Штамм streptomyces coeruleorubidus - продуцент антибиотика даунорубицина

Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности при производстве противоопухолевого антибиотика даунорубицина, эффективного в терапии многих видов рака мягких тканей, рака молочной железы, рака легкого. Штамм Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКМП Ac-890 получен в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм Streptomyces coeruleorubidus 2679 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и карминомицин в качестве селективных агентов. Антибиотическая активность дауномицинового комплекса, накапливаемого к концу ферментации, увеличена более чем в два раза по сравнению с исходным - 2500 и 950, соответственно. Изобретение обеспечивает повышение продуктивности даунорубицина, а именно содержание даунорубицина в ферментационной жидкости штамма до 2000 мкг/мл, что составляет 80% от его содержания в дауномициновом комплексе. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика даунорубицина, принадлежащего к основной группе антилейкемических препаратов и применяемого также в терапии многих видов рака мягких тканей, рака молочной железы, рака легкого. Кроме того, даунорубицин является исходным сырьем для полусинтетического противоопухолевого препарата доксорубицина.

Известен штамм Streptomyces coeruleorubidus 2679 - продуцент антибиотика даунорубицина [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 500 мкг/мл).

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент даунорубицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм №2679 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и карминомицин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм - продуцент даунорубицина депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП Ас-890.

Штамм ВКМП Ас-890 обладает повышенной продуктивностью даунорубицина (2000 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКМП Ас-890. Температура 28°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал приготовлен с поверхности десятидневной культуры штамма, выращенного на гороховом агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (Таблица 1).

Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные. Споры продолговатые и шаровидные, поверхность спор шиповатая, шипы средней величины; спороносцы спиральные, вытянутые.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений рН (5,0-10,0) с оптимумом роста при рН 7,0. Молоко пептонизирует, сахарозу инвертирует, крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу и сахарозу; умеренно - рафинозу, рамнозу; слабо - ксилозу, манит, не использует арабинозу.

Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозонитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.

Штамм ВКПМ Ас-890 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКПМ Ac-890 выращивают в течение (7-10) суток при 28°С на среде №2 Гаузе следующего состава, %:

Глюкоза	1,0
Пептон	0,5
Бульон Хоттингера (28-30) мг %	3,0
NaCl	0,5
Вода	Водопроводная
рН до стерилизации	7,0-7,2

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении в 1,0 атм и 120°С.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают агаровым блочком 2 см² на жидкую питательную среду следующего состава, %:

Соевая мука	1,0
Глюкоза	2,0
Кальция карбонат	0,3
Натрий хлористый	0,5
Вода	Водопроводная
рН до стерилизации	6,8-7,0

Посевную культуру выращивают при 28°С в течение 48 ч в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл с наполнением среды 100 мл. Скорость вращения качалки (280-320) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - 7%.

Ферментация проводится на качалке при 28°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:

Соевая мука	3,0
Глюкоза	3,0
NaCl	0,3
СаСО3	0,3
Вода	Водопроводная
рН до стерилизации	6,8-7,0

Антибиотическая активность, определенная методом ВЭЖХ через 144-168 ч биосинтетического процесса, составляет 2500 мкг/мл, при этом содержание даунорубицина в дауномициновом комплексе - 2000 мкг/мл (80%).

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является в 4 раза повышенная продуктивность даунорубицина, а именно содержание даунорубицина в ферментационной жидкости штамма-прототипа 500 мкг/мл, а в новом штамме - 2000 мкг/мл, что составляет 80% от его содержания в дауномициновом комплексе. Антибиотическая активность дауномицинового комплекса, накапливаемого к концу ферментации, увеличена более чем в два раза по сравнению с прототипом (Таблица 2) - 2500 и 950, соответственно.

Даунорубицин, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма, представляет собой кристаллический порошок красного цвета, легко растворимый в метаноле, хлороформе, растворимый в ацетоне и этаноле и нерастворимый в воде. По физико-химическим свойствам, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует требованиям ФС.

Полученный новый штамм может быть использован как микробиологическая основа в промышленном производстве противоопухолевого антибиотика даунорубицина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Фомичева Е.В. Изучение компонентного состава рубомициновых комплексов, продуцируемых промышленными штаммами S.coeruleorubidus Ч-157 и 2679 и усовершенствование метода получения рубомицина С. // Дисс.канд. хим. наук. М., (1993 г.).

Таблица 1.
Культурально-морфологические признаки штамма Streptomyces coeruleorubidus 1533 ВКПМ Ac-890
Агаровая среда	Рост воздушного мицелия	Цвет мицелия	Растворимый пигмент
Воздушного	Субстрактного
№1 Гаузе	Хороший паутинистый	Бледно-розовый (Н 5)	Фиолетовый (А 3)	+
Овсяная	Хороший	Розовый (Ж 3)	Красно-бурый (З 5)	+
Чапека (глюкозо-аспарагиновая)	Хороший	От розового до голубовато-серого (Ж 3-Н 7)	Светло-фиолетовый (А 5)	+
Линденбайна (глицерин-нитратная)	Скудный	Бледно-розовый (Н 5)	Темно-фиолетовый (Б 2)	+
Глюкозо-нитратная №2 Гаузе	Скудный	Бледно-розовый (Н 5)	Буровато-красный (Б 4)	+
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом)	Образуются меланоидные пигменты	+

Таблица 2.
Сравнительная антибиотическая активность нового штамма ВКПМ Ас-890 и штамма-продуцента прототипа
Штамм-продуцент	Антибиотическая активность культуральной жидкости, мкг/мл
Даунорубицин	Антрациклиновый комплекс
Новый штамм	2000	2500
Штамм-прототип	500	950

Штамм Streptomyces coeruleorubidus ВКПМ Ac-890 - продуцент антибиотика даунорубицина.