Хладоограждающий раствор для замораживания ядерных клеток крови


 

A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2464991:

Учреждение Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН (RU)
Федеральное государственное учреждение "Кировский Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине и касается создания раствора для консервирования ядерных клеток крови при субумеренно низкой температуре и сохранения их в физиологически активном состоянии после отогрева. Раствор содержит глицерин, комаруман и трилон Б. Соотношение ингредиентов: глицерин 6,0%, комаруман 0,35-0,15%, трилон Б 0,1%, вода для инъекций до 100 мл. Его рН составляет 7,0-7,4. Смешивание лейкоконцентрата 1:1 с данным раствором, замораживание до -20°С, хранение при данной температуре в течение одних суток и отогрев позволяют сохранить 75,5±2,9% жизнеспособных лейкоцитов и 70,0±6,9% физиологически полноценных нейтрофильных клеток, 82,8±7,7% из которых способны к фагоцитозу. Использование заявленного хладоограждающего раствора обеспечивает сохранность высокого процента активных ядерных клеток крови. 3 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования лейкоцитов, в частности, человека.

В качестве прототипа нами использована работа Н.Н.Абезгауза и В.А.Леонтовича «Замораживание белых клеток периферической крови для их длительного хранения при ультранизких температурах» (ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1966. - №9. - С.24-29). Существенным недостатком прототипа является то, что предложенный его авторами ограждающий раствор содержит глицерин в 15% концентрации и после отогрева требует отмывания, что дополнительно травмирует высокочувствительные к разного рода повреждающим факторам ядерные клетки крови. Кроме того, взамен используемого в прототипе дисахарида сахарозы нами применен полисахарид комаруман, обладающий рядом положительных эффектов в отношении лейкоцитов: экзоцеллюлярным, иммуномодулирующим и противовоспалительным.

С целью консервирования лейкоцитов при субумеренно низкой температуре в учреждениях криобиологического и медицинского профиля, обеспеченных электроморозильниками на -20°С, в предложенный протекторный раствор включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - комаруман, 1) обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -20°С выраженный криобиологический (технический) эффект и 2) оказывающий иммуномодулирующие и противовоспалительное действие на лейкоциты (Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Antiinflammatory acrivity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre L. // Fitoterapia. 2005. Vol.76, №3-4. P.281-287; Попов С.В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов: Автореф. дис. док. биол. наук; Сыктывкар, 2010. - 37 с.), поэтому включение комарумана в криоконсервант усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 70% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев - Наукова думка, 1978. - с.5-64), используется в нетоксичной для клеток концентрации, поэтому не требует отмывания перед применением; антикоагулянт - трилон Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), имеющий широкое применение в производстве медицинских препаратов и при консервировании.

Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.

Пример использования средства

Консервирующий раствор, содержащий глицерин в концентрации 6%, комаруман - 0,25%, трилон Б - 0,1%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре, охлаждают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-литровой ванне с этиловым 96% спиртом до -20°С в течение 9-14 минут. Затем замороженный лейкоконцентрат переносят в камеру электроморозильника, имеющую температуру -20°С. Термограмму записывают по термопаре, введенной в контейнер «Компопласт» с хладоограждающим раствором, в конечной концентрации. Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35-50 секунд при покачивании контейнера 3-4 раза в сек. Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - №9. - С.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов консерванта представлен в таблице 1.

Таблица 1
Номер варианта криоконсерванта Состав хладоограждающего раствора
Комаруман в % Глицерин в % Трилон Б в % Вода для инъекций в мл
1 0,35 6,0 0,1 До 100
2 0,25 6,0 0,1 До 100
3 0,15 6,0 0,1 До 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта №1, №2 и №3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

Таблица 2
Номер варианта криоконсерванта Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесью
Комаруман в % Глицерин в % Трилон Б в % Вода для инъекций в мл
1 0,175 3,0 0,05 До 200
2 0,125 3,0 0,05 До 200
3 0,075 3,0 0,05 До 200

Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (таблица 3).

Таблица 3
Вариант консервирующего раствора Показатели в % к исходному уровню
Жизнеспособность лейкоцитов Морфологическая сохранность гранулоцитов Фагоцитарная активность нейтрофилов
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора 76,8±4,9 (n=5) 67,0±7,4 (n=5) 61,2±4,6*(n=5)
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора 75,5±2,9 (n=6) 70,0±6,9 (n=6) 82,8±7,7 (n=6)
Нижний предел дозировок ингредиентов раствора 36,0±4,1*(n=5) 34,4±3,5*(n=5) 19,2±2,3*(n=5)
* - различие достоверное (р<0,05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения-отогрева при использовании криоконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.

Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН=7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при замораживании лейкоцитов до -20°С.

Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -20°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных ядерных клеток крови. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.

Хладоограждающий раствор для замораживания ядерных клеток крови, содержащий глицерин, комаруман, трилон Б и воду для инъекций при рН раствора 7,0-7,4 и следующем соотношении ингредиентов, %:

Глицерин 6,0
Комаруман 0,35-0,15
Трилон Б 0,1
Вода для инъекций До 100 мл


 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и представляет собой способ получения резорбируемой полилактидной матрицы для культивирования и имплантации клеток, предназначенных для заживления ран, включающий получение резорбируемой гидрофильной пористой полилактидной матрицы, равномерно покрытой микрофибриллярным коллагеном 1-го типа, для чего предварительно получают гидрофильную пористую полилактидную матрицу толщиной от 13 мкм до 15 мкм и диаметром пор от 2 мкм до 3 мкм, затем проводят нанесение на гидрофильную пористую полилактидную матрицу 0,01%-ного раствора коллагена 1-го типа в 0,1%-ной уксусной кислоте, инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре, далее поверхность матрицы промывают фосфатно-солевым буфером рН 7,4 для удаления несвязавшегося с субстратом белка, процедуру нанесения раствора коллагена 1-го типа проводят еще 2 раза, гидрофильную поверхность пористой полилактидной матрицы, равномерно покрытую микрофибриллярными структурами коллагена диаметром от 10 нм до 20 нм, используют для культивирования кератиноцитов человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, физиотерапии, курортологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, физиотерапии, курортологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для герметизации межкишечного анастомоза. .
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и кардиохирургии, и может быть использовано при лечении диффузного поражения миокарда. .
Изобретение относится к ветеринарной медицине. .

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии и хирургии, и касается оценки состояния больного после переливания эритроцитарной массы при критических состояниях.
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинскому образованию, и может быть использовано для определения группы крови с использованием смесей, имитирующих цельную кровь и диагностические сыворотки, для обучения студентов методике определения крови по системе АВ0.

Изобретение относится к области фармакологии и представляет собой лекарственное средство для лечения фибромиалгии, включающее пилокарпин или гидрохлорид пилокарпина и фармацевтически приемлемый носитель, в котором ежедневная доза пилокарпина или гидрохлорида пилокарпина составляет от 0,1 мг до 1000 мг.
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной и клинической хирургии и трансплантологии. .
Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине. .

Изобретение относится к медицине. .
Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии грыж, и может быть использовано для подготовки аутотрансплантата для герниопластики
Наверх