Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота ephemerovirus bovinum для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки крупного рогатого скота
Владельцы патента RU 2461391:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС). Описанный штамм выделен от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС, и депонирован в коллекцию микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером - «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП. Штамм репродуцируется в культуре клеток ВНК-21 в течение 2-3 суток и накапливается в титре от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД50/см3, сохраняет исходные характеристики при пассировании в культуре клеток ВНК-21 в течение 14 пассажей, на его основе получен антиген для серологических реакций и гипериммунные сыворотки крови к ВЭЛ КРС с активностью в реакции нейтрализации 1:8-1:16. Представленный штамм обладает высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и может быть использован для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС. 2 ил., 11 табл., 7 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса эфемерной лихорадки (ВЭЛ) крупного рогатого скота (КРС), который может быть использован при разработке и производстве средств диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Эфемерная лихорадка (трехдневная эпизоотическая лихорадка, болезнь тугоподвижности) - остро протекающая вирусная трансмиссивная болезнь КРС, клинически проявляющаяся внезапным повышением температуры тела до (+41°C)÷(+42°C), непродолжительной (1÷5 сут) лихорадкой, воспалением слизистых оболочек, ригидностью и хромотой (1, 2).
Возбудитель - РНК-содержащий вирус из группы рабдовирусов, в естественных условиях передается различного вида кровососущими насекомыми. Болезнь проявляется в теплое влажное время года, в период биологической активности кровососущих насекомых, быстро распространяется и протекает в виде энзоотии и эпизоотии.
В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV), ВЭЛ КРС относится к роду 01.062.0.03. Ephemerovirus, принадлежащему к семейству 01.062. Rhabdoviridae (3).
ВЭЛ КРС имеет пулевидную форму, размер 140×70 нм, полый осевой канал и сходен с вирусами везикулярного стоматита, фландерс, бешентсва и Керн Каньон, также относящихся к семейству рабдовирусов. В отличие от них ВЭЛ не имеет поперечной полосатости и внутренняя структура его вирусной частицы представлена 6-гранной белковой массой, а нуклеиновая кислота 2-нитевая. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа). Гликопротеин G может быть удален из вириона при обработке неионными детергентами, что применяется при изготовлении вакцинных препаратов (4÷6).
Эфемерная лихорадка КРС регистрируется ежегодно в основном в тропических и субтропических зонах (Израиле, Иране, Ираке, Сирии, Индии, Пакистане, Бангладеш, Китае, Японии, Австралии, Африке). Имеются сообщения о заболевании ею в Монголии и Средней Азии (4, 7, 8).
Эфемерная лихорадка КРС наносит значительный ущерб животноводству, обусловленный снижением привесов и молочной продуктивности.
Российская Федерация имеет общие границы с некоторыми из вышеуказанных стран, поэтому не исключена опасность возникновения этого заболевания в южных регионах страны. В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя эфемерной лихорадки КРС и впоследствии быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВЭЛ КРС, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.
Известен ряд штаммов ВЭЛ КРС, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.
Известен штамм YHL ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и HmLu-1 с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 Ig ТЦД50/см3 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки (9).
Известен штамм TLRI ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).
Известен штамм Liu Yin ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 5,6÷6,5 Ig ТЦД50/см3 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).
Известен штамм ВВ7721 ВЭЛ КРС, выделенный в 1968 г. из крови коровы с клиническими признаками эфемерной лихорадки, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и Vero и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (10-12).
Известен штамм 919 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС, полученный из полевого изолята в 1978 г. в Квинсленде (Австралия) и репродуцированный в культуре клеток Vero с титром инфекционности 5,3÷5,8 Ig ТЦД50/см3 (13).
Известен штамм «Монгольский» ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 6,0÷6,5 Ig ТЦД50/см3 и используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС (14).
Известен штамм РТ-1 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки, изолированный в 1990 г. из крови инфицированных коров и адаптированный к культурам клеток ВНК-21 и Vero (15).
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВЭЛ КРС, обладающих высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Указанная задача решена получением штамма «ВНИИЗЖ-М» (авторское наименование) ВЭЛ КРС, используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС.
Для получения ВЭЛ КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали монослойную перевиваемую линию клеток ВНК-21, как высокочувствительную к ВЭЛ КРС. В результате проведения 9 последовательных пассажей изолята на культуре клеток ВНК-21 был получен штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства и пригодный для изготовления сывороток и антигенов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
Накопление вируса штамма «ВНИИЗЖ-М» в культуре клеток ВНК-21 обеспечивалось на уровне от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД50/см3.
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС депонирован 21 июня 2007 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП ВЭЛ КРС.
Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:
фиг.1 представлена хроматограмма результатов электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента генома ВЭЛ КРС в 2% агарозном геле после окрашивания бромистым этидием, на которой:
1, 3 дорожка - маркер pUC 19 DNA/Mspl (Hpall) (стрелками указаны длины фрагментов п.н.);
2 дорожка - штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (специфический фрагмент ДНК длиной 460 п.н.);
фиг.2 - электронная микрофотография вирионов производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×50000.
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для семейства Rabdoviridae, рода Ephemerovirus.
Вирионы эфемерной лихорадки имеют пулевидную и конусовидную формы, диаметром 80÷110 нм, длиной 100÷170 нм и состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии, окруженного липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой имеются выступы длиной 5÷10 нм и диаметром 3 нм.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ-М» относится к ВЭЛ КРС.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Vero.
Введение вацинного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ коровам сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:4÷1:16.
Биотехнологические характеристики
Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ-М» репродуцируется в монослойных культурах клеток: Vero и перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в которых в течение 2-3 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 Ig ТЦД50/см3. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 14 пассажей.
Генотаксономическая характеристика
Геном ВЭЛ КРС не обладает инфекционностью и представлен молекулой двухнитевой РНК. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа).
Физические свойства
Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см3. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. При ультрацентрифугировании в течение 2 ч при 4°С большая часть вируса осаждается при 73000 g.
Устойчивость к внешним факторам
ВЭЛ КРС штамм «ВНИИЗЖ-М» не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например хлороформу (5%), этиловому спирту (20%), трипсину (0,5÷1%). Вирус чувствителен к кислой и щелочной среде, действию ультрафиолетовых лучей. Многократное замораживание и оттаивание не влияют на инфекционный титр вируссодержащего материала.
Дополнительные признаки и свойства
Безвредность - при подкожном введении крупному рогатому скоту 5,0 и 20,0 см3 вируссодержащего материала заболевания не вызывает.
Вирулентность - авирулентен для крупного рогатого скота при подкожном введении.
Стабильность биологических свойств. Сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток ВНК-21 в течение 14 серийных пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 3 пассажей на быках.
Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ-М», был выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС. Подготовку материала проводили общепринятыми методами.
Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, к культуре клеток ВНК-21. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток ВНК-21 высокочувствительна к ВЭЛ и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления антигена.
В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37±0,5°С. После этого вносили поддерживающую среду Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) культуральные матрасы промораживали при минус 30°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток Vero, выращенной во флаконах в виде 2-суточного монослоя. Для этого содержимое 3 ампул растворяли стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см3), тщательно перемешивали и объединяли. Готовили десятикратные разведения вируса на среде ПСП с содержанием 1% сыворотки КРС, начиная с 10-1 до 10-7. Затем в четыре флакона с монослоем клеток после удаления ростовой среды вносили по 1 см3 каждого разведения вируса, начиная с 10-1 по 10-7. Во флаконах с контрольной культурой клеток проводили только смену среды.
Флаконы инкубировали при 37±0,5°С, ежедневно просматривая их, начиная с 3 суток, под микроскопом на наличие специфической дегенерации клеток (ЦПД). Смену среды проводили через каждые 3 суток. Окончательный учет результатов проводили через 7 суток после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле. Расчет вели по методу Рида и Менча.
Титр производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС 8 пассажа составил в среднем 4,6 Ig ТЦД50/см3 в трех повторностях (4,5 Ig ТЦД50/см3; 4,66 Ig ТЦД50/см3; 4,66 Ig ТЦД50/см3), 9 пассажа составил в среднем 5,66 Ig ТЦД50/см3 (5,5 Ig ТЦД50/см3; 5,5 Ig ТЦД50/см3; 6,0 Ig ТЦД50/см3), 14 пассажа - 5,88 Ig ТЦД50/см3 (6,0 Ig ТЦД50/см3; 5,66 Ig ТЦД50/см3; 6,0 Ig ТЦД50/см3). Данные титрования представлены в таблицах 1, 2 и 3.
Пример 2.
Для проведения испытаний на стерильность использовали 20 ампул лиофилизированного производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.
Контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы контроля стерильности».
Содержимое ампул разводили водой для инъекций и объединяли по три ампулы. Из каждой пробы препарата по 1 см3 вносили в 3 пробирки, содержащие тиогликолевую среду, и пробирки инкубировали в течение 14 суток, при этом пробирки №№1 и 2 при 21±1°С, а пробирку №3 при 37±0,5°С. Затем из пробирки №3 делали пересевы:
1. По 0,5 см3 на следующие среды: скошенный казеиновый питательный агар, казеиновый питательный бульон, среда Сабуро (жидкая).
2. По 1,0 см3 на следующие среды: казеиновый питательный бульон под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени, казеиновый агар, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (МППБ), среда Сабуро при 21±1°С.
При испытании производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в течение 14 суток при 37±0,5°С, со средой Сабуро при 21±1°С.
Для исключения контаминации штамма микоплазмами были сделаны высевы по 0,5 см3 в 3 пробирки, содержащие по 4,5 см3 стандартного PPLO-бульона (20% лошадиной сыворотки; 1,47% PPLO-основы; 2,5% аутолизата дрожжей; 0,5% глюкозы; 0,25% аргинина; по 0,01% никотинамида динуклеотида и L-цистеина; 0,05% ацетата таллия; индикатор - феноловый красный). При отсутствии роста микоплазм на жидкой среде в течение 72 ч (сохранение цвета индикатора) проводили два «слепых» пассажа в течение 72 часов каждый, а затем делали высев на среду Каган. Пробирки просматривали визуально в течение 10 дней. При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте исследуемого материала.
В результате проведенных исследований установлено, что производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС свободен от грибов, анаэробных, аэробных, мезофильных бактерий и микоплазм.
Пример 3.
Определение авирулентности, безвредности, реверсибельности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.
Содержимое 15 ампул растворяли стерильным физиологическим раствором в объеме, равном объему препарата до лиофилизации, и объединяли. Для определения авирулентности, безвредности и реверсибельности вирус вводили подкожно по 5 см3 трем быкам.
Для определения реверсибельности проводили 3 пассажа на КРС. От первого животного через 5 дней после введения вируса отбирали кровь и в объеме 10 см3 ее вводили четвертому. От четвертого еще через 5 дней отбирали кровь и в таком же объеме вводили пятому. Ежедневно за животными вели наблюдение и проводили термометрию.
Через 21 день после введения вируса у животных брали пробы крови для определения наличия антител к ВЭЛ КРС.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таким образом, производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС не вызывает заболевание и гибель животных, является авирулентным, безвредным и нереверсибельным.
Пример 4.
Определение специфичности, антигенной и иммуногенной активности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.
Антигенную активность вакцинного штамма определяли на четырех быках. Вирус вводили подкожно в область шеи в объеме 5 см3 в дозе 5,5 Ig ТЦД50/см3.
До введения вируса (нулевые пробы) и через 21 день после введения вакцинного штамма у животных брали кровь для определения в сыворотке крови титра вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител. За животными вели ежедневное клиническое наблюдение в течение 21 суток с измерением температуры тела.
Вируснейтрализующую активность антител сывороток крови определяли в РН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с активностью 2,0 Ig ТЦД50/см3. Смеси вируса с сывороткой выдерживали в течение 1 часа при температуре 37,0°С, после чего ими инфицировали клеточную культуру Vero (по 4 флакона с культурой клеток на каждое разведение сыворотки). Флаконы с культурой клеток инкубировали при температуре 37±1°С в стационарном положении в течение 7 суток со сменой среды через 3-4 суток. За титр антител в сыворотке принимали наибольшее ее разведение, в котором подавлялось развитие ЦПД не менее чем в половине зараженных пробирок с культурой клеток.
При постановке РН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5. Титр вируснейтрализующих антител находился в пределах 1:8÷1:16.
Комплементсвязывающую активность сывороток крови животных определяли в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) общепринятым методом. С этой целью готовили двукратные разведения сыворотки крови КРС на физиологическом растворе рН 7,6.
Специфичность вируса подтвердили в РН и РДСК с типоспецифической сывороткой крови на ВЭЛ КРС, а также с использованием гетерогенных сывороток крови против вируса бешенства, чумы КРС и оспы овец.
Методом контрольного заражения КРС, иммунизированного вакциной из штамма ЭЛ «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС в дозах 1,0; 5,0 и 20,0 подкожно, через 21 день после вакцинации установлено, что вакцина защищала животных от заболевания при введении в дозах 5,0 и 20,0 см3. Титры антител в крови животных были в РН 1:4÷1:16, а в РДСК 1:10, а после заражения 1:20 (таблицы 6 и 7).
Пример 5.
Контроль производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС на специфичность и отсутствие контаминации чужеродными вирусами
Для исследования была использована вируссодержащая суспензия с инфекционным титром 6,0 Ig ТЦД50/см3.
Специфичность исследуемого вируса подтверждали с помощью метода ПЦР. В работе использовали праймеры F1, 460R (Hsieh Y.-C. 2006), позволяющие амплифицировать фрагмент гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС. Анализ продуктов реакции осуществляли после 40 циклов (денатурация 94°С 30 с, отжиг праймеров 55°С 30 с и элонгация 72°С 1 мин). Результаты исследований представлены на фиг.1.
В результате проведения ПЦР с праймерами F1, 460R фрагмента гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС получен фрагмент размером около 460 п.н., что соответствует расчетному размеру.
С использованием метода ПЦР были проведены исследования по выявлению в исследуемом материале вируса инфекционного ринотрахеита, вируса парагриппа-3, вируса диареи и ротавируса КРС.
Последовательностей, специфичных для указанных вирусов, не обнаружено.
Сыворотки крови КРС, зараженного ВЭЛ КРС, были исследованы с помощью метода иммуноферментного анализа (набор для выявления антител к вирусу болезни Ауески фирмы IDEXX Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit) на наличие антител к вирусу болезни Ауески до и через 21 день после заражения. Сыворотки крови КРС не содержали антител к гетерологичному вирусу.
ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М», негативно контрастированный при помощи 4% фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) с рН=6,8, представлен вирионами сложного строения, состоящими из нуклеокапсида, окруженного гликопротеиновой оболочкой пулевидной и конусовидной формы диаметром 80÷110 нм и длиной 100÷170 нм. Кроме указанных форм частиц в препарате содержались частицы неправильной формы.
Электронно-микроскопическим методом подтверждена принадлежность штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС к семейству Rabdoviridae, роду Ephemerovirus. Наличие контаминации штамма вируса ЭЛ КРС чужеродными агентами (вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами) не установлено. Результаты исследований представлены на фиг.2.
Полученный штамм депонирован 21 июня 2007 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП ВЭЛ КРС.
Пример 6
Получение антигена ВЭЛ КРС.
Для приготовления антигена для диагностических целей содержимое 3-х ампул ВЭЛ штамма «ВНИИЗЖ-М» растворяют стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см3), тщательно перемешивают и объединяют. Трехсуточную культуру клеток ВНК-21 монослойной (шведской) линии, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражают в дозе 0,1÷1,0 Ig ТЦД50/см3. Матрасы помещают на 1 час в термостат для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносят поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубируют при 37±0,5°С до появления ЦПД вируса, которое характеризуется округлением клеток, их скоплением и в дальнейшем разрушением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергают двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.
Полученную вирусную суспензию используют в качестве матровой расплодки, которой заражают клинские матрасы с культурой клеток ВНК-21, и, как описано выше, получают 11÷12 пассаж вируса. При появлении ЦПД на 70÷80% площади монослоя, сливают ростовую среду, оставляя около 20 см3, и стерильным резиновым шпателем отделяют инфицированный слой клеток от стекла в культуральную жидкость.
Концентрирование антигена ВЭЛ осуществляют отделением клеточной фракции путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют физиологическим раствором из расчета 1 см3 на каждый матрас, что соответствует двухсоткратной концентрации вируса. Полученный концентрат подвергают двукратному промораживанию при минус 20°С и оттаиванию.
Полученный данным способом антиген используют в серологических реакциях для определения уровня антител к ВЭЛ, а также для изготовления диагностических сывороток.
Результаты исследований, приведенные в таблице 8, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 6, получен антиген, который является специфичным, что подтверждено их тестированием с гомологичными и гетерологичными сыворотками.
Пример 7
Получение гипериммунной сыворотки.
Для приготовления диагностических сывороток крови используют очищенный и концентрированный препарат антигена ВЭЛ КРС из штамма «ВНИИЗЖ-М».
Очистку антигена проводят в два этапа: на первом этапе используют 20%-ный раствор сахарозы, на втором - градиент плотности сахарозы (5%, 10%, 15%, 20% и 25% растворы). В обоих случаях соотношение вирусного материала и сахарозы должно составлять 3:1 соответственно. Первоначально вирусный материал очищают центрифугированием через 20% раствор сахарозы в течение 1,5 часов при 20000 об/мин. Полученный осадок растворяют в физиологическом растворе до первоначального объема исходного материала и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы при 20000 об/мин в течение 2 ч. Образовавшийся осадок ресуспендируют в минимальном объеме физиологического раствора и используют в дальнейшем в качестве антигена для иммунизации животных.
Получение гипериммунной сыворотки КРС.
Иммунизируют животных четырехкратно. После первого введения антигена иммунизацию проводят на 21, 28 и 35 дни с интервалом в 7 дней между инъекциями. Для иммунизации используют 2 см3 антигена с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 внутримышечно либо 1 см3 антигена с содержанием 0,25 мг сапонина подкожно. Через 7 дней после последней иммунизации отбирают кровь для получения сыворотки. Проверку проб сыворотки крови проводят на активность и специфичность в РДСК с набором специфических и гетерологичных антигенов. Результаты исследований приведены в таблице 9. Для составления серийного перпарата используют сыворотки крови, активность которых со специфическим антигеном в РДСК не ниже 1:20, а с гетерологичным антигеном они должны быть неактивны. Сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.
Получение гипериммунной сыворотки на кроликах.
Для получения специфической сыворотки ВЭЛ КРС на кроликах используют клинически здоровых животных средней упитанности массой 2,5-3,0 кг. Животных иммунизируют четырехкратно с интервалом в 7 дней.
При первой иммунизации очищенный и концентрированный антиген вводят в объеме 1,0 см3 в подушечки задних лап, при второй - 2,0 см3 в область подколенных лимфоузлов, при третьей - внутримышечно в бедро задней ноги 0,5 см3 антигена и 0,5 см3 полного адъюванта Фрейнда, при четвертой - 0,5 см3 антигена и 0,5 см3 неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины в несколько точек.
Возможна и следующая схема иммунизации: кроликам аналогичным способом вводят при первой иммунизации 0,5 см3 антигена и 0,5 см3 полного адъюванта Фрейнда, при второй - 1,0 см3 антигена и 1,0 см3 неполного адъюванта Фрейнда, при третьей и четвертой - 0,5 см3 антигена и 0,5 см3 неполного адъюванта Фрейнда.
Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливают и получают сыворотку крови. Сыворотки крови фасуют в ампулы по 1,0 см3, лиофильно высушивают. Препараты сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.
Данные, представленные в таблицах 9, 10 и 11, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 7, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.
Полученные гипериммунные сыворотки крови КРС и кроликов были использованы для определения в РДСК специфической активности культурального производственного штамма ВЭЛ «ВНИИЗЖ-М» и для ретроспективной диагностики: определения уровня антител в крови животных, переболевших эфемерной лихорадкой, титр антител в крови которых был в пределах 1:5÷1:40.
При гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов концентрированным и очищенным антигеном вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота с адъювантом Фрейнда получена специфическая сыворотка крови с активностью 1:80 и 1:160 соответственно, которая может быть использована в РДСК для определения активности специфического антигена и ретроспективной диагностики заболевания КРС эфемерной лихорадкой.
Источники информации
1. Курченко Ф.П., Гононов Ю.М., Хлыбова Т.В., Зайцев В.Л., Кекух И.Г., Пасечников Л.Н., Алехин А.Ф. и Вяткина Н.В. Выделение и идентификация вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота. Ветеринария, 1991, 2,26÷28.
2. OIE. Bovine ephemeral fever. Ames. Jowa State Univ., 2005.
3. http://www.ictvdb.org/lctv/fs rhabd.htm.
4. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - с.319÷323.
5. Nandi S., Negi B.S. Bovine ephemeral fever: a review // Comparative Immunol., Microbiol. and Infectious Diseases. - 1999. - N 22. - P.81÷91.
6. Walker P.J. Bovine ephemeral fever virus // Encyclopedia of Virology, Third ed. - 2008. - P.354÷362.
7. Диев В.И., Назаров А.С. и Соколов Л.Н. Клинические признаки эфемерной лихорадки крупного рогатого скота при экспериментальном заражении // Тез. докл. 4-ой Межгосуд. конф. по научн. и приклад. проблемам 21÷23.10.1993 г., Киев, 1993.
8. George T.D. Studies on the pathogenesis of bovine ephemeral fever in sentinel cattle. Vet Microbiol., 1985, 10, 6, 493÷504.
9. Chiu S.Y., Lu Y.S. The serological study on bovine ephemeral fever in Taiwan in 1984 // Journal of the Chinese Society Veterinary Science. - 1986. - Vol.12. - P.289÷296.
10. Walker P.J. et al. Proteins of bovine ephemeral fever virus // J. Gen. Virol. - 1991. N 72. - P.67÷74.
11. Walker P.J. et al. The genome of ephemeral fever Rhabdovirus contains two related Glycoprotein genes // J. Virol. - 1992. - N 191. - P.49÷61.
12. Zakrzewsky H., Cybinski D.H., Walker P.J. A blocking ELISA for the detection of specific antibodies to bovine ephemeral fever virus // J. Immunol. Methodes. - 1992. - N 151. - P.289÷297.
13. Vanselow B.A., Walthall J.C., Abetz I. Field trials of ephemeral fever vaccines//Vet. Microbiol. - 1995. - N 46. - P.117÷130.
14. Диев В.И., Назаров А.С., Захаров В.М. и соавт. Экспериментальные исследования по изучению клиники эфемерной лихорадки крупного рогатого скота и получению диагностических препаратов // Вирусные и микробные болезни сельскохозяйственных животных: сб. научн. труд. - Владимир, 1995. - С.128÷131.
15. Chang C.J. et al. Apoptosis induced by bovine ephemeral fever virus // J. Virol. Methodes. - 2004. - Vol.122, №2. - P.165÷170.
| Таблица 1 | ||||||||
| Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 8 пассаж от 03.1993 г. | ||||||||
| Повтор ность титрова ния |
Разведение вируса | Титр вируса, Ig ТЦД50/см3 | ||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | ||
| №1 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ---- | ---- | ---- | 4,5 |
| №2 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +--- | +--- | ---- | 4,66 |
| №3 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +--- | +--- | ---- | 4,66 |
| Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе. |
| Таблица 2 | ||||||||
| Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 9 пассаж от 03.2007 г. | ||||||||
| Повторность титрования | Разведение вируса | Титр вируса, Ig ТЦД50/см3 | ||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | ||
| №1 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ---- | ---- | 5,5 |
| №2 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ---- | ---- | 5,5 |
| №3 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++-- | ---- | 6,0 |
| Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе. |
| Таблица 3 | ||||||||
| Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 14 пассаж от 04.2007 | ||||||||
| Повторность титрования | Разведение вируса | Титр вируса, Ig ТЦД50/см3 | ||||||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | ||
| №1 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++-- | ---- | 6,0 |
| №2 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +--- | ---- | 5,66 |
| №3 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++-- | ---- | 6,0 |
| Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе. |
| Таблица 4 | |||
| Результаты исследования авирулентности, безвредности и реверсибельности штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС | |||
| № п/п | Возраст быков (мес.) | Хар-ка материала | Клинические признаки |
| 1 | 18 | Культуральный вирус в объеме 5 см3 | Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. |
| 2 | 14 | Культуральный вирус в объеме 5 см3 | Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. |
| 3 | 14 | Культуральный вирус в объеме 5 см3 | Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. |
| 4 | 18 | Гепаринизированная кровь в объеме 10 см3 | Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. |
| 5 | 18 | Гепаринизированная кровь в объеме 10 см3 | Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. |
| Примечание: титр культурального вируса - 5,5 Ig ТЦД50/см 3 |
| Таблица 5 | |||||
| Результаты исследования антигенной активности штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС | |||||
| № животного | Вид и возраст | Титр вируснейтрализующих антител (дни) | |||
| До имунизации | 7 | 14 | 21 | ||
| 1 | бык 18 мес. | н/а | н/а | 1:4 | 1:8 |
| 2 | бык 14 мес. | н/а | н/а | 1:4 | 1:8 |
| 3 | бык 14 мес. | н/а | 1:2 | 1:4 | 1:16 |
| Таблица 6 | ||||||
| Результаты контроля напряженности иммунитета КРС после иммунизации вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС | ||||||
| №№ КРС | Иммунизация в дозе (см3) | Титр антител в крови в РН на 21 день после вакцинации | Температура тела (дни после заражения) | |||
| 0 день | 5 | 6 | 7 | 8 | ||
| 1 | 20 внутривенно | 1:16 | N | N | N | N |
| 2 | 5,0 подкожно | 1:8 | N | N | N | N |
| 3 | 5,0 подкожно | 1:8 | N | N | N | N |
| 4 | 1,0 подкожно | 1:4 | 41,2* | 41,0* | 40,5* | N |
| 5 | контроль | - | 41,6* | 41,2* | 40,2* | N |
| N - показатели в пределах физиологической нормы; * - наличие клинических признаков; - - отсутствие антител. |
| Таблица 7 | |||
| Динамика антител в крови КРС после иммунизации и контрольного заражения вирулентной кровью КРС | |||
| №№ КРС | Титры антител в РДСК | ||
| дни после вакцинации | 14 дней после заражения | ||
| 14 | 21 | ||
| 1 | 1:10 | 1:10 | 1:20 |
| 2 | 1:10 | 1:10 | 1:20 |
| 3 | - | - | 1:10 |
| 4 | - | - | 1:20 |
| 5 | - | - | 1:10 |
| Таблица 8 | ||
| Активность антигена ВЭЛ КРС | ||
| Материал | Титр | |
| инфекционной активности, Ig ТДЦ50/см3 | в РДСК | |
| Исходный вирус | 5,5±0,14 | 1:4 |
| Нативный вирус | 6,0±0,03 | 1:8 |
| Антиген | 8,5±0,15 | 1:320 |
| Таблица 9 | ||||
| Специфическая активность сыворотки крови после иммунизации крупного рогатого скота ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М» | ||||
| Метод иммунизации | Титры антител после иммунизации в РДСК | |||
| 1-ой | 2-ой | 3-ей | 4-ой | |
| 1,0 см3 антигена + 0,25 мг сапонина подкожно | 1:30 | 1:30 | 1:40 | 1:60 |
| 1,0 см3 антигена + 1,0 см3 адъюванта Фрейнда* внутримышечно | 1:30 | 1:40 | 1:80 | 1:80 |
| * - при первой иммунизации использовали полный адъювант Фрейнда, а при следующих - неполный |
| Таблица 10 | |||||
| Специфическая активность сыворотки крови после гипериммунизации кроликов антигеном ВЭЛ КРС | |||||
| №№ группы животных | Метод иммунизации | Титр антител в РДСК | |||
| в подушечки задних лап | в область подколенных лимфоузлов | в бедро задней лапы внутримышечно | в область спины подкожно | ||
| 1 | 1,0 см3 Аг* | 2,0 см3 Аг* | 0,5 см3 Аг* + 0,5 см3 полного адъюванта Фрейнда | 0,5 см3 Аг* + 0,5 см3 неполного адъюванта Фрейнда | 1:160 |
| 2 | 0,5 см3 Аг*+0,5 см3 полного адъюванта Фрейнда | 1,0 см3 Аг*+1,0 см3 неполного адъюванта Фрейнда | 0,5 см3 Аг* + 0,5 см3 неполного адъюванта Фрейнда | 0,5 см3 Аг* + 0,5 см3 неполного адъюванта Фрейнда | 1:80 |
| * Аг - специфический антиген ВЭЛ КРС |
| Таблица 11 | ||||
| Активность гипериммунной сыворотки крови против ЭЛ с гетерологичными антигенами | ||||
| Антиген | Активность в РДСК | |||
| сывороток КРС | сывороток кроликов | |||
| Гомологичный ВЭЛ | 1:60 | 1:80 | 1:80 | 1:160 |
| Антигены ящурные штаммоспецифические сухие для серологических реакций ТУ 9388-006-00495527-99 | н/а | н/а | н/а | н/а |
| Набор препаратов для диагностики чумы КРС методами РСК и РДП ТУ 9388-073-00495527-01 | н/а | н/а | н/а | н/а |
| н/а - сыворотка крови неактивна |
Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС) Ephemerovirus bovinum сем. Rabdoviridae, депонированный в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП, для приготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.
