Способ восстановления переэтерификационной активности липазы и способ переэтерификации

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ восстановления переэтерификационной активности липазы, полученной из Thermomyces sp. и иммобилизованной на носителе, или липазной порошковой смеси, которая содержит вспомогательный фильтрующий материал и липазу, полученную из Thermomyces sp. и иммобилизованную на носителе. При этом липазную порошковую смесь измельчают до среднего размера частиц от 1 мкм до 300 мкм. Способ осуществляют путем промывания указанной липазы или липазной порошковой смеси триацилглицерином. Также предложен способ переэтерификации. Проводят реакцию переэтерификации с использованием вышеуказанной липазы или липазной порошковой смеси. Затем осуществляют отделение липазы или липазной порошковой смеси от реакционной системы и ее промывание триацилглицерином для восстановления переэтерификационной активности. Затем снова проводят реакции переэтерификации с использованием восстановленной липазы или липазной порошковой смеси. Способ позволяет эффективно восстанавливать сниженную переэтерификационную активность липазы или липазной порошковой смеси и повторно использовать их в реакции переэтерификации. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам восстановления липазной активности, такой как способности конкретной иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси вступать в различные реакции этерификации или переэтерификации. Настоящее изобретение также относится к реакциям этерификации или способам переэтерификации масел и жиров, где применяется иммобилизованная липаза или липазная порошковая смесь.

Уровень техники

Липаза широко применяется в реакциях этерификации между различными карбоновыми кислотами, такими как жирные кислоты, и спиртами, такими как одноатомные и многоатомные спирты; или в реакции переэтерификации сложных эфиров карбоновых кислот. В том числе, реакция переэтерификации является важной технологией для модификации животных и растительных жиров и для производства эфиров различных жирных кислот, эфиров сахаров и стероидов. Когда липаза, которая является гидролазой жиров и масел, используется в качестве катализатора этих реакций, реакция переэтерификации может быть проведена в мягких условиях от комнатной температуры до примерно 70°С. Таким образом, по сравнению со стандартными химическими реакциями, липаза не только ингибирует побочные реакции и снижает энергетические затраты, но и имеет высокий уровень безопасности, поскольку липаза как катализатор является натуральным продуктом. Далее, целевые соединения могут эффективно производиться благодаря их позиционной и субстратной специфичности. Однако, хотя липазный порошок используется непосредственно в реакции переэтерификации, активность липазы проявляется не полностью. Кроме того, сложно равномерно диспергировать липазу, которая в основном растворима в воде, в сыром субстрате на масляной основе, и также сложно собрать ее. Таким образом, обычно липазу иммобилизуют на определенном носителе, таком как анионообменная смола (Патентный документ 1), фенолабсорбирующая смола (Патентный документ 2), гидрофобный носитель (Патентный документ 3), катионообменная смола (Патентный документ 4) и хелатирующая смола (Патентный документ 5), и используется в реакции этерификации или переэтерификации.

Однако так как при иммобилизации липазы на носителе ее липазная активность снижается, были разработаны различные технологии с применением липазного порошка.

В частности, предложен способ, который включает стадии диспергирования липазного порошка в сыром субстрате, содержащем эфир(ы) в присутствии или отсутствие неактивного органического растворителя, где в реакции переэтерификации от 90% частиц диспергированного липазного порошка имеют размер от 1 до 100 мкм; и затем проведения реакции переэтерификации (Патентный документ 6). Далее также предлагается использовать ферментный порошок, полученный в результате высушивания ферментной суспензии, содержащей фосфолипид(ы) и жирорастворимый(е) витамин(ы) (Патентный документ 7).

В то же время, так как липаза, которая является ферментом, стоит дорого, после завершения реакции ее собирают и используют повторно, и выбрасывают тогда, когда происходит значительное снижение липазной активности. Однако если сниженная липазная активность может быть восстановлена, практичность использования липаз значительно увеличится. Поэтому, с точки зрения промышленного производства, создание эффективного способа восстановления липазной активности имеет большой практический интерес.

Патентный документ 1: JP-A60-98984

Патентный документ 2: JP-A61-202688

Патентный документ 3: JP-A2-138986

Патентный документ 4: JP-A3-61485

Патентный документ 5: JP-A1-262795

Патентный документ 6: JP-B2668187

Патентный документ 7: JP-A2000-106873

Сущность изобретения

Цель данного изобретения - предоставить способы восстановления сниженной липазной активности.

Следующая цель настоящего изобретения - предоставить способы этерификации или способы переэтерификации, каждый из которых включает стадию использования иммобилизированной липазы или липазной порошковой смеси, каждая из которых имеет восстановленную липазную активность.

Настоящее изобретение было выполнено на основании выявления того факта, что исходная липазная активность иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси, которая содержит измельченный продукт из иммобилизованной липазы и вспомогательного фильтрующего материала, может быть восстановлена путем промывания указанных липаз или липазных порошковых смесей со сниженной активностью триацилглицерином.

В частности, настоящее изобретение предоставляет способ восстановления липазной активности, включающий стадии использования липазы, полученной из Thermomyces sp. и иммобилизованной на носителе, или липазной порошковой смеси, которая содержит вспомогательный фильтрующий материал и липазу, полученную из Thermomyces sp. и иммобилизованную на носителе, измельченной до среднего размера частиц от 1 мкм и более до менее чем 300 мкм в реакции этерификации или переэтерификации; и промывании указанной липазы или липазной порошковой смеси с триацилглицерином.

Настоящее изобретение также предоставляет способ этерификации или переэтерификации, включающий стадии использования липазы, полученной из Thermomyces sp. и иммобилизованной на носителе или липазной порошковой смеси, которая содержит вспомогательный фильтрующий материал и липазу, полученную из Thermomyces sp. и иммобилизованную на носителе, измельченной до среднего размера частиц от 1 мкм и более до менее чем 300 мкм в реакции этерификации или переэтерификации; отделения липазы или липазной порошковой смеси от реакционной системы и промывании их триацилглицерином для восстановления их липазной активности; и затем проведения реакции этерификации или переэтерификации с использованием полученной иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует снижение переэтерификационной активности во времени при использовании липазной порошковой смеси в реакции переэтерификации (Пример 1(3)).

Фиг.2 иллюстрирует, что, в соответствии с настоящим изобретением, при отмывании липазной порошковой смеси, переэтерификационная активность которой была снижена, происходит восстановление ее переэтерификационной активности (Пример 1(4)).

Фиг.3 иллюстрирует, что, в соответствии с настоящим изобретением, при отмывании иммобилизованной липазы, переэтерификационная активность которой была снижена, происходит восстановление ее переэтерификационной активности (Пример 3(3-2)).

Лучший вариант осуществления изобретения

Липаза, применяемая в настоящем изобретении, была получена из Thermomyces sp. и иммобилизована на носителе, предпочтительно на носителе из диоксида кремния. В настоящем изобретении можно применять непосредственно указанную липазу или использовать указанную липазу, которая измельчена до среднего размера частиц от 1 мкм и более до менее чем 300 мкм. В частности, предпочтительно, чтобы липаза, иммобилизованная на носителе из диоксида кремния с размером частиц примерно от 300 до 1000 мкм, была измельчена до среднего размера частиц от 1 мкм до 300 мкм. Такая иммобилизованная липаза может быть получена, к примеру, от компании Novozymes A/S, которая производит продукт Lipozyme TL-IM.

При измельчении такой иммобилизованной липазы предпочтительно использовать стандартные мельницы и измельчать ее до среднего размера частиц от 1 мкм и более до менее чем 300 мкм, предпочтительно от 1 мкм до 200 мкм, предпочтительнее от 1 мкм до 100 мкм и в особенности предпочтительно от 20 мкм до 100 мкм. Примеры мельницы включают ступку, стержневую барабанную мельницу, фрезеровочную мельницу, жернов (Mycolloider, Masscolloider), кофейную мельницу, электрическую мельницу, штифтовую мельницу, ударную мельницу (молотковую мельницу или шаровую мельницу), вальцовую мельницу, электрическую мельницу, гомогенизатор и ультразвуковую мельницу.

Когда липаза, использованная в данном изобретении, является продуктом вышеуказанного измельчения, предпочтительно использовать ее в сочетании со вспомогательным фильтрующим материалом. Примеры вспомогательного фильтрующего материала включают неорганические фильтрующие материалы, такие как целит и органические вспомогательные фильтрующие материалы, такие как волокна, к примеру, целлюлоза, и их измельченные продукты. Среди них предпочтительны органические вспомогательные фильтрующие материалы, особенно предпочтительны органические полимерные вспомогательные фильтрующие материалы, в особенности предпочтительны целлюлоза и подобные ей материалы. Предпочтительные примеры таковых включают торговую марку: KC Flock, производимую Nippon paper Chemicals Co., Ltd. Предпочтительно, чтобы фильтрующий материал также был в порошковой форме и имел средний размер частиц от 10 до 90 мкм.

Предпочтительное массовое соотношение описанного выше продукта измельчения липазы к вспомогательному фильтрующему материалу составляет от 1/10 до 10/1 и в особенности предпочтительно соотношение от 1/7 до 2/1.

Хотя описанная выше иммобилизованная липаза или липазная порошковая смесь, применяемая в настоящем изобретении, могут применяться непосредственно в этерификации или переэтерификации масел и жиров, они могут быть очищены при взаимодействии их с триглицеридами жирных кислот с длинной цепью и триглицеридами жирных кислот со средней длиной цепи; после чего их можно отделить. В то же время возможно увеличить их липазную активность.

Поскольку здесь используются триглицерид жирных кислот с длинной цепью и триглицерид жирных кислот со средней длиной цепи для промывания иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси предпочтительно использовать те из них, которые указаны в следующем разделе.

Предпочтительно использование триглицерида жирных кислот с длинной цепью и триглицерида жирных кислот со средней длиной цепи в массовом соотношении от 95:5 до 50:50 и предпочтительно добавлять от 2 до 100 масс триглицерида на общую массу липазы.

Реакция этерификации, использующая липазу или липазную порошковую смесь, в предпочтительном воплощении представляет собой способ, включающий стадии этерификации жиров и масел в присутствии иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси; затем сбор иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси и их повторное использование.

В особенности, поскольку липазная активность и пригодность для реакции этерификации и переэтерификации вышеуказанной липазной порошковой смеси восстанавливается достаточно для ее переработки и повторного использования в реакциях, можно соответствующим образом использовать смесь в модификации жиров и масел в промышленном масштабе путем их переэтерификации.

Однако при повторяющейся переработке и использовании такой липазной порошковой смеси или иммобилизованной липазы в реакции этерификации или переэтерификации, их липазная активность, такая как способность к этерификации и переэтерификации, снижается в зависимости от кратности использования.

Настоящее изобретение делает возможным увеличение липазной активности такой иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси, липазная активность каждой из которых снижена, при промывании в специальных условиях, и для липазной порошковой смеси долгое время сохраняются повышенная липазная активность и возможность многократного использования.

В настоящем изобретении иммобилизованная липаза или липазная порошковая смесь, каждая из которых имеет сниженную липазную активность, может включать и такие, где исходная липазная активность даже немного снижена. Однако с точки зрения промышленного использования, предпочтительно выбирать такие липазы, исходная активность которых (100%) снижена до уровня от 70% до 50%.

Между тем, предпочтительно, чтобы триацилглицерин, используемый для промывания иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси, находился в жидком состоянии при комнатной температуре. Особенно предпочтительно использовать смесь триглицерида жирных кислот с длинной цепью и триглицерида жирных кислот со средней длиной цепи, каждый из которых используется для очистки липазной порошковой смеси.

Если используется триглицерид жирных кислот с длинной цепью, предпочтительно, чтобы остаток жирной кислоты такого триглицерида содержал от 14 до 24 атомов углерода, также наиболее предпочтительно, чтобы растительное масло было выбрано из группы, состоящей из канолового масла, соевого масла, подсолнечного масла, сафлорового масла и кукурузного масла.

Для триглицерида жирных кислот со средней длиной цепи предпочтительно, чтобы остаток жирной кислоты такого триглицерида содержал от 6 до 12 атомов углерода. Такие триглицериды жирных кислот можно получить общеизвестным способом или использовать для этих целей продукт, доступный на рынке. Примеры торговых марок продуктов, доступных на рынке, включают ODO, производимый The Nisshin OilliO Group, Ltd.

Предпочтительно использование триглицерида жирных кислот с длинной цепью и триглицерида жирных кислот со средней длиной цепи, в массовом соотношении от 95:5 до 50:50 и лучше добавлять от 2 до 100 масс. триглицерида на общую массу липазы, наиболее предпочтительно от 5 до 50 масс. триглицерида на общую массу липазы.

В частности, триацилглицерин, используемый для промывания, и предпочтительно является сырым маслом для переэтерификации.

Предпочтительно, чтобы иммобилизованная липаза или липазная порошковая смесь промывалась так, что вышеописанная липаза или липаза в липазной смеси могла в достаточной мере контактировать с описанным выше триацилглицерином. В частности, предпочтительно производить промывание с перемешиванием и диспергированием иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси, используемой в реакции этерификации или переэтерификации в триацилглицерине; и отделения их от триацилглицерина.

Контактирование, более конкретно перемешивание, предпочтительно проводить при температуре от 10 до 45°С, в особенности предпочтительно при комнатной температуре; предпочтительно от 2 часов или более, более предпочтительно в течение 10 часов или более, в особенности предпочтительно от 12 до 48 часов. При желании можно проводить ее от 48 часов и более. Выбор мешалки для перемешивания особенно не ограничен, и предпочтительно использовать пропеллерную мешалку, магнитную мешалку, трехфазный двигатель или подобные устройства.

Таким образом, иммобилизованная липаза или липазная порошковая смесь в достаточной мере контактирует с триацилглицерином; отфильтровывается обычным способом для отделения иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси от триацилглицерина; и затем снова используется в реакции этерификации или переэтерификации.

До настоящего времени липаза, липазная активность которой была снижена вследствие участия ее в различных реакциях, выбрасывалась. Однако по способу настоящего изобретения, так как липазная активность может быть восстановлена, продолжительность применения липазы может быть увеличена и стоимость продуктов, производимых с помощью липазы, может быть уменьшена. Таким образом, с точки зрения промышленного применения настоящее изобретение имеет много преимуществ.

Следующие примеры раскрывают настоящее изобретение.

Пример 1

(1) 1 кг Lypozyme TL-IM фирмы Novozymes A/S со средним размером частиц 800 мкм измельчали с помощью штифтовой мельницы (тонкая ударная мельница 100 UPZ) компании Hosokawa Micron Corporation при 17600 об/мин. Размер частиц измельченной липазы измеряли с помощью анализатора распределения размера частиц LA-500 фирмы Horiba, Ltd., и средний размер этих частиц был равен 13,8 мкм. Для приготовления липазной порошковой смеси к липазному порошку в качестве вспомогательного фильтрующего материала добавляли 1 кг целлюлозного порошка фирмы Nippon Paper Chemicals, Co., Ltd. со средним размером частиц 30 мкм.

(2) 90 г обесцвеченного канолового масла и 10 г ODO (триглицерид среднецепочечной жирной кислоты) компании Nisshin OilliO Group, Ltd. добавляли к 5 г полученной таким образом липазной смеси и перемешивали 24 часа при комнатной температуре. После этого смесь отфильтровывали для отбора липазной смеси. Затем с помощью следующего метода измеряли переэтерификационную активность этой липазной смеси, и ее относительная активность оказалась равной 714, если принять активность Lypozyme TL-IM перед измельчением за 100.

Метод измерения липазной активности

Липазную смесь добавляли к маслу, в котором триолеин и трикаприлин находились в соотношении 1:1 (по объему), и осуществляли реакцию при 60°С. По прошествии времени в качестве пробы отбирали 10 мкл реакционной смеси, разбавляли в 1,5 мл гексана и затем раствор, где была отфильтрована липазная смесь, брали в качестве пробы для газовой хроматографии (ГХ). Раствор анализировался с помощью газовой хроматографии (колонка DB-1ht), и скорость реакции рассчитывали по следующей формуле. Условия ГХ: исходная температура колонки 150°С, подъем температуры на 15°С/мин и конечная температура 370°С.

Скорость реакции (%)={площадь С34/(площадь С24+площадь С34)}×100, где С24 - это трикаприлин; С34 - это трикаприлин, где одна жирная кислота заменена на олеиновую; и площадь - это площадь каждого из них. На основании скорости реакции в каждый момент времени с помощью аналитического программного обеспечения (Origin ver. 6.1) была рассчитана константа скорости реакции k.

Активность липазы была представлена через относительную активность, принимая k для Lipozyme TL-IM равным 100.

(3) 1 масс.% липазной смеси, полученной выше в (2), добавляли к 85 г обесцвеченного канолового масла фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и 15 г ODO фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd., и для проведения реакции переэтерификации перемешивали 19 часов при 60°С. По прошествии времени рассчитывали скорость переэтерификации и подтверждали прохождение реакции. Для реакции переэтерификации с помощью газовой хроматографии был проанализирован состав триглицеридов, также было рассчитано пропорциональное отношение реагирующего вещества реакции переэтерификации в измеренной пробе.

После завершения реакции липазная смесь была отфильтрована и собрана, и собранная липазная смесь повторно использовалась в реакции переэтерификации. В дальнейшем реакция проводилась еще несколько раз. Изменение скорости реакции, представленное в виде относительной скорости, показано на фиг.1.

По результатам фиг.1 стало понятным, что когда общее время реакции достигает 82 часов, липазная активность липазной смеси снижается примерно до 60%.

(4) Липазная смесь, описанная в (3), липазная активность которой снизилась примерно до 60%, была отфильтрована и собрана. Собранную таким образом липазную смесь добавляли к 18 г обесцвеченного канолового масла фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и 2 г ODO фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и перемешивали с помощью магнитной мешалки 24 часа при комнатной температуре. После того как липазная смесь была собрана путем фильтрации, была повторно проведена реакция переэтерификации, как указано в (3). Изменение скорости реакции, представленное в виде относительной скорости, показано на фиг.2.

По результатам фиг.2 стало понятным, что липазная активность восстанавливается до исходной активности в 100% при промывании с перемешиванием липазной смеси со сниженной липазной активностью и что такая липазная смесь может быть переработана и использована большое количество раз.

Пример 2

(2-1) 90 г обесцвеченного канолового масла и 10 г ODO фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. добавляли к 5 г липазной смеси, полученной в (1) примера 1, и перемешивали 2 часа при 60°С. Затем, чтобы собрать липазную смесь, смесь отфильтровывали. Переэтерификационную активность этой липазной смеси измеряли тем же способом, что и в примере 1, и она была равна 557.

(2-2) 1,2 масс.% липазной смеси, полученной выше в (2-1), добавляли к 100 г соевого масла и 25 г полностью гидрированного соевого масла фирмы Yokozeki Fat & Oil Corporation и перемешивали 120 часов при 70°С. Затем липазную смесь собирали с помощью фильтрации. Липазную активность части собранной липазной смеси измеряли тем же способом, что и в примере 1 (2-2а). Предварительно собранная липазная смесь была диспергирована в ацетоне и профильтрована. Ее осадок на фильтре был снова собран и диспергирован в 50 г масла, смешанного в соотношении обесцвеченное каноловое масло: ODO фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd.=9:1 (по массе). Затем смесь была отфильтрована для ее промывания и замены, и была собрана липазная смесь. Переэтерификационная активность этой липазной смеси была измерена тем же способом, что и в примере 1(2-2b). Каждая полученная активность была отражена в относительных единицах в таблице 1.

Таблица 1
	Относительная липазная активность в расчете на массу липазного препарата
Перед измельчением (TL-IM)	100
(2-1)	557
(2-2a)	11
(2-2b)	200

Пример 3

5 масс.% Lypozyme TL-IM(иммобилизованная липаза) фирмы Novozymes A/S добавляли к 85 г обесцвеченного канолового масла фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и 15 г ODO фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и перемешивали 19 часов при 60°С для проведения реакции переэтерификации. По прошествии времени рассчитывалась скорость переэтерификации и подтверждалось прохождение реакции. Для реакции переэтерификации с помощью газовой хроматографии был проанализирован состав триглицеридов, также было рассчитано пропорциональное отношение реагирующего вещества реакции переэтерификации в измеренной пробе.

После окончания реакции вышеописанная иммобилизованная липаза была отфильтрована и собрана, и собранная иммобилизованная липаза была повторно использована в реакции переэтерификации.

В дальнейшем реакция проводилась еще несколько раз. Изменение скорости реакции, представленное в виде относительной скорости, показано на фиг.3 (3-1).

Вышеописанная иммобилизованная липаза, липазная активность которой снизилась примерно до 60%, была отфильтрована и собрана. Собранная таким образом иммобилизованная липаза была добавлена к 18 г обесцвеченного канолового масла фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и 2 г ODO фирмы Nisshin OilliO Group, Ltd. и перемешивалась с помощью магнитной мешалки 24 часа при комнатной температуре. Затем путем фильтрации иммобилизованная липаза была собрана, и как указано в (3-1), была повторно проведена реакция переэтерификации. Изменение скорости реакции во времени, представленное в виде относительной скорости, показано на фиг.3 (3-2).

1. Способ восстановления переэтерификационной активности липазы, полученной из Thermomyces sp. и иммобилизованной на носителе, или липазной порошковой смеси, которая содержит вспомогательный фильтрующий материал и липазу, полученную из Thermomyces sp. и иммобилизованную на носителе, измельченной до среднего размера частиц от 1 мкм до 300 мкм, путем промывания указанной липазы или липазной порошковой смеси триацилглицерином.

2. Способ по п.1, где триацилглицерин находится в жидком состоянии при комнатной температуре.

3. Способ по п.1, в котором триацилглицерин включает триглицерид(ы) жирных кислот со средней длиной цепи.

4. Способ по любому из пп.1-3, где триацилглицерин представляет собой сырое масло для переэтерификации.

5. Способ по любому из пп.1-3, где промывание проводят с помощью стадий перемешивания и диспергирования иммобилизованной липазы или липазной порошковой смеси, используемой в реакции переэтерификации, в триацилглицерине; и отделения липазы или липазной порошковой смеси от триацилглицерина.

6. Способ по любому из пп.1-3, где носителем является диоксид кремния.

7. Способ по любому из пп.1-3, где средний размер частиц измельченного носителя с иммобилизованной липазой составляет от 1 до 200 мкм.

8. Способ по любому из пп.1-3, где вспомогательным фильтрующим материалом является целлюлоза.

9. Способ по любому из пп.1-3, где вспомогательный фильтрующий материал находится в форме порошка, средний размер частиц которого составляет от 10 до 90 мкм.

10. Способ переэтерификации, включающий стадии использования липазы, полученной из Thermomyces sp. и иммобилизованной на носителе, или липазной порошковой смеси, которая содержит вспомогательный фильтрующий материал и липазу, полученную из Thermomyces sp. и иммобилизованную на носителе, измельченной до среднего размера частиц от 1 мкм до 300 мкм, в реакции переэтерификации; отделения липазы или липазной порошковой смеси от реакционной системы и промывание ее триацилглицерином для восстановления ее переэтерификационной активности; и затем проведение реакции переэтерификации с использованием полученной липазы или липазной порошковой смеси.