Способ определения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови



Способ определения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови
Способ определения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови
Способ определения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови

 


Владельцы патента RU 2464575:

Федеральное государственное учреждение "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" Федерального медико-биологического агентства (ФГУ "НИИ ФХМ" ФМБА) (RU)
Белорусский государственный университет (БГУ) (BY)

Изобретение относится к медицине, а именно медицинской биохимии, и может быть использовано для определения функционального состояния фермента миелопероксидазы в плазме крови. Способ включает внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода и определение пероксидазной активности миелопероксидазы по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител крыс против миелопероксидазы, последующего добавления образцов плазмы и стандарта миелопероксидазы. Затем добавляют антитела кроликов против миелопероксидазы и конъюгированные с пероксидазой хрена антитела коз против IgG кролика. Далее вычисляют коэффициент удельной активации миелопероксидазы Куа как отношение активности фермента к его концентрации. При значениях Куа выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния миелопероксидазы. Изобретение позволяет быстро и достоверно определить функциональное состояние миелопероксидазы в плазме крови, что дает возможность прогнозировать развитие ряда заболеваний, уточнять диагнозы и своевременно принимать меры, направленные на регулирование активности фермента. 2 пр., 3 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно медицинской биохимии, и может быть использовано для определения функционального состояния фермента миелопероксидазы (МПО) в плазме крови путем одновременного измерения ее концентрации и активности.

Миелопероксидаза (МПО) - фермент, содержащийся в лейкоцитах - секретируется во внеклеточное пространство в очагах воспаления. Этот фермент катализирует образование окислителей (HOCl, HOBr), которые являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и способны вызывать повреждение собственных тканей организма в очагах воспаления и последующее развитие окислительного стресса. Таким образом, активность фермента определяет не только эффективность клеточного ответа в отношении патогена, но и степень повреждающего действия окислителей в отношении клеток и тканей организма-хозяина.

Активность МПО может регулироваться различными факторами, присутствующими в плазме крови. Так показано, что церулоплазмин, связываясь с МПО, ингибирует ее пероксидазную и хлорирующую активности, претендуя на роль эндогенного ингибитора активности фермента [1, 2]. Важным регулятором активности МПО является также pH среды [3]. Определение функционального состояния МПО позволит прогнозировать развитие ряда заболеваний, ассоциированных с окислительным стрессом и воспалением.

Известен иммунохимический способ определения количества МПО в биологических жидкостях, основанный на иммуноферментном методе анализа (ИФА) с применением моноклональных антител к этому ферменту [4]. Однако данный метод не дает возможности оценить функциональную активность МПО, от которой, в первую очередь, зависит, насколько интенсивна продукция этим ферментом реакционных окислителей, и которая, в конечном итоге, определяет степень повреждения биологически важных молекул, а вместе с тем - степень тяжести течения заболевания и развитие его осложнений.

Известен способ определения пероксидазной активности МПО в сыворотке (плазме) крови, который заключается в том, что в 50 мМ фосфатный буфер (pH 6,0) вносят сыворотку крови, затем добавляют пероксид водорода и o-дианизидин, являющийся субстратом пероксидаз, после чего в течение 5 мин измеряют оптическую плотность реакционной смеси при 460 нм, регистрируя скорость окисления о-дианизидина, которая и является мерой пероксидазной активности и функционального состояния МПО [5]. Однако данный метод имеет существенные недостатки, поскольку, во-первых, не учитывает возможного присутствия в сыворотке (плазме), помимо МПО, соединений, обладающих пероксидазной активностью, например, гемоглобина и/или его производных, а во-вторых, не позволяет оценивать удельную активность фермента, а следовательно, и его функциональное состояние, так как остается не ясным, какое количество МПО содержится в образце плазмы и обладает измеряемой активностью.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ определения пероксидазной активности МПО плазмы, включающий внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную фосфат-цитратным буферным раствором (pH 4,5) плазму крови в отсутствие и в присутствии ингибитора МПО-гидразида 4-аминобензойной кислоты. Пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления субстрата о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты [6]. Этот способ дает возможность исключить вклад гемоглобина и других пероксидаз в получаемый результат. Однако данный способ, как и предыдущий, не позволяет определить удельную активность фермента и функциональное состояние МПО, так как не учитывает количество МПО, присутствующее в исследуемом образце плазмы.

Задачей изобретения является создание способа определения функционального состояния МПО в плазме крови, позволяющего повысить информативность, точность и диагностические возможности.

Техническим результатом заявленного изобретения является оптимизация, повышение информативности и расширение диагностических возможностей способа, что дает возможность прогнозировать развитие ряда заболеваний, уточнять диагнозы и своевременно принимать меры, направленные на регулирование активности фермента.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения функционального состояния МПО в плазме крови, включающем внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода в концентрации 100-200 мкМ, определение пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере с pH 4,5, дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител крыс против миелопероксидазы, последующего добавления образцов плазмы и стандарта миелопероксидазы, затем добавляют антитела кроликов против миелопероксидазы и конъюгированные с пероксидазой хрена антитела коз против IgG кролика, количество миелопероксидазы в образцах плазмы определяют, сравнивая интенсивность развития хромогенной реакции в лунках со стандартом, далее вычисляют коэффициент удельной активации миелопероксидазы Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации, и при значениях коэффициента удельной активности миелопероксидазы выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния миелопероксидазы.

Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидина вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты, спектрофотометрически определяют скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ), пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере с pH 4,5, дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител против МПО, полученных от крыс, последующего добавления образцов плазмы и стандарта МПО, количество МПО в образцах плазмы определяют, сравнивая величину изменения оптической плотности в лунках со стандартом, после последовательного добавления антител против МПО, полученных от кроликов, конъюгата пероксидазы хрена с антителами против антител кролика и хромогенного субстрата, далее вычисляют коэффициент удельной активности МПО Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации, и при значениях коэффициента удельной активности МПО выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния МПО.

Сущность изобретения поясняется фиг.1, 2 и 3, где:

на фиг.1 проиллюстрирована взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови здоровых людей;

на фиг.2 показана взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа;

на фиг.3 показана взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови больных ишемической болезнью сердца.

Способ осуществляют следующим образом.

Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом 0,8 мл, содержащую смесь лимонной кислоты и Na2HPO4 (pH 4,5) в отсутствие и в присутствии ингибитора МПО-гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин (380 мкМ). Пробу тщательно перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения ее оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450-460 нм в течение 8-10 мин после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ). Оптическим контролем служит проба, содержащая такой же, как и в опытной пробе, объем буферного раствора и субстрата.

Расчет активности фермента проводят по формуле

где ΔD и ΔDинг - прирост оптической плотности за t минут в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты соответственно;

V - общий объем реакционной смеси;

t - время измерения активности;

ν - объем образца плазмы.

Измерения концентрации фермента проводят с помощью ИФА с использованием антител против МПО человека, полученных иммунизацией кроликов и крыс. В лунки полистирольного планшета на 12 часов при +4°C помещали 0,1 мл аффинных антител крыс против МПО человека (5 мг/л) в 0,1 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,4, после промывки планшета 0,05% Tween 20 (v/v) в PBS (PBS-T) проводили блокировку BLOTTO-T (3%-ное обезжиренное молоко (w/v) в PBS-T) в течение 1 часа (0,2 мл), затем в лунках инкубировали в течение 1 часа стандартные растворы МПО (3-250 нг/мл) или пробы плазмы, разведенные BLOTTO-T (в 4-256 раз), после промывки планшета PBS-T в лунки помещали 0,1 мл антител кроликов против МПО (10 мг/л) в BLOTTO-T, после промывки планшета PBS-T в лунки помещали 0,1 мл антител коз против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (1:5000, «BioRad») в BLOTTO-T. После отмывки планшета PBS-T оценку активности проводили, выявляя пероксидазу с помощью хромогенной смеси: к раствору 10 мг о-фенилендиамина в 1 мл этанола добавляли 11 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, pH 4,0 и 5 мМ H2O2, спустя 4-5 мин к 0,1 мл смеси в лунках добавляли 0,05 мл 6 М H2SO4 и измеряли А492 на планшетном фотометре. Концентрацию МПО во фракциях рассчитывали по калибровочному графику с известными концентрациями МПО в диапазоне 3-250 нг/мл.

Далее вычисляют коэффициент удельной активности Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации (С), который выражается в единицах, количественно равных изменению оптической плотности в минуту на пг фермента.

Расчет коэффициента удельной активации фермента проводят по формуле

КуаМПО

Коэффициент удельной активности МПО выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин позволяет говорить о нарушении функционального состояния фермента.

Сущность и практическая применимость заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Проведено клиническое обследование 47 добровольцев без выраженных признаков острых, инфекционных или аллергических заболеваний, без нарушений сердечного ритма и проводимости, без признаков воспаления и ишемической болезни сердца. Плазма крови была исследована описанным выше способом. Коэффициент удельной активности МПО был равен 1,35±0,30 ед.опт.пл./пг/мин, что соответствует нормальному функциональному состоянию МПО. Действительно, было показано, что в группе этих людей существует достоверная положительная корреляционная зависимость между активностью и содержанием МПО в плазме крови, что иллюстрирует фиг.1. Эти данные подтверждают нормальное функциональное состояние МПО.

Пример 2. В НИИ кардиологии (г.Минск) было проведено обследование группы больных с установленным диагнозом сахарный диабет (СД) 2 типа и ишемическая болезнь сердца (ИБС). Плазма крови была исследована описанным выше способом. Коэффициент удельной активности МПО в плазме крови больных СД 2 типа был равен 3,54±1,15 ед.опт.пл./пг/мин, а в группе больных ИБС - 1,71±0,37 ед.опт.пл./пг/мин, что соответствует нарушению функционального состояния МПО. Действительно, при исследовании показателей, характеризующих окислительно-восстановительные процессы в плазме крови как больных СД 2 типа, так и больных ИБС было достоверно увеличено количество окисленного глутатиона и продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, что свидетельствует о развитии окислительного стресса. Подтверждением нарушения функционального состояния МПО явилось также отсутствие достоверной корреляционной зависимости между активностью и содержанием МПО в плазме крови как больных СД 2 типа, так и ИБС, что иллюстрируют фиг.2 и 3.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить информативность, точность и расширить диагностические возможности по сравнению с существующим способом, благодаря одновременной регистрации и количества, и активности МПО.

Источники информации

1. Sokolov A.V., Ageeva K.V., Pulina M.O. et al. Free Rad. Res. 2008. V.42. P.989-998.

2. Панасенко О.М., Чеканов А.В., Власова И.И. и др. Влияние церулоплазмина и лактоферрина на хлорирующую активность лейкоцитарной миелопероксидазы. Изучение методом хемилюминесценции. // Биофизика. 2008. Т.53. №5. С.573-581.

3. Власова И.И., Арнхольд Ю., Осипов А.Н., Панасенко О.М. рН-Зависимая регуляция активности миелопероксидазы. // Биохимия. 2006. Т.71. С.825-837.

4. Zhang R., Brennan M.-L., Fu X. et al. JAMA. 2001. V.286. P.2136-2142.

5. Baskol G., Demir H., Baskol M. et al. 2006. V.24. P.307-311.

6. Патент BY №13675, G01N 33/48, 30.10.2010.

Способ определения функционального состояния миелопероксидазы в плазме крови, включающий внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода в концентрации 100-200 мкМ, определение пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере с pH 4,5, отличающийся тем, что дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител крыс против миелопероксидазы, последующего добавления образцов плазмы и стандарта миелопероксидазы, затем добавляют антитела кроликов против миелопероксидазы и конъюгированные с пероксидазой хрена антитела коз против IgG кролика, количество миелопероксидазы в образцах плазмы определяют, сравнивая интенсивность развития хромогенной реакции в лунках со стандартом, далее вычисляют коэффициент удельной активации миелопероксидазы Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации, и при значениях коэффициента удельной активности миелопероксидазы выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния миелопероксидазы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики септических осложнений у человека или других животных с множественной травмой, в котором указанные пациенты не имеют травматического повреждения головного мозга.

Изобретение относится к медицине и касается набора для определения целевого полипептида, выбранного из группы A 42, A 40 и их смеси. .
Изобретение относится к медицине, в частности к неотложной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования течения послеоперационного периода прободной язвы двенадцатиперстной кишки.
Изобретение относится к области медицины, а именно хирургии, и описывает способ диагностики послеоперационного перитонита путем биохимического исследования сыворотки крови, где в сыворотке крови и перитонеальном экссудате послеоперационных больных определяют уровень ферритина, 100 нг/мл которого принимают за 1 балл, затем баллы ферритина в экссудате и сыворотке суммируют, определяют суммарный индекс ферритина и при его повышении более 12 баллов диагностируют развитие послеоперационного перитонита.
Изобретение относится к практической медицине, а именно клинико-лабораторной диагностике, и касается способа прогнозирования развития бронхолегочных осложнений при шейно-спинальной травме.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу определения фармакологической активности гомеопатического лекарственного средства. .

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования эффективности иммуносупрессивной терапии хронического гломерулонефрита с нефротическим синдромом.
Изобретение относится к эндокринологии, иммунологии и предназначено для прогнозирования риска развития ожирения у практически здоровых людей. .

Изобретение относится к способам, связанным с функцией ЦНС и заболеваниями ЦНС, и касается способа идентификации антагониста PirB/LILRB, включающего контактирование исследуемого агента с рецепторным комплексом, который включает PirB/LILRB и миелин или миелин-ассоциированный белок, или его фрагмент, и детекцию способности исследуемого агента ингибировать взаимодействие между PirB/LILRB и миелин-ассоциированным белком или его фрагментом.

Изобретение относится к таким иммуногенным и вакцинным композициям, которые пригодны для использования у различных животных (мишеневых или хозяев) видов, восприимчивых к заболеванию, вызванному BTV, включая, но не ограничиваясь, млекопитающих, рептилий, птиц, в особенности людей, парных млекопитающих или животных, таких как, но не ограничиваясь, собак, кошек, лошадей, млекопитающих из зоопарков или животных, таких как морские млекопитающие, напр., тюлени, кошки, лошади, зоопарковые рептилии, такие как змеи, крокодилы, аллигаторы, и птичьи виды.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии

Изобретение относится к новым соединениям формулы II, которые имеют значения радикалов и символов, определенные в формуле изобретения

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано в качестве одного из диагностических критериев в оценке степени тяжести и прогноза больных с острым панкреатитом
Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии
Изобретение относится к области медицины

Изобретение относится к области медицины, а именно медицинской иммунологии
Наверх