующего биологически активного ПТГ. Во-первых, хорошо известно, что ПТГ в норме присутствует в чрезвычайно низких количествах, составляющих от 10 пг/мл до 65 пг/мл. Более того, известно, что пептид ПТГ может присутствовать во множестве циркулирующих фрагментов ПТГ и, в частности, крупных не-(1-84) циркулирующих фрагментов ПТГ, которые, вероятно, совместно мигрируют при хроматографии с молекулой ПТГ (7-84) и, как известно, являются особенной помехой в обычных анализах при измерении ПТГ. Действительно, крупные не-(1-84) фрагменты ПТГ могут составлять около половины (1/2) ПТГ, измеряемого в большинстве существующих анализов. Примеры существующих недостатков точного измерения ПТГ указаны в международной заявке РСТ/US00/00855, международной публикации № WO/00/42437, озаглавленной Способы дифференциации и мониторинга заболеваний, связанных с состоянием паратиреоидных желез и костей, а также публикации Lepage, Raymond et al., A non-(1-84) Circulating Assay Measurement In Uremic Samples, Clinical Chemistry 44:4, 1998, pages 805-809, описания которых включены в настоящее описание в виде ссылки.

На пути преодоления таких недостатков был предложен новый анализ для определения уровня ПТГ исследователями Scantibodies Laboratory, of Santee, California, который включает в себя антитело-маркер, обладающее специфичностью связывания с самым крайним N-концевым отделом человеческого ПТГ, а более конкретно с его первыми шестью аминокислотными остатками. Как выяснилось в настоящее время, при таком анализе, по-видимому, минимизируется перекрестная реакция с крупными не-(1-84) фрагментами ПТГ. Однако для получения таких антител требуются существенные усилия и затраты для их очистки. Более того, такие антитела-маркеры максимально хорошо распознают только первый аминокислотный остаток ПТГ и имеют существенно меньшую специфичность в отношении последующих остатков, таким образом, исключается возможность его применения для некоторых других видов, где первая аминокислота отличается. Такие недостатки обсуждаются в статье John M.R. et al., названной A Novel Immunoradiometric Assay Detects Full-Length Human PTH but not Amino-Terminally Truncated Fragments: Implications for PTH Measurements in Renal Failure, The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 84, No. 11, 1999, p. 4287-4290, содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.

Следовательно, в этой области продолжает существовать необходимость в партнере связывания для анализа и в способе получения такого партнера связывания, который является специфичным в отношении биологически активного интактного ПТГ, который поможет определить уровень ПТГ со сниженной перекрестной реакцией с фрагментами пептида ПТГ. Существует также необходимость в данной области в улучшенных партнерах связывания ПТГ, которые помогут измерять уровень ПТГ способом, более эффективным по затратам, которые имеют большее сродство к ПТГ и которые могут быть легко включены в наборы для иммунологических исследований и пр. Все еще существует необходимость в партнерах связывания, а именно в антителах, распознающих связывание, которое специфично в отношении ПТГ, которые могут быть использованы для определения уровня ПТГ у множества видов. Наконец, в данной области существует необходимость в улучшенных партнерах связывания, имеющих высокое сродство связывания с ПТГ, которые могут быть легко получены с использованием обычных приемов и которые требуют минимальной очистки, приводя к лучшему распознаванию связывания с интактным ПТГ, обладают минимальной перекрестной реакцией с крупными не-(1-84) фрагментами ПТГ и могут быть получены с использованием способов, которые дают более высокие выходы антител, чем партнеры для связывания, известные на предшествующем уровне техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение специфически решает и облегчает вышеуказанные недостатки в этой области. Настоящее изобретение относится к определенным антигенам, антителам и способам получения антител, которые применимы для определения уровня биологически интактного ПТГ в образце жидкости, такой как сыворотка, плазма или культуральная среда клеток. Антитела и способы согласно изобретению имеют определенные преимущества, обладая бульшим сродством к ПТГ, и, в частности, они сконструированы таким образом, чтобы ими распознавались несколько новых аминокислотных остатков, начиная от первого N-концевого остатка ПТГ, но предпочтительно не далее четвертого аминокислотного остатка ПТГ. В большинстве особо предпочтительных вариантов осуществления антитела будут иметь специфичность в отношении первых трех аминокислотных остатков N-конца ПТГ. Кроме того, антитела не имеют перекрестной реакции с крупными не-(1-84) молекулярными формами ПТГ. Более того, антигены, антитела и способы их получения в соответствии с настоящим изобретением обладают существенной универсальностью в отношении множества различных видов и могут быть использованы для определения уровня ПТГ не только у человека, но и у крыс, мышей, жвачных животных, собак, свиней, кошек и обезьян.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, антиген имеет формулу

VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY

где Х выбран из группы, состоящей из LEU [SEQ ID NO.1] и PHE [SEQ ID NO.2]. В отношении такого варианта осуществления изобретения такой антигенный пептид представляет собой аминокислотные остатки 2-12 ПТГ, с его шестым аминокислотным остатком, выбранным из LEU и PHE, где первый встречается в ПТГ человека, крысы, мыши и свиньи, а последний соответствует ПТГ жвачных животных и собак. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения антиген включает в себя пептид, имеющий формулу

Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY

где Х выбран из группы, состоящей из LEU и PHE, как обсуждалось выше, а Y является аминокислотным остатком, состоящим из или SER или ALA [SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 и SEQ ID No. 6, соответственно], причем первый отражает аминокислоту, присутствующую у человека, собаки и свиньи, а последний соответствует ПТГ крыс, мышей и жвачных животных.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения антиген имеет формулу

VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU

где Х выбран из группы, состоящей из LEU [SEQ ID NO.7] и PHE [SEQ ID NO.8]. Такие антигенные пептиды представляют собой аминокислотные остатки 2-15 ПТГ, с шестым аминокислотным остатком, включающим в себя либо LEU, либо PHE, отражая, таким образом, соответствующий аминокислотный остаток, встречающийся у соответствующих видов, указанных выше. В другом варианте осуществления изобретения антигенный пептид представляет собой аминокислотные остатки 1-15 ПТГ и имеет формулу

Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU

где Х выбран из группы, состоящей из LEU и PHE, а Y является аминокислотным остатком, состоящим из или SER или ALA [SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 и SEQ ID No. 12, соответственно], где последний выбирают в соответствии с конкретным видом, указанным выше.

В отношении антител и способов их получения в соответствии с настоящим изобретением, они направлены на антитела, имеющие сродство и специфичность в отношении вышеупомянутых антигенов. Предпочтительно, если антитела являются специфичными в отношении аминокислотных остатков ПТГ 2-12, 1-12, 2-15 и 1-15, соответственно. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела являются специфичными только в отношении первых трех аминокислотных остатков ПТГ. Такие антитела предпочтительно получают посредством стадий введения одного из указанных выше пептидных антигенов либо отдельно, либо в сочетании с белком-носителем животному-хозяину, в число которых предпочтительно входит коза, для получения продукции антител к пептидному антигену. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления изобретения продукцию антитела индуцируют посредством введения более крупных пептидных фрагментов ПТГ. Предпочтительно, такой фрагмент ПТГ может включать (1-34) ПТГ, который необязательно может дополнительно включать в себя белок-носитель, ковалентно связанный или слитый с ним для увеличения антигенности, или интактный (1-84) ПТГ. В тех случаях, когда получение антител связано с определением ПТГ у человека, интактная молекула ПТГ (1-84) предпочтительно включает в себя интактный крысиный ПТГ или, в меньшей степени, человеческий ПТГ. Затем отслеживают титр антител, полученный при введении антигена животному-хозяину. После этого выделяют антисыворотку, продуцируемую животным-хозяином, и его антитела отбирают посредством аффинной хроматографии, как имеющие специфичность в отношении желаемого антигенного участка ПТГ (т.е. аминокислотных остатков ПТГ 2-12, 1-12, 2-15 и 1-15, соответственно). На дополнительной стадии выделенные антитела дополнительно очищают для удаления антител, обладающих сродством к аминокислотным остаткам, расположенным за четвертым или пятым N-концевым аминокислотным остатком ПТГ с использованием связанных антигенов, соответствующих либо (4-34) ПТГ и/или (4-84) ПТГ, либо (5-34) ПТГ и/или (5-84) ПТГ, которые удерживают нежелательные антитела, но позволяют проходить антителам, специфичным только в отношении (1-3) или (1-4) ПТГ. Затем антитела могут быть помечены или иным образом включены в различные из обычно используемых анализов для определения ПТГ либо у человека, либо у любого из множества видов.

Как известно специалистам в данной области, антигены, антитела и способы согласно изобретению, сфокусированные на аминокислотных остатках 2-12, 1-12, 2-15 и 1-15 ПТГ, соответственно, фокусируются на части молекулы ПТГ, обладающей N-концевой биологической активностью, и, следовательно, максимально хорошо определяют таковую. Более того, что касается более предпочтительных вариантов осуществления изобретения, их обеспечивают, используя антигены, антитела и способы их получения, которые включают другие аминокислотные остатки, расположенные за N-концевым биологически активным участком (т.е. до и включая двенадцатый (12-й) и тринадцатый (13-й) аминокислотные остатки ПТГ), и, следовательно, специфичность и сродство таких антител более высокое и позволяют им определять уровень ПТГ с большей специфичностью и сродством, чем рецепторы предшествующего уровня техники, при их использовании в анализах и пр. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела обладают специфичностью к не более чем первым трем аминокислотным остаткам ПТГ, что, как обсуждалось, достигается посредством удаления или стадии «очистки», в силу чего антитела, полученные с применением антигенов согласно изобретению, селективно удаляют в тех случаях, когда любые такие антитела имеют аффинность в отношении (4-34) ПТГ или (4-84) ПТГ. Как следствие, у антител, полученных в соответствии с настоящим изобретением (а также в способах и у пептидных антигенов, описанных в настоящем описании для достижения такого результата), практически устранена перекрестная реакция с крупными не-(1-84) пептидными фрагментами ПТГ, они не обладают максимальным распознаванием только первого аминокислотного остатка ПТГ и, дополнительно, могут быть легко получены эффективным по затратам способом в такой мере, что выход антител, полученный способами согласно изобретению, должен быть больше, чем способами предшествующего уровня области техники.

Альтернативно, такое удаление или стадия «очистки» используется для селективного удаления антител, имеющих аффинность к (5-34) ПТГ или (5-84) ПТГ. Таким образом, в конечном счете выделенные антитела будут иметь аффинность в отношении не более чем первых четырех аминокислотных остатков N-концевого ПТГ. Следовательно, задачей настоящего изобретения является обеспечение 1) выбора антигенов для получения и выделения антител; 2) антител и 3) способов получения антител, которые имеют сродство связывания и специфичность в отношении ПТГ, которые обладают уменьшенной перекрестной реакцией с крупными не (1-84) пептидными фрагментами ПТГ.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение 1) выбора антигенов для получения антител; 2) антитела и 3) способов получения антител, которые обладают бульшим сродством и специфичностью в отношении ПТГ, чем партнеры связывания в предшествующем уровне техники, и, кроме того, обладают большей степенью перекрестной реакции между межвидовыми ПТГ, так, чтобы антигены, антитела и способы их получения в соответствии с настоящим изобретением могли быть легко использованы для определения ПТГ у множества видов.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение 1) выбора антигенов для получения и выделения антител; 2) антитела и 3) способов получения антител, которые обладают сродством связывания и специфичностью в отношении биологически более активной N-концевой части ПТГ и, следовательно, являются более эффективными и точными при определения уровня биологически интактного ПТГ, чем направленные на них партнеры связывания в предшествующем уровне техники.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение 1) выбора антигенов для получения и выделения антител; 2) антитела и 3) способов получения антител, которые не обладают максимальным сродством связывания только в отношении первого N-концевого аминокислотного остатка ПТГ.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение 1) выбора антигенов для получения и выделения антител; 2) антитела и 3) способов получения антител, которые являются менее дорогими в получении и дают более высокий выход антител, чем способы предшествующего уровня техники получения антител, имеющих сродство связывания и специфичность в отношении N-конца ПТГ.

Еще дополнительными задачами настоящего изобретения являются обеспечение 1) выбора антигенов для получения и выделения антител; 2) антитела и 3) способов получения антител, которые легко дают антитела, которые могут быть легко включены в любое множество коммерчески доступных анализов и, кроме того, могут быть модифицированы (например, для включения метки и пр.), как может быть желательно для любого из множества применений в иммунологических исследованиях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Эта, а также другие характеристики настоящего изобретения будут более ясны со ссылками на чертежи.

На фиг.1 изображена аминокислотная последовательность ПТГ для множества видов, а именно человека, крыс, мышей, жвачных животных, собак, свиней, кошек и обезьян, и, кроме того, изображены аминокислотные последовательности, определяемые в настоящем описании как SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 и SEQ ID NO. 12.

Фиг. 2 является вариантом иллюстрации Фиг. 1, изображающим вариант 1-84 аминокислотной последовательности ПТГ вышеупомянутых видов, еще изображающей N-конец ПТГ, где аминокислотные последовательности SEQ ID NO. 1-12 остаются относительно постоянными.

На фиг.3 представлена N-концевая часть человеческого ПТГ в виде диаграммы.

Фиг.4 представляет собой блок-схему, изображающую стадии получения антител в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Подробное описание, указанное ниже, предназначено для описания предпочтительного в настоящее время варианта осуществления изобретения и не предназначено для представления в качестве единственной формы, в которой настоящее изобретение может быть истолковано или использовано. Описание указывает функции и последовательности стадий для создания и манипуляций с изобретением. Необходимо понимать, однако, что такие же или эквивалентные функции и последовательности могут быть осуществлены различными вариантами осуществления изобретения, которые также предназначены для включения в объем изобретения.

Настоящее изобретение охватывает антигены, антитела и способы получения антител, которые направлены на антигенный участок ПТГ, расположенный на его N-концевом участке, и, более точно, первые пятнадцать (15) аминокислотных остатков, расположенных от N-конца, изображенного как 10 на фиг. 1-3. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела являются специфичными только в отношении первых трех (3) аминокислотных остатков ПТГ. Как хорошо известно, N-концевой участок ПТГ считают необходимым для связывания с рецептором ПТГ/ПТГрп, и, кроме того, он считается наиболее желательным эпитопом для измерения уровня биологически интактного ПТГ, который может быть обнаружен в образце биологической жидкости, такой как сыворотка, плазма или среда для культуры клеток. Показательное существующее состояние области техники, связанной с ПТГ и способами его определения, обсуждается подробно в опубликованной международной заявке договора о патентной кооперации № PCT/US00/00855, Международной Публикации № WO/00/42437, названной Methods for Differentiating and Monitoring Parathyroid and Bond Status Related Diseases и Lepage, Raymond et al., A Non-(1-84) Circulating Parathyroid Hormone (PTH) Fragment Interferes With Intact PTH Commercial Assay Measurement In Uremic Samples, Clinical Chemistry 44:4, 1998 pages 805-809, описания которых включены в настоящее описание в виде ссылки.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, антигенный пептид согласно изобретению включает в себя аминокислотные остатки, соответствующие остаткам аминокислот 2-12 ПТГ, вместе определяемые как 12 на фиг. 1-3. В частности, такой антигенный пептид будет иметь формулу

VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY

где Х является аминокислотным остатком, выбранным либо из LEU [SEQ ID NO. 1], либо PHE [SEQ ID NO. 2]. Специалисту в данной области известно, что шестой (6-й) аминокислотный остаток такого пептидного фрагмента ПТГ не отличается между указанными видами, на основании чего такой остаток включает LEU у человека, крысы, мыши и свиньи и PHE у жвачных животных и собак. Специалисту понятно, что несмотря на различия в одиночном аминокислотном остатке, такой антигенный пептид остается в остальных отношениях постоянным между указанными видами, что, как обсуждается подробнее ниже, может допустить получение и точное применение антител как перекрестных и, следовательно, эффективных в определении уровня ПТГ у множества таких видов.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения пептидный антиген отражает первые двенадцать (12) аминокислотных остатков ПТГ, определяемых как 14, имеет формулу

Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY

где Х является аминокислотным остатком, выбранным из LEU или PHE, а Y является аминокислотным остатком, выбранным из SER или ALA [SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 и SEQ ID NO. 6, соответственно]. В отношении вариантов в первом аминокислотном остатке, легко понятно, что такой антигенный пептид может быть получен таким образом, чтобы был включен SER, что обнаруживается у человека, собаки и свиньи, или ALA, что обнаруживается у крыс, мышей и жвачных животных. В этом отношении варианты, представленные для антигенного пептида в настоящем изобретении и, в частности, в более предпочтительном варианте его осуществления, имеют некоторый запас, т.е. антитела, полученные из таких антигенных пептидов, могут быть получены таким образом, чтобы они обладали более высоким сродством связывания, что может быть желательно для определения ПТГ у данных видов.

В более высокоточных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенный пептид включает в себя последовательности, которые соответствуют аминокислотным остаткам ПТГ 2-15 и 1-15, соответственно. В отношении первого, указанного на фиг. 1-3 как 16, такой антигенный пептид будет иметь формулу

VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU

где Х является аминокислотным остатком, выбранным из LEU [SEQ ID NO. 7] или PHE [SEQ ID NO. 8]. В отношении последнего варианта осуществления изобретения, соответствующего аминокислотным остаткам 1-15 ПТГ, указанным как 10, такой антигенный пептид будет иметь формулу

Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU

где Х является аминокислотным остатком, выбранным из LEU или PHE, а Y является аминокислотным остатком, выбранным из SER или ALA [SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 и SEQ ID NO. 12, соответственно]. Был представлен компакт-диск, обеспечивающий считываемую компьютером форму SEQ ID NO. 1-12 в соответствии с требованиями 37 CFR 1.821-1.825, который идентичен записанному списку представленных в настоящем описании последовательностей для соответствия установленным требованиям. Несмотря на приведенные выше формулы для указанных выше пептидов, очевидно, что сказанное выше будет распространяться и на все их функциональные производные, что означает включение функционально сравнимых пептидов, полученных из того же участка ПТГ, - отражается в последовательностях фиг. 1-3, имеющих сходную способность индуцировать специфические анти-ПТГ-антитела и, более точно, антитела, специфичные в отношении N-концевых аминокислотных остатков ПТГ. В этом отношении, такое функциональное производное может быть сходным образом сконструированным пептидом или пептидом, полученным из последовательностей, обсуждаемых выше и отраженных на фиг.1-3, имеющим замещения, добавления или делеции аминокислот, с условием, что такие замещения, добавления или делеции не изменят способности пептидного антигена индуцировать антитела, реакционноспособные в отношении ПТГ.

Необходимо признать дополнительно, что пептидные антигены согласно изобретению включают в себя такие пептиды, чья аминокислотная последовательность может быть смещена в пределах нескольких аминокислот вверх или вниз вдоль цепи пептидов, обсуждаемых выше на фиг.1-3, а также пептидов, имеющих консервативные изменения аминокислот, так, чтобы замещения, добавления или делеции аминокислот или изменения существенно не влияли на способность пептидного антигена индуцировать антитела с высокой аффинностью и специфичностью в отношении первых двенадцати аминокислотных остатков ПТГ или любых его субкомпонентов.

В отношении получения антител, на фиг. 4 проиллюстрирован способ 20 их получения. Исходно, обеспечивают пептид 22 вышеупомянутого множества, который полностью или частично соответствует первым двенадцати (12)-пятнадцати (15) аминокислотным остаткам ПТГ заданных видов. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления изобретения, однако, антигенный пептид, используемый для получения антител, будет включать в себя более крупные фрагменты ПТГ, включая, но не ограничиваясь ими, (1-34) ПТГ и полный интактный (1-84) пептид ПТГ. Наряду с этим, тогда как полученные в результате антитела будут иметь специфичность в отношении таких аминокислотных остатков, соответствующих вышеупомянутым антигенным пептидам (т.е. аминокислотные последовательности 2-12, 1-12, 2-15 и/или 1-15 ПТГ), в рамках способа согласно изобретению, по меньшей мере в отношении исходной стадии получения антигена 22 и последовательного введения такового, посредством стадии 24, обсуждаемой ниже, будет очевидно, что цельный пептид ПТГ и его N-концевой фрагмент может предпочтительно служить в качестве подходящего антигенного пептида для индуцирования продукции антител, которые будут в конечном счете обладать идеальным сродством связывания и специфичностью в отношении биологически активной части ПТГ на его N-конце. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения обеспечиваемый и вводимый антигенный пептид будет включать в себя фрагмент ПТГ, соответствующий аминокислотным остаткам 1-34 ПТГ, которые могут быть необязательно соединены с белком-носителем. Альтернативно такой пептидный фрагмент может предпочтительно вводиться в виде (1-84) ПТГ полной длины, который может принимать форму, характерную для любого вида, указанного на фиг. 1-2. Предпочтительно, в контексте разработки антител, специфичных в отношении человеческого ПТГ, применение (1-34) крысиного ПТГ или (1-84) крысиного ПТГ полной длины является предпочтительным.

Такие антигенные пептиды могут быть получены любым из множества способов, хорошо известных в данной области, включая синтез обычными способами, такими как твердофазный химический синтез или рекомбинантные технологии. Как станет очевидно далее, синтетические пептиды могут необязательно быть химически связаны с белком-носителем или, альтернативно, рекомбинантные пептиды могут быть получены в виде слитых белков для повышения антигенности. Как далее будет очевидно специалисту в данной области, такие антигенные пептиды могут быть подвергнуты скринингу на основании их способности индуцировать анти-ПТГ-антитела. В этом отношении, такие методики скрининга могут включать в себя, без ограничения, иммунопреципитацию или иммунологический анализ.

После получения такие пептидные антигены могут быть затем использованы для создания антител согласно изобретению с использованием обычных методик. Для этого пептидный антиген(ы), предпочтительно в комбинации с добавкой, вводят животному-носителю 24, которое предпочтительно включает козу. Необходимо понимать, однако, что другие виды, такие как кролики, мыши, овцы, куры и др., могут дополнительно быть использованы в качестве животных-хозяев носителей. С этой целью, введение таких антигенов может осуществляться любым из множества способов, включая, без ограничения, подкожные или внутримышечные инъекции. Как будет очевидно, доза вводимого пептидного антигена будет, соответственно, варьироваться в соответствии с используемым пептидом, а также животным-хозяином. Как будет дополнительно отмечено, однако, с целью получения антител, обладающих наибольшим сродством и специфичностью, возможной для данных видов, отдельные антитела должны быть получены против соответствующего совместимого пептида от каждого вида.

После введения проводят мониторинг 26 результатов образования титров антител у животного-хозяина, что может осуществляться любой из множества методик, хорошо известных в данной области, с использованием обычной крови и пр., с выделением антисыворотки (например, посредством центрифугирования) на стадии 28, и после этого - скрининг на наличие антипептидных антител, обладающих афинностью их связывания. Кроме того, следует учесть, что при наличии вышеупомянутых обычных иммунологических способов получения антител согласно изобретению такие антитела могут быть моноклональными или поликлональными по природе. В соответствии с обычной практикой, предпочтительно, чтобы антисыворотку получали от множества животных-хозяев.

Результирующая антисывортка, полученная от животного-хозяина, может быть очищена по сродству для получения антител согласно изобретению. Как хорошо известно в данной области, антисыворотка может быть очищена посредством обычных методик, таких как нанесение на разделительную колонку с вышеупомянутыми антигенными пептидами, соответствующими последовательностям аминокислотных остатков 2-12, 1-12, 2-15 и/или 1-15 ПТГ, связанных с твердой фазой (например, гранулы и пр.). Затем антисыворотка может быть промыта для удаления антител, не обладающих специфичностью к антигенному пептиду или пептидам, с оставшимися связанными антителами, специфичными к антигенному пептиду или пептидам, в конечном счете, элюированных из него. Такие антитела затем могут храниться в соответствии с обычными методиками, хорошо известными специалисту в данной области.

На дополнительной стадии 29 антитела, полученные посредством таких способов выделения и очистки, подвергнутся последующему процессу очистки, посредством которого любые антитела, присутствующие в антисыворотке, имеющие аффинность к (4-34) или (5-34) ПТГ и/или (4-84) или (5-84) ПТГ, селективно удаляются или «отщепляются». Для этого предусматривается, что после выделения антисыворотки на стадии 28 она может быть очищена для удаления любых антител, имеющих специфичность в отношении (4-34) или (5-34) ПТГ и/или (4-84) или (5-84) ПТГ для любого из видов, указанных в настоящем описании, посредством разделительной колонки или другой рутинной методики, посредством которой антигенные пептиды, соответствующие каждой из аминокислотных последовательностей (4-34) или (5-34) ПТГ или (4-84) или (5-84) ПТГ, связывают с твердой фазой, и через нее пропускают антисыворотку для очистки последней. Любое антитело, имеющее специфичность в отношении специфического (4-34) или (5-34) ПТГ и/или (4-84) или (5-84) пептида ПТГ, останется связанным, а оставшиеся антитела, не имеющие специфичности в отношении (4-34) или (5-34) ПТГ и/или (4-84) или (5-84) пептида ПТГ, будут отделены. Преимущественно таким способом, следовательно, можно будет выделять только антитела, обладающие сродством в основном к первым трем (3) или четырем (4) аминокислотным остаткам ПТГ и, следовательно, вообще не имеющие сродства связывания к какому бы то ни было аминокислотному остатку в пятом положении от N-конца ПТГ или после пятого положения от N-конца ПТГ. Такой способ, следовательно, обеспечивает то, что любые антитела, в конечном счете выделенные, будут фактически специфичны к N-концу (1-84) ПТГ и, следовательно, не будут никоим образом связываться с каким бы то не было фрагментом ПТГ, который не включает в себя по меньшей мере первые три или четыре N-концевых аминокислотных остатка ПТГ.

Поскольку такие антитела выделяют с использованием таких антигенных пептидов, соответствующих последовательностям аминокислотных остатков 2-12 и 2-15 ПТГ, соответственно, следовательно, будут выделены антитела, которые не обязательно будут обладать сродством связывания, существенно меньшим максимального сродства связывания с первым аминокислотным остатком ПТГ, что, как известно, является проблемой антител, полученных способами предшествующего уровня техники. В этом отношении, удаление или существенное подавление антител, имеющих сродство к первому аминокислотному остатку ПТГ, будет аналогично достигаться с использованием пептидных последовательностей, соответствующих 1-12 и 1-15 ПТГ, соответственно, с условием, что такие последовательности выбраны из тех видов, у которых первый аминокислотный остаток отличается от такового у видов, для которых могут быть использованы полученные в конечном счете антитела. Например, для получения антител, подходящих для детектирования уровней ПТГ у человека, которые не обладают специфичностью в отношении первого аминокислотного остатка человеческого ПТГ, очевидно, что анти-крысиная ПТГ-сыворотка, полученная от организма животного-хозяина, может быть очищена от пептидов, соответствующих последовательностям аминокислотных остатков 1-12 и 1-15 человеческого ПТГ. Понятно, что поскольку первый N-концевой аминокислотный остаток крысиного ПТГ соответствует ALA, в отличие от SER, обнаруживаемого у человека, любые антитела, выделяемые в конечном счете, будут обязательно обладать сродством связывания с аминокислотными остатками, расположенными в последовательности после первого аминокислотного остатка.

При получении на стадии 30 такие антитела могут быть использованы в иммунологических методиках для корреляции наличия биологически интактного ПТГ, что может быть обнаружено в заданном образце (например, сыворотке или плазме). В этом отношении антитела согласно изобретению могут быть использованы отдельно или в комбинации для скрининга заданного образца на предмет определения присутствия биологически интактного ПТГ, при этом у них преимущественно будет отсутствовать перекрестная реакция с крупными не-(1-84) фрагментами ПТГ. В качестве примера, такие антитела могут быть включены в набор для иммунологического анализа. Примеры таких применений включают наборы ELISA для человеческого биологически активного интактного ПТГ и крысиного биологически активного интактного ПТГ, производимых Immutopics, Inc., San Clemente Californis, которые обеспечивают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для количественного определения уровня биологически активного интактного ПТГ в сыворотке, плазме или среде культивирования клеток. В отношении применимости полученных антител, специфичных в отношении ПТГ множества видов, очевидно, что наборы для иммунологического анализа, такие как обеспечиваемые Immutopics, Inc., могут быть специфически созданы таким образом, чтобы сродство и специфичность таких антител были применимы к широкому множеству видов или, альтернативно, созданы против соответствующего сравнимого пептида данных видов так, чтобы наборы конкретно относились к данному виду.

Дополнительные модификации и улучшения настоящего изобретения также могут быть очевидны обычному специалисту в данной области. Следовательно, определенная комбинация частей, описанных и проиллюстрированных в настоящем описании, предназначена только для иллюстрации определенного варианта осуществления настоящего изобретения и не предназначена для ограничения альтернативных устройств в объеме, охватываемом данным изобретением.

1. Способ получения поликлональной антисыворотки, которая иммуноспецифически связывается с биологически активным паратиреоидным гормоном в N-концевой части (1-84) ПТГ, причем указанная N-концевая часть состоит из: (i) трех N-концевых аминокислотных остатков (1-84) ПТГ или (ii) четырех N-концевых аминокислотных остатков (1-84) ПТГ, предусматривающий стадии:
a) введения первого пептидного антигена животному-хозяину, не являющемуся человеком, для индуцирования продукции антител против указанного первого пептидного антигена у указанного животного-хозяина, не являющегося человеком, где указанный первый пептидный антиген выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, (1-34) ПТГ и (1-84)ПТГ;
b) мониторинга титра антител, продуцируемых указанным введением указанного первого антигена указанному животному-хозяину, не являющемуся человеком;
c) экстракции антисыворотки, продуцируемой у указанного животного-хозяина, не являющегося человеком, путем указанного введения указанного первого пептидного антигена;
d) выделения и отбора по меньшей мере одного антитела из указанной антисыворотки, экстрагированной на стадии с), с помощью аффинной хроматографии с использованием второго пептидного антигена, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 и SEQ ID NO.6;
e) удаления указанного по меньшей мере одного антитела, выделенного на стадии d), обладающего специфичностью в отношении пептидного антигена, выбранного из группы, состоящей из (4-34) ПТГ, (5-34) ПТГ, (4-84) ПТГ и (5-84) ПТГ посредством аффинной хроматографии с использованием третьего пептидного антигена, выбранного из группы, состоящей из (4-34) ПТГ, (5-34) ПТГ, (4-84) ПТГ и (5-84) ПТГ, соответственно; и
f) выделения поликлональной антисыворотки на стадиях d) и е), обладающей связывающей аффинностью в отношении не более чем первых трех или четырех аминокислотных остатков N-концевой части ПТГ, и где выделенная поликлональная антисыворотка не обладает связывающей аффинностью в отношении любых аминокислотных остатков в пятом аминокислотном остатке или после пятого аминокислотного остатка N-конца ПТГ, посредством сбора элюата, полученного на стадии е).

2. Способ по п.1, где на стадии а) указанное животное-хозяин выбрано из группы, состоящей из мыши и кролика.

3. Способ по п.1, где на стадии а) группа указанных животных-хозяев включает в себя по меньшей мере одну козу.

4. Способ по п.1, где на стадии а) указанный (1-34) ПТГ получен из видов, выбранных из группы, состоящей из человека, крысы, мыши, жвачного животного, собаки, свиньи, кошки и обезьяны.

5. Способ по п.1, где на стадии а) указанный первый пептидный антиген имеет связанный с ним белок-носитель.

6. Способ по п.1, где на стадии а) указанный (1-84) ПТГ получен из видов, выбранных из группы, состоящей из человека, крысы, мыши, жвачного животного, собаки, свиньи, кошки и обезьяны.