Среды для культур клеток млекопитающих, которые содержат надосадочную жидкость стадий фракционирования по кону, и их применение



Среды для культур клеток млекопитающих, которые содержат надосадочную жидкость стадий фракционирования по кону, и их применение
Среды для культур клеток млекопитающих, которые содержат надосадочную жидкость стадий фракционирования по кону, и их применение
Среды для культур клеток млекопитающих, которые содержат надосадочную жидкость стадий фракционирования по кону, и их применение
Среды для культур клеток млекопитающих, которые содержат надосадочную жидкость стадий фракционирования по кону, и их применение

 


Владельцы патента RU 2461629:

ГРИФОЛЬС, С.А. (ES)

Изобретение относится к биохимии, в частности к средам для культивирования клеток млекопитающих. Среда для культивирования клеток млекопитающих содержит надосадочную жидкость фракции I плазмы человека по методу Кона или надосадочную жидкость фракции II+III плазмы человека по методу Кона в дополнение к обычным питательным веществам в основной культуральной среде для культивирования клеток млекопитающих. Также изобретение относится к применению указанной выше среды и к способу ее получения. Способ включает получение надосадочной жидкости фракции I или II+III фракционирования плазмы человека по методу Кона путем осаждения этанолом, отделения надосадочной жидкости, замораживания или высушивания и, необязательно, разведения и/или диализа, или диафильтрации, и/или удаления патогенных агентов; и последующее добавление надосадочной жидкости фракции I или II+III, полученной таким образом, к основной культуральной среде. Изобретение позволяет обеспечить эффективное поддержание и/или пролиферацию культивируемых клеток млекопитающих. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 7 табл., 10 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к добавке для применения в средах для культур клеток млекопитающих. Указанную добавку получают из дефибринированной плазмы человека (по существу не содержащей фибриногена и фибрина) и при ее добавлении в качестве добавки к культуральным средам она предоставляет различные питательные вещества и факторы для приемлемого поддержания и/или пролиферации культивируемых клеток.

Предпосылки изобретения

Культуры клеток используют в биотехнологической промышленности преимущественно для продуцирования рекомбинантных белков и моноклональных антител. Однако недавно была разработана технология культивирования различных типов коровых клеток для применения в клеточной терапии, в сочетании с генной терапией или без нее.

Для успешного культивирования и поддержания различных клеточных линий требуется среда, которая имитирует условия внутренней среды, в которой эти клетки обнаруживаются in vivo. Как правило, культуральная среда состоит из основной среды, которая предоставляет pH, питательные вещества и соли и к которой можно добавить ряд добавок для обеспечения клеточной пролиферации. Одной из наиболее широко используемых добавок является сыворотка крови животных. Результатом животного происхождения сыворотки могут являться значительные ограничения в ее использовании для получения продуктов для применения у людей, поскольку остатки животного происхождения узнаются в качестве чужеродных антигенов и могут вызывать неблагоприятные реакции у реципиентов. Более того, недостатком животной сыворотки является потеря определенной композиции, поскольку существует сильная вариабильность между производителями из-за использования различных пород животных. Кроме того, существует значительная вариабильность между партиями из-за способов, при помощи которых их получают, которая означает, что могут иметь место широкие вариации в способности роста и продуктивности конкретной культуры.

Основная трудность при образовании клеточных линий представляет собой получение подходящей питательной среды, которая способна заменить натуральную среду, такую как эмбриональные экстракты, белковые гидролизаты или сыворотки. Первой группой сред, таких как среда Eagle basal (MEM) (Eagle, H. (1955) «The specific aminoacid requirements of mammalian cells (strain L) in tissue culture». J. Biol. Chem. 214: 839 и более сложная среда 199 Моргана с соавт. (Morgan, J.G., Morton, J.H. and Parker, R.C. (1950) «Nutrition of animal cells in tissue culture. I Initial studies on a synthetic medium». Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73: 1), представляли определенные среды, однако они требуют добавки сыворотки от 5 до 20%.

Для исключения вклада неопределенных сложных сред были составлены более сложные среды, такие как NCTC 109 (Evans, V.J., Bryant, J.C., Fioramonti, M.C., McQuilkin, W.T., Sanford, K.K., and Earle, W.R. (1956) «Studies of nutrient media for tissue C cells in vitro. I A protein-free chemically defined medium for cultivation of strain L cells» Cancer Res. 16: 77), 135 (Evans, V.J. and Briant, J.C. (1965) «Advances in tissue culture at the National Cancer Institute in the United States of America» in «Tissue culture», edited by C.V. Ramakrishnan, W. Junk, The Hague, p.145-167), Ham F10 и F12 (Ham, R.G. (1963). «An improved nutrient solution for diploid Chinese hamster and human cell lines». Exp. Cell Res. 29: 515, Ham, R.G. (1965) «Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined synthetic medium» Proc. Natl. Sci. USA 53: 288), серии MCDB (Ham, R.G. and McKeehan, W.L. (1978) «Development of improved media and culture conditions for clonal growth of normal diploid cells» In vitro 14: 11-22) и среда Sato с гормональными добавками (Barnes, D. and Sato, G. (1980) «Methods for growth of cultured cells in serum-free medium». Anal. Biochem. 102: 255-270).

Рекомендуемый подход для образования определенных сред - начинать с богатой среды, например, Ham F12, с добавлением сыворотки в высокой концентрации (20%) и проверять добавки для уменьшения количества сыворотки до тех пор, когда ее можно будет уменьшить или исключить.

После многих лет исследования композиции сред они все еще подбираются эмпирически.

Основные используемые среды и их применения представляют собой следующие:

- Основная среда Eagle (EBM). Это основная среда с добавлением только существенных аминокислот. Она всегда требует добавления 10% эмбриональной сыворотки теленка. Ее применяют для выращивания фибробластов мыши и клеток HeLa.

- Минимальная существенная среда Eagle (MEM). Она представляет собой наиболее широко применяемую среду, которая содержит больше аминокислот в более высокой концентрации, чем EBM. Ее используют почти для любого типа культур и для нее требуется добавление сыворотки (10%).

- R.P.M.I. 1640. Она представляет собой среду, предназначенную для выращивания в суспензии линий предшественников лимфоцитов и лейкозных клеток. С соответствующими добавками она обладает широким диапазоном применений.

- Среда Dulbecco Modified Eagle (DMEM). Она содержит аминокислоты и витамины в четырехкратной концентрации по сравнению с EBM. Ее применяют с HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин) или HT (гипоксантин-тимидин) для отобранных гибридом.

- Среда Iscove modified DMEM (IMDM). Это очень сложная среда с составом, который в числе других элементов включает бычий альбумин, трансферрин и селенит. Она очень подходит для культивирования лимфоцитов в бессывороточной среде. Она также используется для других типов клеток, однако в этом случае требуются низкие концентрации сыворотки.

- Среда McCoy 5a. Предназначена для выращивания линий диплоидных клеток как крыс, так и людей.

- Среда Leibovitz L-15. Используется для культивирования вирусов.

- Среда Ham F-10. Ее применяют для выращивания линий клеток человека и в нее необходимо добавлять белки и гормоны. Она содержит металлы, такие как Fe, Cu и Zn. Ее используют для культур амниотических клеток.

- Среда Ham F-12. Ее применяют с белковыми добавками для выращивания линий клеток. В комбинации с IMDM ее можно использовать в качестве бессывороточной среды.

- Среда 199. Ее очень широко применяют для культуры недифференцированных клеток и для изучения хромосомных нарушений.

Все культуральные среды содержат следующие элементы:

1. Уравновешенные физиологические растворы (BSS).

2. Аминокислоты.

3. Витамины.

4. Другие органические низкомолекулярные добавки (нуклеозиды, промежуточные соединения цикла Кребса, соль или эфир пировиноградной кислоты, липиды).

5. Гормоны и факторы роста (сыворотка).

6. Контаминантные ингибиторы роста (антибиотики и фунгициды).

В неопределенных средах сыворотка обычно содержит гормоны и факторы роста. Типами используемой сыворотки являются сыворотка теленка (CF), эмбриональная сыворотка теленка (FCS), сыворотка лошади (HS) и сыворотка человека (HuS). Наиболее широко применяется сыворотка теленка, в то время как эмбриональная сыворотка теленка используется для более требовательных линий, а сыворотку человека применяют для линий человека.

Использование сыворотки является проблематичным, поскольку, несмотря на то, что композиция сыворотки частично известна, существует большое количество компонентов, присутствующих в переменных количествах, которые могут существенно воздействовать на культуру. Кроме того, сыворотка варьирует от партии к партии вследствие вариантности методик получения крови, способов получения сыворотки (свертывания крови) и условий сепарирования сыворотки, а также различия между многообразными источниками сыворотки. Более того, каждое изменение партии сыворотки требует трудоемких и дорогостоящих проверок. Далее, если продукты культуральной среды предстоит очищать, присутствие вариабельных компонентов в сыворотке делает эти процессы значительно более трудными.

Некоторые факторы сыворотки, такие как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), стимулируют пролиферацию фибробластов, что может представлять собой проблему при образовании специализированных первичных культур, особенно если существует широкое варьирование их содержания.

В конечном счете, включение сыворотки в культуральную среду представляет собой значительное препятствие для стандартизации экспериментальных протоколов и продукции клеток. Вследствие этого прилагаются большие усилия для создания сред с определенной композицией для клеточного роста. Наряду с необходимой воспроизводимостью это позволяет создавать селективные среды, в которых могут расти клетки требуемого типа. Неудобством этих сред является то, что во многих случаях клеточный рост ослабляется и клеточные линии остаются жизнеспособными для меньшего числа генераций.

Были предприняты различные попытки продуцирования добавок к средам для культивирования клеток, которые устраняют проблемы, определяемые используемой в настоящее время сывороткой. Среди них были проверены различные фракции плазмы человека и обнаружены значительные несоответствия в известном уровне техники в отношении пригодности различных фракций плазмы человека.

В большинстве случаев были проверены различные фракции плазмы человека, образованные при фракционировании плазмы с использованием способа по Кону (Cohn E.J. et al.; J. Am. Chem. Soc., 1946) и его вариаций (Kistler и Friedli, Nischmann; in Curling, JM ed, Methods of plasma fractionation, Academic Press 1980), все эти тесты были направлены на использование различных преципитатов, полученных при фракционировании, особенно фракций II+III, III, IV (IV1 или IV4) и V, или их эквивалентов в различных вариантах способа фракционирования.

Начальной целью разделения отмеченных выше фракций (преципитата) является получение преципитата, обогащенного определенным белком, в качестве отправной точки очистки указанного белка, например, γ-глобулинами и α- и β-глобулинами в случае фракций II+III или III; α-глобулинами и трансферрином во фракции IV и альбумином во фракции V. Таким образом, эти фракции обычно обладают одним типом белков, другие белки, присутствующие в качестве загрязнений, обычно в значительно меньших количествах. Использование этих фракций в клеточных культурах предусматривает добавление к культуральной среде основного типа белка и разнообразие белков, которые сопровождают первый в качестве загрязнений, среди которых должны присутствовать те, которые необходимы клеткам в культуральной среде, если применение указанного материала будет успешным. До сих пор существовал очевидный, но неэффективный путь дополнения сред для культивирования клеток. Несомненно, это является причиной несоответствия в полученных результатах, поскольку небольшие вариации в способах фракционирования не должны оказывать значительного влияния на выход основного белка, однако может привносить сильную вариабельность в выход различных сопровождающих белков. Например, фракцию II+III с использованием способа по Кону получают при концентрации этанола от 20% до 25% при -5°C и pH 6,9. При использовании способа Nitschmann, начиная с эквивалентного материала, его преципитируют при концентрации этанола 19% при -5°C и pH 5,8. С этой вариацией в pH фракции получают с различными характеристиками, особенно по содержанию γ-глобулинов и других сопутствующих белков.

Более того, применение надосадочных жидкостей по сравнению с использованием преципитатных фракций обладает дополнительными преимуществами, включая преимущество поддержания высокой концентрации альбумина в среде и, прежде всего, избежания потери компонентов (например, гормонов, цитокинов, липидов и т.д.), которые важны для клеточного роста и которые могут не присутствовать в преципитатах или могут утрачивать свою фунциональность (инактивироваться) в присутствии концентраций алкоголя более чем 20%, таких как концентрации, используемые для преципитации фракции II+III в определенных условиях (25%) или фракций IV1+IV4 и V (40% этанол).

Документ EP0143648 (Macleod) описывает применение фракций II+III, III, IV1 и IV4 в качестве добавок для культуральных сред вместо сыворотки животных. Также утверждается, что ни фракция II, ни фракция V не подходят для этого применения. Во всех случаях, этот документ относится исключительно к фракциям, преципитируемым при фракционировании по Кону или его вариантам. В добавление, документ раскрывает способ получения материала, пригодного для добавления к культуральным средам из вышеприведенных фракций. Этот способ состоит в основном из суспендирования преципитата в воде и гомогенизации указанного преципитата. Далее, pH регулируют для достижения лучшей растворимости белков и получения физиологических условий для клеточного роста. Затем, этот способ также рассматривает удаление присутствующего γ-глобулина путем преципитации полиэтиленгликоля и отделения материала с низкой молекулярной массой при помощи молекулярно-эксклюзионной хроматографии. Поэтому эффективность материала, полученного таким путем, сильно зависит от конкретного способа обогащения.

Другой документ Macleod (Advances в Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 37; 1988) свидетельствует, что фракции II, III и IV оказывают незначительный эффект или совсем не оказывают эффекта на клеточный рост, возможно, из-за присутствия ингибиторов роста, и заостряет внимание на фракции IV4 как на идеальном материале для добавления к культуральным средам.

EP 0440509 (Macleod) описывает добавку для клеточных культуральных сред на основе фракции IV или фракции II+III по Кону и процесс ее получения. При помощи описанного процесса получают продукт, который по существу не содержит иммуноглобулины, у которого инактивированы вирусы и который является стабильным. Иммуноглобулин отделяют преципитацией полиэтиленгликолем и вирусы инактивируют пастеризацией в присутствии сорбита в качестве стабилизатора. Этот процесс особенно подходит для фракции IV (IV1 или IV4).

Документ EP 0264748 (Antoniades) описывает надосадочную жидкость фракции V по Кону в качестве добавки для клеточной культуральной среды вместо животной сыворотки. В соответствии с этим документом преимуществом этого материала является то, что он является бесплатным и его можно нагревать до 60°C в течение 20 часов.

Надосадочная жидкость фракции V представляет собой конечный материал отходов от фракционирования по Кону, и поэтому ее использование, очевидно, не обладает оптимальными затратами для приуменьшения преимуществ указанного фракционирования. Этот материал обладает высоким содержанием этанола (40%), который является высокотоксичным и который должен быть удален (в данном документе последнее не утверждается). Более того, для обработки, описанной для 60°C, присутствующие белки следует стабилизировать, однако эта деталь также опущена из данного документа, что делает изобретение трудным для осуществления так, как описано. Не следует недооценивать денатурирующего эффекта этанола при такой высокой концентрации, как в данном случае.

WO 94/18310 (Mankarious) описывает способ изготовления добавок в среды для клеточных культур из фракции IV4 по Кону. Этот способ рассматривает суспендирование и последующее осветление фракции IV4, а также инактивацию или уничтожение вирусов путем пастеризации и/или фильтрации.

Патент GB 2166756 A описывает способ культивирования клеток селезенки для продуцирования интерферона. Этот способ основывается на культуральной среде RPMI, в которую добавляют сывороточную фракцию, полученную из сыворотки или плазмы, из которой был удален фибриноген и которая характеризуется тем, что преальбумин и гамма-глобулины были удалены (страница 1, строки 30-34). В предпочтительном варианте осуществления эту фракцию очищают путем преципитации в алкоголе с концентрацией 10-20% при pH 5,85 (страница 1, строки 37-38). В специфическом варианте осуществления (получение фракции EPF) надосадочную жидкость используют в качестве культуральной среды, полученной при концентрации этанола 19% и pH 5,85 (страница 2, строки 44-45). Полученную надосадочную жидкость диализуют для удаления этанола и затем лиофилизируют для ее сохранения. Необязательно ее лиофилизируют без предварительного диализа, и поэтому этанол также удаляется. Согласно заявителям с использованием культуральной среды (RPMI) с добавлением указанной фракции получают продукцию внеклеточного интерферона. При преципитации плазмы алкоголем условия процесса (концентрация этанола, pH, ионная сила среды, температура и концентрация белка) должны быть тщательно установлены для поддержания определенных белков в растворе, а другие сделать нерастворимыми, так что они преципитируют, и их поэтому можно разделить. Вариации в одном или более указанных условий должны приводить к значительным различиям в полученном продукте, концентрации этанола и pH, представляя собой факторы, определяющие композицию преципитата и полученной надосадочной жидкости.

Предпринимались другие попытки получения добавок к средам для культивирования клеток с использованием сыворотки или фракций сыворотки человеческого происхождения вместо эмбриональной сыворотки теленка, как продемонстрировано в документах WO 2004/1055174, EP 1820852 или CA 1177424. Сыворотку, полученную из цельной крови или из плазмы, нельзя сравнивать со специфически определенной и охарактеризованной фракцией плазмы, и она обладает недостатком потери воспроизводимости между партиями. Кроме того, ни один из этих документов не отличается определением и характеристикой точной композиции используемого материала. Следовательно, продолжает оставаться большинство проблем, связанных с применением сыворотки животного происхождения.

Kwok с соавт. раскрыл применение плазмы беременных женщин вместо эмбриональной сыворотки теленка для культивирования специфических типов клеток, приписывая ее действие присутствию неизвестных факторов. Он также постулирует синергическое действие альбумина человека в этом типе культуры. Для специалистов в данной области понятно, что путем использования плазмы беременных женщин определяют присутствие факторов роста клеток, сравнимые с таковыми эмбриональной сыворотки, однако гомогенность этого материала не сравнима со смесями плазм от тысяч доноров, как описано ниже.

Как описано здесь выше, были предприняты многочисленные попытки замены животной сыворотки в качестве добавки к среде для культивирования клеток. Некоторые из этих попыток были предприняты для фракций плазмы человека, в особенности фракций с использованием способа по Кону. Несмотря на это, в настоящее время животную сыворотку продолжают широко использовать в качестве добавки для культуры клеток млекопитающих и попытки ее замены производной плазмы человека потерпели неудачу.

Из всего вышеприведенного можно заключить, что в известном уровне техники не представлен материал человеческого происхождения, который можно было бы применять для добавки к средам для культивирования клеток и который также являлся бы безопасным с точки зрения передачи патогенных агентов, который можно получать в промышленном масштабе с приемлемыми затратами и прибылью, обладающий достаточным единообразием между партиями и качеством фармацевтической категории.

Описание изобретения

Авторы изобретения провели исследование, имеющее своей целью замену сыворотки животного происхождения в качестве добавки для культуральной среды фракциями плазмы человека, и они обнаружили, как ни удивительно, что исходя из надосадочной жидкости фракционирования по Кону, в особенности из надосадочной жидкости фракции II+III или надосадочной жидкости фракции I, можно получить добавку к среде для культивирования клеток и добиться превосходных результатов в плане клеточного роста. Применение этого материала разрешает вышеописанные проблемы, поскольку он представляет собой материал человеческого происхождения, его получают промышленным способом с использованием надлежащей производственной практики (GMP), с приемлемыми затратами и прибылью, он демонстрирует достаточное единообразие между партиями и обладает качеством фармацевтической категории.

Более того, материал можно обрабатывать способами, которые предотвращают передачу патогенов.

Методика изготовления таких производных описана ниже.

Во-первых, от здоровых доноров получают человеческую плазму, в которую добавляют антикоагулирующее вещество, в предпочтительном варианте применения изобретения содержащее только лимоннокислый натрий в количестве, достаточном для обеспечения того, чтобы плазма не коагулировала. Добавление веществ (например, углеводов, таких как глюкоза) для улучшения сохранения клеток крови не является существенным, поскольку применяемая в изобретении плазма в основном не содержит клеток, так как была возможность ее получения при помощи плазмофереза в присутствии антикоагулирующего вещества, а не из полной донорской крови.

Количества антикоагулирующего вещества и других стандартных веществ, которые должны присутствовать в процессе получения, хранения и обращения с человеческой плазмой, описаны в общедоступных международных стандартах, действующих при производстве по фракционированию человеческой плазмы, таких как, например, Свод федеральных нормативных документов Соединенных Штатов Америки, инструкции и стандарты Управления по продовольствию и лекарствам Соединенных Штатов (FDA) и Европейского агентства по оценке лекарственных средств (EMEA), а также инструкции и стандарты международной конференции по согласованию (ICH) и международных фармакопей, таких как Европейская фармакопея, фармакопея Японии или Соединенных Штатов, и также стандарты, известные как современная надлежащая производственная практика (cGMP). В остальной части данного документа все эти стандарты будут названы как «перечень стандартов, действующих при фракционировании человеческой плазмы для фармацевтических целей». Этот перечень стандартов также применяется к стадиям изобретения, которые описаны ниже.

Как только плазма человека получена, ее замораживают, хранят и транспортируют в соответствии с перечнем стандартов, действующих при фракционировании человеческой плазмы для фармацевтических целей и, в предпочтительном варианте применения изобретения, специфически в соответствии с требованиями Монографии 0853 Европейской фармакопеи. Каждую единицу плазмы (донорство) анализируют для исключения наличия маркеров вирусной инфекции у доноров, которых ранее подвергали анкетированиям и клиническому обследованию в соответствии с вышеизложенными стандартами. В предпочтительном применении изобретения плазму потенциального донора не используют до тех пор, пока донор дважды за шесть месяцев не подвергнется процедуре оценивания, время, за которое донор становится «пригодным донором».

В предпочтительном применении изобретения образцы, полученные от каждого донорства, анализируют для исключения присутствия маркеров инфекций, таких как, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы гепатитов B и C (HBV и HCV) и другие вирусы, патогенные для человека. Часть изобретения представляет собой контрольное хранение донорств плазмы в течение периода не менее 60 дней, предпочтительно не менее 90 дней, что позволяло бы изъять предыдущие донорства, если предварительно здоровый донор демонстрирует после донорства признаки инфекции патогенными агентами или другими факторами риска для здоровья. В предпочтительном применении изобретения анализ образцов из каждого донорства повторяют один или несколько раз после подготовки пробных смесей (мини-запасы или пробные запасы) из различного числа донорств, которое может колебаться, например, от 10 до 10000, предпочтительно, от 90 до 2000 и более предпочтительно, от 100 до 1000. Для таких повторных анализов можно использовать способы амплификации генетического материала вирусов, таких как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) или другие способы, обычно относящиеся к числу способов, известных для тестирования нуклеиновых кислот (NAT).

Как только все проверки и периоды контрольного хранения (хранящийся запас) завершены, и после исключения непригодных единиц, обнаруженных в результате анализа, плазму можно использовать в более поздних стадиях изобретения.

Следующая стадия состоит из оттаивания донорств, насчитывающих не менее 100 единиц, предпочтительно, свыше 1000 единиц и более предпочтительно, свыше 4000 единиц. В предпочтительном применении изобретения оттаивание может происходить при температуре от 0°C до 4°C. Донорства смешивают во время процесса оттаивания для того, чтобы продуцировать смесь плазм (запас плазмы). Преципитированный материал можно необязательно отделять, поскольку он является нестабильным благодаря процессу оттаивания. Его обычно описывают как криопреципитат, и он обогащен фактором von Willebrand (FVW), фактором VIII (FVIII), фибриногеном (FBN), фибронектином (FNC) и другими белками.

Далее, в предпочтительном применении изобретения к плазме добавляют 96% этанолфармацевтической категории до концентрации приблизительно 8% (об./об.). Для уверенности в том, что белки не денатурируют из-за экзотермического процесса растворения этанола в плазме, добавляют контрольный объем. Одновременно и с тем же объектом температуру запаса плазмы постепенно уменьшают до приблизительно -2°C. Присутствие этанола гарантирует то, что плазма не замерзнет. В этих условиях преципитирует белковая фракция, которая очень богата фибриногеном и включает большинство белков, присутствующих в криопреципитате, если указанный криопреципитат в применении изобретения не сепарировали перед добавлением алкоголя. Эта фракция обычно известна как фракция I (Fr-l) по Кону, поскольку ее получают путем процесса, в основном соответствующего процессу, описанному Edwin J. Cohn (Cohn E.J. et al.; J. Am. Chem. Soc., 1946). Когда полученный на этой стадии преципитат сепарируют, фракция надосадочной жидкости, как оказалось, в основном не содержит фибриноген, и следовательно, свободна от любых нарушений, которые фибриноген может вызывать в культуре клеток; она становится подходящей для объекта изобретения в качестве добавки к средам для культивирования клеток после удаления добавленного алкоголя, так как он токсичен для клеток.

В предпочтительном применении изобретения после сепарирования любого или ни одного из двух описанных ранее преципитатов (криопреципитат и Fr-I) к существующей смеси добавляют 96% этанолфармацевтической категории до концентрации от 20% до 25% (об./об.). Во избежание денатурирования белков в результате экзотермического процесса растворения этанола в плазме добавление проводят в контролируемом объеме. Одновременно, и с тем же объектом, температуру запаса плазмы постепенно уменьшают до приблизительно -5°C. Присутствие этанола гарантирует то, что плазма не замерзнет. В этих условиях преципитирует белковая фракция, которая очень богата описанными ранее белками, как присутствующими в криопреципитате и в Fr-I (если уже не была сепарирована, как описано ранее), а также очень богата иммуноглобулинами, преимущественно IgG и IgM. Эта фракция обычно известна как фракция I+II+III (Fr-I+II+III), если фракция Fr-I по Кону не была ранее сепарирована, или фракция II+III (Fr-II+III), если Fr-I по Кону была ранее сепарирована. Когда полученный на этой стадии преципитат сепарируют, фракция надосадочной жидкости, как оказалось, в основном не содержит фибриноген и иммуноглобулины и, следовательно, свободна от вредного воздействия, которое могли бы вызвать эти белки в культурах клеток; она становится подходящей для объекта изобретения в качестве добавки к средам для культивирования клеток после удаления добавленного алкоголя, так как он токсичен для клеток.

Во время описанных стадий применяют контроли к процессу продуцирования извлеченных из плазмы материалов для уверенности в том, что процессы протекают в соответствии с необходимыми спецификациями, касающимися концентрации белков, pH, числа микроорганизмов и т.д.

Эти надосадочные жидкости получают при помощи процесса, который в основном соответствует процессу, описанному Эдвином Дж. Коном, хотя в композиции могут иметь место различия, обусловленные как изменениями в масштабе производства (число донорств и объем запасов плазмы), так и вариациями между процессом, по изобретению, и процессом, применяемым в то время.

Эти надосадочные жидкости, полученные непосредственно при промышленном фракционировании человеческой плазмы (на основе способа Кона), кроме удаления содержащегося в них этанола (приблизительно 8% в надосадочной жидкости фракции I и приблизительно 20-25% в надосадочной жидкости фракции II+III) не требуют последующих обработок по очистке.

Этанол, содержащийся в этих надосадочных жидкостях, можно удалить любым из известных в уровне техники способов. Предпочтительно, это осуществляют при помощи диализа или диафильтрации или непосредственно путем лиофилизации, выпаривания или высушивания (например, распылительной сушкой), такие способы легко индустриализировать.

Действующий препаративный способ получения полностью стабильного продукта состоит из начального этапа с любыми описанными надосадочными жидкостями и, необязательно, разведения их соответственно водой для инъекции, физиологическим соляным раствором или буфером при pH 7-8 и температуре от 2 до 8°C. Раствор осветляют через целлюлозные пластинки или глубокие пластинки, которые являются инертными в отношении адсорбирования белков, и наконец, его осветляют при размере пор приблизительно 0,5 микронов. Продукт затем подвергали диафильтрации, используя мембраны с номинальным молекулярным исключением приблизительно 10 кДа, против двух или более объемов воды для инъекции, физиологического соляного раствора или буфера с предпочтительным pH, приблизительно равным 7. Предпочтительно, число смен объемов при диафильтрации составляет приблизительно 5.

Подвергнутый диафильтрации раствор осветляют путем полной фильтрации с градиентом фильтрации при размере пор от 0,2 до 0,1 микрона. Следующий продукт можно подвергать нанофильтрации через поры размером приблизительно 35 нм и 20 нм, предпочтительно при температуре 2-8°C и трансмембранном давлении менее чем или равном 1 бару. Применяемая нагрузка предпочтительно составляет около 70 л/м2 зоны для фильтра с меньшим размером пор.

Полученный продукт можно концентрировать ультрафильтрацией до того же значения концентрации общего белка, что и в начальном материале (надосадочная жидкость), или при желании до большей концентрации.

В любом случае полученный материал измеряют в стеклянных флаконах или бутылях и хранят предпочтительно при -30°C или при более низкой температуре до использования. На стадии перед измерением надосадочной жидкости во флаконах можно проводить стерилизационное фильтрование через поры размером от 0,1 до 0,2 микрона.

Замороженный продукт также можно лиофилизировать или подвергать другим обработкам для предоставления высушенного продукта. Затем продукт можно подвергать гамма-облучению и можно хранить в высушенном состоянии при температуре предпочтительно от 2 до 8°C до момента использования.

Если диафильтрацию не проводят на начальном материале (S/Fr-I или S/Fr-II+III, или эквивалентном) и выбирают удаление алкоголя непосредственно путем лиофилизации, то измерение осуществляют в стеклянных флаконах или бутылках. Перед измерением надосадочной жидкости во флаконах можно проводить процесс стерилизационного фильтрования через поры размером от 0,1 до 0,2 микрона. Материал после измерения замораживают предпочтительно при температуре менее чем или равной -30°C и подвергают лиофилизированию и гамма-облучению при помощи известных методик.

Необязательно материал можно обрабатывать способами для уничтожения/инактивирования патогенных агентов. Предпочтительно, чтобы материал, либо замороженный, либо лиофилизированный, был подвергнут воздействию гамма-излучения с параметрами от 15 до 35 килогреев, оптимум между стабильностью композиции и удалением вирусов получали при 25 килогреях.

Лиофилизированный продукт можно хранить в течение продолжительного периода времени при температуре предпочтительно от 2 до 8°C.

Что касается пролиферации клеток, надосадочная жидкость Fr-II+III остается стабильной (процентные отношения пролиферативности составляют (100±20)% или больше, чем FCS) в течение, по меньшей мере, 168 дней в лиофилизированном виде при хранении в морозильнике (2-8°C).

Этот материал, восстановленный в культуральной среде Ham F12, является стабильным в течение по меньшей мере 113 дней при температуре менее чем или равной -18°C (процентные отношения клеточной пролиферации равны или больше, чем в нулевой момент времени).

Стабильность культуральной среды Ham F12 с добавлением 50% S/Fr-II+III составляет четыре дня в морозильнике.

Предпочтительным способом сохранения материала до его применения является лиофилизация в его конечной упаковке. В этом способе его можно непосредственно дозировать, а этанол можно удалять при текущем процессе лиофилизации.

Эти надосадочные жидкости добавляют к традиционным, не содержащим сыворотку культуральным средам, включающим неорганические соли, аминокислоты и витамины среди других необходимых компонентов для роста клеток, таким как, например, среда Ham F12 или модифицированная среда Dulbecco (DMEM).

Конечные среды можно применять для культивирования широкого разнообразия клеток млекопитающих. Для этой цели используют традиционные методики и условия культивирования, известные специалистам в рассматриваемой области.

Лиофилизированную надосадочную жидкость можно восстанавливать в основной культуральной среде, например, среде Ham F12 или модифицированной минимальной основной среде Dulbecco (DMEM), в дистиллированной воде или деионизированной и апирогенной воде, или в физиологических растворах или буферах, общих для культур клеток.

Надосадочную жидкость, восстановленную в культуральной среде, можно применять для добавления к основной культуральной среде путем добавки от 2% до 50% (об./об.) восстановленной надосадочной жидкости, например: 2 мл надосадочной жидкости фракции I или надосадочной жидкости фракции II+III, восстановленной в среде, к 98 мл основной среды (2%). В другом примере следует добавлять 50 мл надосадочной жидкости фракции I или надосадочной жидкости фракции II+III, восстановленной в среде, к 50 мл основной среды (50%).

Рекомендуется, чтобы надосадочную жидкость, восстановленную в воде, физиологических растворах или буферах, пригодных для культивирования клеток, добавляли к основной культуральной среде в количестве от 2% до 20% (об./об.), например, 20 мл восстановленной надосадочной жидкости к 80 мл среды (20%). Если требуются концентрации 50% (об./об.), восстановленную надосадочную жидкость следует добавлять к концентрированной в два раза основной среде (2X), например, добавление 50 мл надосадочной жидкости фракции I или надосадочной жидкости фракции II+III в воде к 50 мл 2X основной среды.

Культуральную среду с добавкой можно применять для обычных культуральных методик и эту среду с добавкой можно применять непосредственно или предварительно профильтрованной через 0,22 мкм.

Замороженный материал после хранения (надосадочная жидкость) необходимо оттаять перед добавлением к основной среде. Рекомендуется, чтобы сразу же после оттаивания его добавляли к основной культуральной среде в количестве от 2% до 20% (об./об.), например, 20 мл надосадочной жидкости фракции II+III, восстановленной в 80 мл среды (20%). Если требуются концентрации 50% (об./об.), среду при смешивании с надосадочной жидкостью фракции I или фракции II+III следует добавлять в двойной концентрации (2X), например, добавление 50 мл надосадочной жидкости фракции II+III к 50 мл 2X основной среды.

Культуральную среду с добавками можно применять для обычных культуральных методик и среду с добавками использовать непосредственно или после фильтрования через 0,22 мкм.

Пример 1

Изготовление надосадочной жидкости фракций I и II+III

Индивидуальные донорства плазмы, полученные при помощи плазмофереза, смешивают и оттаивают, оттаивание проводят в реакторе при контролируемой температуре от 0°C до 4°C. В конечном итоге получают 3783 кг плазмы.

Для сепарирования криопреципитата плазму центрифугируют при условиях от 9000 до 12000×g, при поддержании температуры центрифугирования от 0°C до 4°C.

Для сепарирования фракции I проверяют концентрацию белка в надосадочной жидкости криопреципитата (C/S), которая должна составлять приблизительно 5%. Если она выше, то разбавляют водой для инъекций. pH также регулируют в районе приблизительно 7.

Начиная с C/S добавляют этанол до концентрации 8% (об./об.). Скорость, с которой добавляют этанол, должна быть небольшой (менее чем или равной 2 кг/мин) с умеренным перемешиванием для избежания денатурации. Во время добавления этанола температуру надосадочной жидкости постепенно понижают в преципитационном реакторе до тех пор, пока она не достигнет конечной температуры -2°C. Конечный pH должен составлять приблизительно 7.

После около двух часов реакции проводят центрифугирование для сепарирования фракции I. Это центрифугирование осуществляют при условиях от 9000 и 12000×g. Полученную надосадочную жидкость (S/Fr-I) поддерживают при температуре от 0°C до -4°C.

В этой точке, или в C/S, протромбиновый комплекс можно необязательно экстрагировать при помощи ионообменной хроматографии (Curling, JM ed, Methods of plasma fractionation, Academic Press 1980).

Для сепарирования фракции II+III pH S/Fr-l доводят до приблизительно 7 и затем добавляют этанол до приблизительно 20% (об./об.). Скорость, с которой добавляют этанол, должна быть небольшой (менее чем или равной 2 кг/мин) и с умеренным перемешиванием для избежания денатурации. Во время добавления этанола температуру надосадочной жидкости постепенно понижают в преципитационном реакторе до конечной температуры -5°C. Конечный pH должен составлять приблизительно 7.

В данном примере фракцию II+III сепарируют через приблизительно шесть часов времени реакции.

В этой точке (надосадочная жидкость фракции II+III), или в C/S, или в S/Frl антитромбин можно необязательно экстрагировать при помощи аффинной хроматографии с гепарином (Fernandez J. et al., Sangre 41 (supl. 3)42(1996).

Пример 2

Определение доз и лиофилизация

Надосадочную жидкость фракции II+III, полученную в соответствии с примером 1, разбавляют водой для инъекции при pH 7,8 и температуре от 2°C до 8°C до тех пор, пока концентрация этанола не достигнет 8%. Раствор осветляют через целлюлозные пластинки с размером пор до 0,5 микрона. Затем продукт необязательно подвергают диафильтрации для удаления этанола, используя полисульфоновые мембраны с номинальным молекулярным исключением 10 кДа, в присутствии воды для инъекции при pH 7. Число смен объемов во время диафильтрации составляет 5.

Раствор осветляют путем полной фильтрации с фильтрационным градиентом при размере пор от 0,2 микрона до 0,1 микрона. Далее продукт необязательно подвергают нанофильтрации через поры размером 35 нм и 20 нм, с медно-аммониевыми целлюлозными фильтрами при температуре от 2°C до 8°C и трансмембранном давлении менее чем 1 бар до тех пор, пока фильтры не забьются.

Продукт концентрируют путем ультрафильтрации до того же значения концентрации белка, что и в начальном материале, и после стерилизационного фильтрования через поры размером 0,2 микрона разливают в стеклянные флаконы и хранят при -30°C до использования.

Замороженный продукт можно лиофилизировать для предоставления высушенного продукта, который подвергают гамма-облучению и который можно хранить при температуре от 2°C до 8°C до использования.

Пример 3

Основная композиция различных партий материалов, полученных в соответствии с примером 2 (восстановленные в H2O лиофилизированные надосадочные жидкости), в сравнении с таковыми эмбриональной сыворотки теленка, представлена в нижеприведенной таблице:

Пример 4

Проверка клеточной пролиферации линии CHO на среде с добавлением надосадочной жидкости фракции I

Линия клеток CHO состоит из овариальных клеток китайского хомячка, которые обладают эпителиальной морфологией и способны к адгезивному росту. Используемая культура получена из Европейской коллекции клеточных культур (ECACC), номер по каталогу 85050302.

Надосадочную жидкость фракции I восстанавливают культуральной средой Ham F12, как отмечено выше.

Различные концентрации (об./об.) фракции I культивируют в культуральной среде (20%, 40%; 60%; 80% и 100%) и среде с добавкой 20% (об./об.) эмбриональной сыворотки теленка (FCS) и средой без добавок.

96-луночный планшет засевают по 50 мкл на лунку суспензии клеток CHO c концентрацией от 5×105 до 1×106 клеток/мл в культуральную среду без добавок.

К каждой колонке лунок планшета добавляют по 50 мкл среды для тестирования на лунку, так что конечное разведение даст среду без добавки, с добавлением 10% FCS и с 10%, 20%, 30%, 40% и 50% надосадочной жидкости фракции I.

96-луночный планшет инкубируют при 37°C в атмосфере 8% CO2 и высокой относительной влажности (инкубатор культур клеток) в течение 48 часов.

100 мкл среды без добавок добавляют в колонку в качестве образца для сравнения.

После 48 часов инкубации в каждую лунку добавляют 10 мкл реагента WST-1/ECS из коммерчески доступного набора Millipore для проверки пролиферативности клеток, номер по каталогу 2210.

После 2-4 часов инкубации при обычных для линии условиях культивирования (37°C; 8% CO2) планшет встряхивают в течение одной минуты и определяют оптическую плотность в ридере микропланшетов при длине волны 420-480 нм, при контрольной длине волны более 600 нм (микропланшеты обычно считывают в ридере Tecan SUNRISE при длине волны 450 нм и контрольной длине волны 620 нм с использованием программного обеспечения Magellan software V 6.3 для считывания и анализа данных для проверки прибора).

Значения оптической плотности выше, чем для образца сравнения, в сумме с их удвоенным квадратичным отклонением считаются положительными для данной методики.

На следующей стадии среднее значение образца сравнения вычитают из значений оставшихся лунок в планшете.

Средние значения лунок каждой колонки подсчитывают (после вычитания образца сравнения для этой методики) сопоставлением среднего значения каждой колонки со средним значением для среды без добавок и среды с добавлением FCS или с различными концентрациями надосадочной жидкости фракции I, соответственно.

Клетки в среде без добавок считают неделящимися (0%) и, вследствие этого, среднее значение оптической плотности в этой колонке вычитают из всех средних значений всех колонок.

Значение оптической плотности стандартной среды (среда Ham F12 с добавлением 10% FCS) берется в качестве значения 100%-ной пролиферативности, и поэтому после вычитания значения среды без добавок все средние значения из предыдущих точек делят на это значение для получения процентного отношения пролиферативности относительно контрольной среды.

Для среды с добавлением от 20% до 50% надосадочной жидкости фракции I, в качестве общего правила, полученное процентное отношение пролиферативности сходно с контрольной средой (среда с 10% эмбриональной сыворотки теленка) или значительно выше (среда с 50% надосадочной жидкости фракции I).

Результаты пролиферативности приведены ниже в виде процентных отношений.

Пролиферативность клеток СНО (%) в среде Ham F12 с добавлением FCS или S/Fr I
S/S 10% FCS
(2,5 мг (мг/мл альбумин)
10% S/Fr.I
(6 мг/мл альбумин)
20%S/Fr.I
(12 мг/мл альбумин)
30% S/Fr.I (17 мг/мл альбумин) 40% S/Fr.I (23 мг/мл альбумин) 50% S/Fr.I (29 мг/мл альбумин)
0 100 70 120 168 206 233
S/S: без добавки; FCS: эмбриональная сыворотка теленка.

Пример 5

Проверка клеточной пролиферативности линии CHO в среде с добавлением надосадочной жидкости фракции II+III

Проводимое тестирование было идентично предыдущему тестированию, с добавлением к среде надосадочной жидкости фракции II+III вместо надосадочной жидкости фракции I.

Что касается данных по пролиферативности, то при использовании 20% надосадочной жидкости фракции II+III в качестве добавки к среде результаты сходны с результатами, полученными с контрольной средой (с добавлением 10% FCS), и когда применяют среду с добавлением 50% надосадочной жидкости фракции II+III, данные по пролиферативности получаются лучше, чем аналогичные данные с контрольной средой.

Данные по пролиферативности представлены ниже в виде процентных отношений.

Пролиферативность клеток СНО (%) в среде Ham F12 с добавлением FCS и S/Fr-II+III (n=4)
S/S 10% FCS
(2,5 мг (мг/мл альбумин)
20% S/Fr.II+III (4,8 мг/мл альбумин) 30% S/Fr.II+III (7,1 мг/мл альбумин) 40% S/Fr.II+III (9,5 мг/мл альбумин) 50% S/Fr.II+III (11,9 мг/мл альбумин)
0 100 85 104 123 160
S/S: - без добавок; FCS: эмбриональная сыворотка теленка.

Пример 6

Проверка клеточной пролиферативности линии CHO в среде с добавлением гамма-облученной надосадочной жидкости фракции II+III.

Проводимое тестирование было идентично предыдущему тестированию, среда с добавлением надосадочной жидкости фракции II+III, облученной гамма-излучением с дозами 25 и 35 кГр (килоГреев).

Что касается данных по пролиферативности, то значительных различий между результатами, полученными с надосадочными жидкостями фракции II+III без облучения и с облучением с 25 и 35 кГр, выявлено не было.

Данные по пролиферативности представлены ниже в виде процентных отношений.

Пролиферативность клеток СНО (%) в среде Ham F12 с добавлением FCS, S/Fr-II+III или гамма-облученной S/Fr-II+III
S/S 10% FCS 50% S/Fr.II+III [Г3] 50% S/Fr.II+III 25 кГр 50% S/Fr.II+III 35 кГр
0 100 155 150 142
S/S: без добавок; FCS: эмбриональная сыворотка теленка; кГр: килогреев.

Пример 7

Проверка клеточной пролиферативности линии клеток Vero в среде с добавлением гамма-облученной надосадочной жидкости фракции II+III (25 кГр).

Проводимое тестирование было идентично предыдущему тестированию в примере 1, с использованием в качестве основной культуральной среды модифицированной минимальной основной среды Dulbecco (DMEM) и клеточной линии Vero вместо линии CHO.

Клеточная линия Vero состоит из клеток почки африканской зеленой мартышки, морфология этих клеток сходна с фибробластами (фибробластоподобные) с особенностью адгезивного роста. Используемая культура получена из Европейской коллекции клеточных культур (ECACC), номер по каталогу 84113001.

Полученные данные по пролиферативности показывают, что результаты с добавлением 30% гамма-облученной надосадочной жидкости фракции II+III очень близки или превосходят результаты, полученные с вышеприведенной контрольной средой. Среда с добавлением 20% гамма-облученной надосадочной жидкости фракции II+III дает очень близкие результаты с контрольной средой (основная среда с добавлением 10% FCS).

Данные по пролиферативности представлены ниже в виде процентных отношений.

Пролиферативность клеток Vero (%) в среде DMEM с добавлением FCS или гамма-облученной S/Fr-II+III (n=8)
S/S 2% FCS
(0,5 мг/мл альбумин)
5% FCS
(1,3 мг/мл альбумин)
10% FCS
(2,5 мг/мл альбумин)
25 кГр 10% S/Fr.II+III (2,4 мг/мл альбу-мин) 25 кГр 20% S/Fr.II+III (4,8 мг/мл альбу-мин) 25 кГр 30% S/Fr.II+III (7,1 мг/мл альбу-мин) 25 кГр 40% S/Fr.II+III (9,5 мг/мл альбу-мин) 25 кГр 50% S/Fr.II+III (11,9 мг/мл альбумин)
0 77 104 100 65 71 82 84 82
S/S: без добавок; FCS: эмбриональная сыворотка теленка; кГр: килогреев.

Пример 8

Линия субкультуры клеток со средой Ham F12 с добавлением 50% надосадочной жидкости фракции II+III (25 кГр).

Используют бутыль с культурой клеток CHO, как правило, близкой к конфлюентности.

Культуральную среду фильтруют.

Монослой клеток промывают при помощи забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) при температуре от 20°C до 37°C, из расчета приблизительно 10 мл на 25 см2 и отбирают.

Добавляют раствор, содержащий трипсин 0,05%/EDTA 0,02% (трипсин может быть рекомбинантным или животного происхождения), из расчета 2 мл на 25 см2 поверхности культуры. Раствор распределяют по всей поверхности, так что он образует тонкую пленку, а избыток раствора отбирают.

Бутыль поддерживают при температуре от 20°C до 37°C до тех пор, пока клетки не отберут с поверхности.

Культуральную среду Ham F12 с добавлением 50% надосадочной жидкости фракции II+III (25 кГр) добавляют в объеме от 5 мл до 15 мл на бутыль с культурой.

Клетки разъединяют путем взбалтывания бутыли или пипетирования и клетки подсчитывают.

Их распределяют в новые культуральные бутыли в соотношении от 1:3 до 1:10.

Общий объем среды Ham F12 с добавлением 50% надосадочной жидкости фракции II+III (25 кГр) в новых культуральных бутылях должен составлять от 0,2 до 0,3 мл/см2 поверхности культуры.

Бутыль инкубируют в инкубаторе для культур клеток при 37°C с высокой относительной влажностью и концентрацией CO2 в соответствии с используемой культуральной средой (в данном случае 8%).

Культуральную среду необходимо менять раз в один-три дня.

После различных пассирований с использованием культуральной среды с добавлением 50% S/Fr-II+III (25 кГр) было отмечено, что культура оставалась жизнеспособной и обладала способностью к росту.

Жизнеспособность, время удвоения популяции (PDT) и общее число клеток на 75 см2 поверхности контролировали при 16 последовательных пассажах, в результате чего выявлены средняя жизнеспособность 92,79%, среднее PDT 73,8 часов и среднее общее число клеток 4,34×106 клеток/75 см2. Результаты, полученные с использованием контрольной среды во время девяти последовательных пассажей, составили среднюю жизнеспособность 97,81%, среднее PDT 27,49 часов и среднее общее число клеток 1,28×107 клеток/75 см2.

Во втором эксперименте в культуре клеток CHO контролировали те же параметры с использованием 50%, 20% и 10% S/Fr-II+III во время 3-7 пассажей. Для клеток, культивируемых в среде с добавлением 50% S/Fr-II+III, было получено: PDT 103,22, жизнеспособность 90,21% и 6,14×106 клеток/75 см2. Для клеток, культивируемых в среде с добавлением 20% S/Fr-II+III, было получено: PDT 70,45, жизнеспособность 94,89% и 7,72×106 клеток/75 см2. Для клеток, культивируемых в среде с добавлением 10% S/Fr-II+III, было получено: PDT 83,04, жизнеспособность 91,07% и 5,87×106 клеток/75 см2.

Пример 9

Субкультура линии клеток CHO со средой Ham F12 с добавлением 20% надосадочной жидкости фракции II+III (25 кГр).

Выращивание субкультуры проводят тем же путем, что и в предыдущем примере, но с использованием среды Ham F12 с добавлением 20% надосадочной жидкости фракции II+III (25 кГр) вместо 50%.

После различных пассажей с использованием культуральной среды с добавлением 20% S/Fr-II+III (25 кГр) было отмечено, что культура оставалась жизнеспособной и обладала способностью к росту.

В этом случае жизнеспособность, PDT и общее число клеток в 75 см2 контролировали в течение 6 последовательных пассажей; средняя жизнеспособность составила 97,13%, среднее PDT 86,32 часов и среднее общее число клеток 5,96×106 клеток/75 см2.

Пример 10

Стабильность надосадочной жидкости Fr-II+III, определенной как процентное отношение пролиферативности клеток CHO в среде с добавлением 50% надосадочной жидкости Fr-II+III, восстановленной в Ham F12, по сравнению со средой с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка.

Таблица 1
Стабильность после лиофилизирования, при 4°C
Т=0 Т=105 дней Т=112 дней Т=168 дней
Планшет 1 129,69 113,85 140,70 79,52
Планшет 2 138,75 84,11 148,71 87,40
Среднее 134,22 98,98 144,71 83,46

Надосадочная жидкость Fr-II+III остается стабильной (процентные отношения пролиферативности составляют (100±20)% или больше, чем для FCS) в течение, по меньшей мере, 168 дней в лиофилизированном виде при хранении в морозильной камере (2°C-8°C).

Таблица 2
Стабильность после восстановления, при ≤-18°С
Партия 1 Т=0 Т=98 дней Т=105 дней Т=113 дней
Планшет 1 129,69 111,36 136,82 136,53
Планшет 2 138,75 118,08 75,27 154,03
Среднее 134,22 114,72 106,05 145,28
Партия 2 Т=0 Т=28 дней Т=91 день Т=98 дней
Планшет 1 79,52 159,77 76,00 132,29
Планшет 2 87,40 184,16 171,67 133,30
Среднее 83,46 171,96 123,84 132,79

Этот материал, восстановленный в культуральной среде Ham F12, стабилен в течение по меньшей мере 113 дней при температуре менее чем или равной -18°C (процентные отношения пролиферативности те же или больше, чем в нулевой момент времени).

1. Среда для культивирования клеток млекопитающих, характеризующаяся тем, что, в дополнение к обычным питательным веществам в основной культуральной среде для культивирования клеток млекопитающих, она содержит надосадочную жидкость фракции I плазмы человека по методу Кона или надосадочную жидкость фракции II+III плазмы человека по методу Кона.

2. Культуральная среда по по п.1, характеризующаяся тем, что надосадочную жидкость фракции по Кону высушивают.

3. Культуральная среда по по п.1 или 2, характеризующаяся тем, что надосадочную жидкость фракции по Кону замораживают.

4. Способ получения среды для культивирования клеток млекопитающих по пп.1-3, характеризующийся тем, что получение надосадочной жидкости фракции I или II+III фракционирования плазмы человека по методу Кона включает стадии
- осаждения этанолом;
- отделения надосадочной жидкости;
- замораживания или высушивания
и, необязательно, стадии
- разведения, и/или
- диализа, или диафильтрации, и/или
- удаления патогенных агентов;
и последующее добавление надосадочной жидкости фракции I или II+III, полученной таким образом, к основной культуральной среде.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что высушенную надосадочную жидкость восстанавливают в основной культуральной среде, в дистиллированной воде или деионизированной и апирогенной воде, или в физиологических растворах или буферах, обычно используемых при культивировании клеток.

6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что высушенную надосадочную жидкость восстанавливают в основной культуральной среде.

7. Способ по пп.4-6, характеризующийся тем, что плазму человека получают из смесей (пулов) от по меньшей мере 1000 людей-доноров.

8. Применение культуральной среды, которая включает надосадочную жидкость фракции I плазмы человека по методу Кона или надосадочную жидкость фракции II+III плазмы человека по методу Кона для культивирования клеток млекопитающих.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к зонду для детекции и набору (варианты) для детекции целевой нуклеиновой кислоты, спейсеру, подходящему для присоединения к специфической к мишени последовательности зонда и способу детекции любого взаимодействия между заявленным зондом и целевой нуклеиновой кислотой.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и касается способа прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якуток.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу гомогенной детекции со сниженным разбросом данных по меньшей мере одного продукта одноцепочечной амплификации.

Изобретение относится к лабораторной диагностике заболевания иерсиниозом, вызываемым Yersinia enterocolitica. .

Изобретение относится к лабораторной диагностике заболевания иерсиниозом, вызываемым Yersinia enterocolitica. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в молекулярной диагностике, связанной с выявлением РНК-мишеней. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации РНК энтеровирусов.
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления и дифференциальной диагностики манифестной и асимтпомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста.
Изобретение относится к области медицины, в частности к области трансплантологии. .

Изобретение относится к области микробиологии. .

Изобретение относится к области микробиологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к капсульному F1 антигену Yersinia pestis. .

Изобретение относится к области медицины, стоматологии
Наверх