Питательная среда плотная для выращивания легионелл

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для жизнедеятельности легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат желтка куриного яйца с содержанием 0,10-0,14% аминного азота, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеина гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10,0 г; агар-агар 15,0-20,0 г рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ - СПб. - 2008. - С. 64-65, с. 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая, г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированная вода до 1 л. (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011 г. Бюл. №5.)

Недостатком данной среды является относительно высокая себестоимость.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; агар микробиологический, дистиллированную воду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат желтка куриного яйца
(с содержанием аминного азота 0,10-0,14%)	132,0-192,0
Калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,7-1,1
Калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный	2,0-2,4
Активированный уголь	1,0-3,0
L-цистеин гидрохлорид	0,25-0,55
Агар микробиологический	7,5-11,5
Дистиллированная вода	до 1 л.

Биологическая ценность желтка куриного яйца состоит в наличии в среднем 50% воды, белка 16,2%, аминокислот, макроэлементов в мг/на 100 г: зола 1,7%; калия 129; кальция 129; магния 15; серы 170; хлора 146,8; фосфора 542; натрия 51, микроэлементов в мкг: железа 6700; йода 23; кобальта 23; марганца 37; меди 139; молибдена 11,8; хрома 7,8; цинка 3105. Содержание витаминов мг в кг: витамина А 0,35; каротина 0,06; витамина B₁ 1,6; витамина Д 4,70; витамина Е 2,0; пантотеновой кислоты 1,3; витамина B₅ 3,0; В₆ 0,14; ниацина 0,19; рибофлавина 0,44; фолацина 7,0; холина 251,7. Коэффициент пересчета незаменимых аминокислот в г/кг составляет 6558, из них - валина 937; изолейцина 907; лейцина 1381; лизина 1156; метионина 415; треонина 830; триптофана 236 и фенилаланина 696. Коэффициент пересчета заменимых аминокислот составляет 9331, в том числе: аланина 854; аргинина 1156; аспарагиновой кислоты 1339; гистидина 383; глицина 514; глютаминовой кислоты 2051; пролина 695; серина 1365; тирозина 699; цистина 275. Микроэлементов мг в кг: цинка 14,0; марганца 0,8; меди 0,8; кобальта 0,07. Органические вещества: протеина 93% (белка); жира 94%. (М.Ф.Нестерин, И.М.Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.)

Легионеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами, поэтому растут в желточном мешке куриных эмбрионов, в культуре клеток животных и человека (фибробласты легкого). (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник для студентов медицинских вузов / Под редакцией А.А.Воробьева. - 2-е изд., испр. И доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. - С. - 400.)

Включение в состав среды 0,01 М калий фосфатного буфера (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ является компонентом нуклеиновых кислот, фосфолипидов и нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1989).

При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную воду без применения растворов, содержащих ионы натрия, ввиду их губительного действия, обеспечивают получение чистых культур сплошного роста через 24 ч при посеве 100 м.к.

В отличие от прототипа предлагаемая среда обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 24 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата желтка куриного яйца

Желток куриного яйца в количестве 30 штук, что составляет 550 мл, вливают в 3-литровый стеклянный баллон, заливают подогретой до 42+1°C питьевой водой до 1,5 л, подщелачивают 20% раствором гидроокиси калия до рН 8,2 в количестве 13 мл по фенолфталеину, затем добавляют коммерческие ферменты: трипсин в количестве 31,0 г и панкреатин 10,0 г. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 42°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Ежедневно ведется измерение рН среды и нарастания аминного азота. Через двое суток ввиду резкого падения рН до 5 ед. добавили 30 мл 20% гидроокиси калия до рН 8,2 по фенолфталеину. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,7%-0,8%. После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают в течение 2-х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°C.

Питательную среду на ферментативной основе желтка куриного яйца для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 162,0 мл, другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; агар микробиологический 9,5; дистиллированную воду - до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты в разведении (1:1) в количестве 1,0 мл до рН 6,8±0,1. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный на водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют 0,4 г L-цистеина гидрохлорида простерилизованного автоклавированием при 112°C в течение 30 мин, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Соляную кислоту ГОСТ-3118-77 (чда, хч) используют для установления рН. Массовая доля основного вещества, %, 35-38.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophilla АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophilla ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной среды СЭЛ рН 6,8 при температуре 36°C 24 ч. Из суточных культур готовили в стерильном 0,01 М калий фосфатном буфере 1 млрд взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П (рН 6,8) ГИСК им. Л.А.Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в калий фосфатном буфере в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10^-6). Из данных разведении взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного испытуемого агара и на контрольные среды: СЭЛ и агар Хоттингера (отрицательный контроль - на нем нет роста в любые сроки наблюдения). Посевы инкубировали при 36±1°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.

Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная) - состав, г/л: питательная основа животного происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; рН среды 7,1. (Производитель ФГУЗ Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117.)

Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571 от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,10%, 132,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,0; активированный уголь 1,0; L-цистеин гидрохлорид 0,25; агар микробиологический 7,5; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало более 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 24 ч для обоих штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 162,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеин гидрохлорид 0,4; агар микробиологический 9,5; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов наблюдали сплошной рост в виде голубовато-серого налета для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве более 50% колоний диаметром 1,2 мм от посева, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14% 192,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 1,1; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,4; активированный уголь 3,0; L-цистеин гидрохлорид 0,55; агар микробиологический 11,5; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало более 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 24 ч для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на основе ферментативного гидролизата желтка куриного яйца (пример 2).

Питательная среда плотная для выращивания легионелл, включающая питательную основу, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат желтка куриного яйца при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

ферментативный гидролизат желтка куриного яйца
(с содержанием аминного азота 0,10-0,14%)	132,0-192,0
калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,7-1,1
калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный	2,0-2,4
активированный уголь	1,0-3,0
L-цистеин гидрохлорид	0,25-0,55
агар микробиологический	7,5-11,5
дистиллированная вода	до 1 л